紫草多糖脂質(zhì)體的制備及其評價

齊和日瑪，蘇日娜，成日青，塔娜，李慧聰，薩仁高娃（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)民族醫(yī)藥創(chuàng)新中心，呼和浩特 000）

紫草為中醫(yī)和蒙醫(yī)常用藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為紫草科軟紫草屬植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.和內(nèi)蒙紫草Arnebia guttataBunge 的干燥根，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷[1]。紫草中含有萘醌類、單萜苯醌、苯酚類、酚酸類以及多糖類多種具有生物活性的成分[2]。多糖是一類非特異性的免疫作用增強化合物，能提高機體的免疫功能，具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血糖及降血脂等功效，受到了越來越多的研究者的關(guān)注。已有研究表明紫草多糖具有多種免疫增強功能，有明顯地抑制單純性皰疹病毒、非特異性抗炎的作用[3-4]。

目前大部分傳統(tǒng)中藥多糖制劑存在穩(wěn)定性差、生物利用度低、易被降解及對細胞穿透力弱等缺點，影響了多糖藥效的發(fā)揮。脂質(zhì)體是由兩親性的磷脂或其他材料構(gòu)建的雙層囊泡，是重要的納米載體之一，其結(jié)構(gòu)與生物膜相似。脂質(zhì)體可提高藥物的生物利用度，減少藥物的不利影響，同時具有低毒性、緩釋作用、改善穩(wěn)定性等優(yōu)點[5]。本試驗制備了紫草多糖脂質(zhì)體，優(yōu)化了其處方工藝，并對該制劑的質(zhì)量進行了評價，以期提高紫草多糖的生物利用度及治療效果，降低使用劑量，為紫草多糖新劑型的研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

紫草多糖（自制[6]，純度大于90%），卵磷脂（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：R005468），膽固醇（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：R008055），葡萄糖對照品（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20120728，供含量測定用），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

TG16.6 型高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；BSA124S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；U-1901 紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SHB-IV 雙A 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫草多糖脂質(zhì)體的制備

采用逆向蒸發(fā)法[7]，精密稱取適量卵磷脂、膽固醇，溶于10 mL 氯仿，超聲使其完全溶解。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至圓底燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻薄膜，加入10 mL 乙醚將薄膜溶解，加入適量紫草多糖質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL－1的溶液（用pH 為7.4 的硫酸鹽緩沖溶液配制），混勻，減壓蒸發(fā)至乙醚揮發(fā)完全，即得紫草多糖脂質(zhì)體混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩？瞻字|(zhì)體除不加紫草多糖外，其他條件同上。

2.2 檢測波長的確定

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg，置100 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，從中吸取10 mL 置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得0.1 mg·mL－1的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，加入5 mL 濃硫酸，混勻，沸水浴中加熱25 min，取出后冰水浴中冷卻5 min。另精密取蒸餾水2 mL，同法操作作為空白對照，200 ～800 nm 進行掃描，結(jié)果在485 nm 處出現(xiàn)最大的吸收峰，空白脂質(zhì)體在此處無吸收，故選擇檢測波長為485 nm。

2.3 脂質(zhì)體包封率的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 精密量取“2.2”項下的對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分別置試管中，加蒸餾水至1 mL，再加5%的苯酚溶液1 mL，混勻，加濃硫酸5 mL，搖勻，置于沸水浴25 min，取出放置冰水浴5 min。另精密取蒸餾水2 mL，同法操作作為空白對照，在485 nm 處測定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖濃度（c）為橫坐標，得回歸方程A＝0.0105c－0.1783（R2＝0.9995），結(jié)果表明葡萄糖在21.4 ～107.1 μg·mL－1與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密量取同一質(zhì)量濃度紫草多糖溶液1.0 mL，按上述方法進行顯色，在485 nm 處測定其吸光度，平行測定6 次，結(jié)果吸光度值RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一質(zhì)量濃度紫草多糖溶液1.0 mL，按上述方法進行顯色，分別在0、30、60、90、120、160、180 min 于485 nm處測定吸光度，結(jié)果吸光度值RSD為2.0%，表明供試液在顯色后的3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收試驗 精密稱取葡萄糖對照品溶液，分別配制成高、中、低（0.10、0.05、0.03 mg·mL－1）3 個不同質(zhì)量濃度，加入適量空白脂質(zhì)體，于485 nm 處測定其吸光度值。結(jié)果高、中、低質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為96.38%、95.86%、97.16%，RSD值分別為1.1%、0.29%、0.35%。

2.3.5 包封率的測定 采用超速離心法測定[8]：吸取0.2 mL 脂質(zhì)體至超速離心管中，以8000 r·min－1超速離心30 min，吸取上清液0.1 mL，在485 nm 處測定其吸光度，計算游離多糖的濃度。另取0.2 mL 脂質(zhì)體，破乳，測定脂質(zhì)體中多糖總量，按下式計算包封率（EE）：EE（%）＝（1－cf/ct）×100%，式中cf為游離藥物的量，ct為脂質(zhì)體中藥物的總量。

2.4 紫草多糖脂質(zhì)體處方的單因素考察

2.4.1 藥物與卵磷脂比（藥脂比）考察 固定處方中膽固醇用量、水相緩沖溶液pH 值、超聲時間等，參考相關(guān)文獻，選取藥脂比為1∶2、1∶4、1∶8，1∶10 制備脂質(zhì)體，測定其包封率、粒度、多分散指數(shù)（PDI）及Zeta 電位。結(jié)果如表1所示，當(dāng)藥脂比為1∶4 時，所制得的脂質(zhì)體包封率高、粒徑小。

