苦參根中化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究

龍國(guó)清，王東東，胡高升，魏江春，王安華，賈景明

苦參根中化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究

龍國(guó)清，王東東，胡高升，魏江春，王安華*，賈景明*

沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

研究苦參根的化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性。利用大孔樹(shù)脂柱色譜、硅膠柱色譜、ODS柱色譜及半制備型HPLC等進(jìn)行分離純化，結(jié)合理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；評(píng)估了從苦參根提取物中分離得到的11個(gè)化合物對(duì)人乳腺鱗狀癌HCC1806細(xì)胞，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，宮頸癌HeLa細(xì)胞，肺癌A549、H1299和H460細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞的體外抑制活性。從苦參根70%乙醇提取物中分離得到17個(gè)化合物，分別鑒定為8-(3,3-dimethylallyl)isorhamnetin（1）、6-lavandulyl-7,4-dimethoxy-5,2-dihydroxylflavanone（2）、sophoraflavanone B（3）、5-methyl-sophoraflavanone B（4）、苦參酮（5）、苦參醇U（6）、去甲脫水淫羊藿黃素（7）、槐果堿（8）、9α-羥基槐果堿（9）、槐胺堿（10）、臭豆堿（11）、胡椒酸（12）、1-(4-ethylphenyl)-1,2-ethanediol（13）、丁香酸（14）、1,2,4-苯三酚（15）、阿魏酸（16）、羥芐基酒石酸（17）。其中化合物5對(duì)H1299和H460細(xì)胞的體外半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（22.6±1.2）、（13.6±0.5）μmol/L，其抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥順鉑。此外，化合物4對(duì)A549細(xì)胞和化合物5對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制效果與陽(yáng)性藥相當(dāng)?；衔?為新的天然產(chǎn)物，化合物2、12～15首次從該屬中分離得到；化合物5對(duì)H1299細(xì)胞和H460細(xì)胞具有較好的抑制活性?？鄥⒅械漠愇煜┗S酮在抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用上有良好的發(fā)展前景。

苦參；抗腫瘤活性；苦參酮；異戊烯基黃酮；胡椒酸；丁香酸；8-(3,3-dimethylallyl)isorhamnetin

苦參Alt.為豆科（Leguminosae）苦參屬多年生藥用植物，野生資源豐富，廣泛分布于我國(guó)南北各省區(qū)。在《湖南藥物志》《中國(guó)民族藥志要》等多個(gè)民族藥學(xué)著作中記載其具有清熱燥濕、散瘀止痛、解毒殺蟲(chóng)等功效[1]?？鄥⒅芯哂卸喾N化學(xué)活性成分，其中以生物堿類(lèi)[2]與黃酮類(lèi)[3]為主。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，苦參中的生物堿和黃酮具有多種生物活性，主要包括抗糖尿病[4-6]、抗腫瘤[7-9]、抗炎[10]及抗病原微生物[11]等作用。本課題組前期從苦參根中提取分離了一系列具有良好抗腫瘤活性的化合物[12-13]，發(fā)現(xiàn)苦參的化學(xué)成分在抗腫瘤藥物研究中具有重要的研究?jī)r(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦參進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從中分離得到17個(gè)化合物，分別鑒定為8-(3,3- dimethylallyl) isorhamnetin（1）、6-lavandulyl-7,4- dimethoxy-5,2-dihydroxyl-flavanone（2）、sophora- flavanone B（3）、5-methyl-sophoraflavanone B（4）、苦參酮（kurarinone，5）、苦參醇U（kushenol U，6）、去甲脫水淫羊藿黃素（8-prenylkaempferol，7）、槐果堿（sophocarpine，8）、9α-羥基槐果堿（9-hydroxy- sophocarpine，9）、槐胺堿（3,4,5,6-tetradehydro- spartein-2-one，10）、臭豆堿（anagyrin，11）、胡椒酸（heliotropic acid，12）、1-(4-ethylphenyl)-1,2- ethanediol（13）、丁香酸（syringic acid，14）、1,2,4-苯三酚（1,2,4-trihydroxybenzene，15）、阿魏酸（ferulic acid，16）、羥芐基酒石酸（piscidic acid，17）。采用MTT法評(píng)估了其中11個(gè)化合物的細(xì)胞毒活性，結(jié)果顯示，化合物5對(duì)肺癌H1299細(xì)胞和H460細(xì)胞具有較好的抑制活性，其抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥順鉑；化合物4對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和化合物5對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制效果與陽(yáng)性藥相當(dāng)。