2.4.2 膽固醇與卵磷脂比（膜材比）考察 固定其他條件，選取膜材比分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶10的紫草多糖脂質(zhì)體，測定其包封率、粒度、PDI 及Zeta 電位。結(jié)果如表2 所示，當(dāng)膜材比為1∶8 時，所制得的脂質(zhì)體包封率高，粒徑小。

表2 膜材比考察Tab 2 Ratio of cholesterol to phospholipid

2.4.3 超聲時間考察 固定處方中藥量，水相緩沖液pH 值，膜材比，制備不同超聲處理時間的脂質(zhì)體并對其進行表征，結(jié)果如表3 所示，超聲時間 2 min 制得的脂質(zhì)體包封率最高。

表3 超聲時間考察Tab 3 Ultrasonic time

2.5 正交設(shè)計優(yōu)化紫草多糖脂質(zhì)體處方

在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇膜材比（A）、藥脂比（B）、超聲時間（C）3 個影響因素，每個影響因素設(shè)3 個水平，以包封率為主要考察指標，進行正交試驗。正交試驗因素水平設(shè)計見表4。選用L9（33）正交表，分別制得紫草多糖脂質(zhì)體，測定其包封率，結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗因素水平設(shè)計Tab 4 Factor and level

表5 正交試驗結(jié)果Tab 5 Orthogonal test

表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance

根據(jù)表中極值（R）直觀分析可知，各因素重要程度依次為藥脂比（B）＞膜材比（A）＞超聲時間（C），考慮到操作簡便性，最終確定最佳處方為A2B2C1，即膜材比為1∶8，藥脂比為1∶4，超聲時間為2 min。

2.6 驗證試驗及質(zhì)量評價

按“2.5”項下最優(yōu)處方制備3 批紫草多糖脂質(zhì)體，測得包封率分別為80.95%、79.14%、81.76%，制備工藝重復(fù)性良好，外觀呈均勻褐色的透明混懸液，平均粒徑為（131.91±2.38）nm，PDI 為（0.134±0.012），Zeta 電位為（－18.13±0.14）mV，見圖1。4℃放置10 d 無沉淀生成，穩(wěn)定性良好。

圖1 紫草多糖脂質(zhì)體粒徑分布和Zeta 電位Fig 1 Particle size distribution and potential of Arnebiae Radix polysaccharide liposomes

2.7 體外釋放試驗

制備與最優(yōu)處方相同質(zhì)量濃度的紫草多糖的PBS 溶液（pH 7.4），取此溶液和紫草多糖脂質(zhì)體混懸液各5 mL 于處理好的透析袋中，密封，浸入至200 mL pH 7.4 的PBS 釋放介質(zhì)（透析液）中，37℃下100 r·min－1恒溫磁力攪拌，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 吸取1.0 mL 透析液，并立即補加空白釋放介質(zhì)1.0 mL。測定吸光度，計算累積釋放率，繪制體外釋放曲線。

累積釋放率（%）＝一定時間釋放的藥量/藥物總量×100%

由圖2 可知，8 h 時紫草多糖溶液組釋放率已達82.43%，在12 h 時已基本釋放完全；紫草多糖脂質(zhì)體釋藥過程可分為快速釋藥期和緩慢釋藥期，在0 ～2 h 釋藥相對較快，與原料藥的釋藥基本一致，之后釋放較溶液組變慢，在6、12 h 時累積釋放率分別為57.88%、75.78%，24 h 時為81.46%，表明制備的紫草多糖脂質(zhì)體有一定的緩釋作用[9]。

圖2 多糖原藥及脂質(zhì)體累積釋放曲線Fig 2 In vitro release curves of Arnebiae Radix polysaccharide liposomes

3 討論

脂質(zhì)體的制備方法有注入法、熔融法、薄膜分散法、超聲分散法、逆向蒸發(fā)法、冷凍干燥法、高壓乳勻法等。近年來，逆向蒸發(fā)法廣泛應(yīng)用在生物大分子和水溶性藥物脂質(zhì)體的制備，該法所制脂質(zhì)體包封率高，方法簡單、工藝可行[10-11]。本研究采用逆向蒸發(fā)法制備了紫草多糖脂質(zhì)體，其最優(yōu)處方工藝為膜材比1∶8，藥脂比1∶4，超聲持續(xù)時間2 min，包封率可達（80.62± 1.09）%，平均粒徑為（131.91±2.38）nm，PDI 為（0.134±0.012），Zeta電位為（－18.13±0.14）mV，4℃放置10 d 無沉淀生成，說明紫草多糖以脂質(zhì)體為載體是可行的[12]。體外釋藥實驗結(jié)果表明，與紫草多糖溶液相比，紫草多糖脂質(zhì)體體外累積釋放率降低，紫草多糖脂質(zhì)體有一定的緩釋作用。

后續(xù)本課題組將繼續(xù)考察紫草多糖脂質(zhì)體的活性、生物利用度、穩(wěn)定性等，并與原藥進行比較，對紫草多糖新劑型的研發(fā)及利用具有重要意義。