1 儀器與材料

AAPI 3200質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司，F(xiàn)ramingham，MA，美國(guó)）；Bruker 601型核磁共振儀（Bruker公司，瑞士）；JASCO V-650紫外-可見(jiàn)分光光度儀（JASCO公司，日本）；UltiMate 3000分析型HPLC（Thermo公司，美國(guó)）；制備型HPLC（Agela公司，美國(guó)）；Waters 2545全自動(dòng)制備型高效液相色譜儀（Waters公司，美國(guó)）；硅膠GF254薄層預(yù)制板為煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品；色譜硅膠（200～300目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品；制備型C18色譜柱（YMC-Pack ODS-A）；Waters RP C18色譜柱（Waters公司，美國(guó)）；ODS填料為日本YMC公司產(chǎn)品；所用色譜級(jí)甲醇和乙腈均購(gòu)自康科德科技有限公司。

人乳腺鱗狀癌HCC1086細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞、H460細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室保存和進(jìn)行傳代。

實(shí)驗(yàn)用苦參根于2018年5月采于我國(guó)遼寧省朝陽(yáng)市凌源市宋杖子鎮(zhèn)綠源中草藥種植基地，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院胡高升副教授鑒定為苦參Ait.，標(biāo)本（SPU-2018-1014-06）保存于沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥資源教研室。

2 提取與分離

將干燥的苦參根50 kg，切片、粉碎，70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h。提取液濃縮后，依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，取醋酸乙酯部位（960 g）經(jīng)D101大孔柱色譜，乙醇-水系統(tǒng)（30%、50%、75%、95%）洗脫，合并相同部位后，共得到4個(gè)流分（Fr. 1～4）。Fr. 3（225 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脫，合并相同部位后，共得到14個(gè)流分（Fr. 3.1～3.14）。取Fr. 3.2（6.2 g）過(guò)ODS中壓色譜，甲醇-水（40∶60～100∶0，5 h），體積流量15.0 mL/min，得到36個(gè)流分（Fr. 3.2.1～3.2.36）；Fr.3.2.23經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（50∶50），體積流量8.0 mL/min，得到化合物1（11.2 mg）、3（15.0 mg）、4（9.6 mg）和7（20.2 mg）。取Fr. 3.2.34過(guò)羥丙基葡聚糖凝膠柱（Sephadex LH-20），以純甲醇作為流動(dòng)相，得到6個(gè)流分（Fr. 3.2.34.1～3.2.34.6）。Fr. 3.2.34.1經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（65∶35），體積流量8.0 mL/min，得到化合物2（9.6 mg）。Fr. 3.2.34.4經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（63∶37），體積流量8.0 mL/min，得到化合物5（15.6 mg）和6（24.7 mg）。取Fr. 1（13 g）過(guò)ODS中壓色譜，甲醇-水（10∶90～100∶0），體積流量15.0 mL/min，得到18個(gè)流分（Fr. 1.1～1.18）；Fr. 1.3經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（10∶90），體積流量8.0 mL/min，得到化合物12（10.6 mg）、14（13.5 mg）和15（6.9 mg）。Fr. 1.5經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（13∶87），體積流量8.0 mL/min，得到化合物13（14.6 mg）、16（22.4 mg）和17（18.6 mg）。取二氯甲烷萃取部位（410 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（100∶1～0∶1）梯度洗脫，合并相同部位后，共得到15個(gè)流分（A1～A15）。取A14（12 g）過(guò)ODS中壓色譜，甲醇-水（60∶40～100∶0，5 h），體積流量15.0 mL/min，得到16個(gè)流分（A.14.1～A.14.16）；A.14.8經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（75∶25），體積流量8.0 mL/min，得到化合物9（21.1 mg）；A.14.12經(jīng)制備型HPLC制備，甲醇-水（83∶17），體積流量8.0 mL/min，得到化合物8（14.6 mg）、10（22.5 mg）和11（52.1 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 347.4 [M＋Na]+，分子式為C20H20O4。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.38 (1H, s, 5-OH), 10.73 (1H, s, 7-OH), 9.77 (1H, s, 4′-OH), 9.41 (1H, s, 2-OH), 7.74 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 6.95 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 7.72 (1H, dd,= 8.4, 1.8 Hz, H-6′), 6.30 (1H, s, H-6), 5.23 (1H, d,= 6.0 Hz, H-2′′), 2.82 (2H, dd,= 17.1, 3.2 Hz, H-1′′), 1.73 (3H, s, 4′′-CH3), 1.62 (3H, s, 5′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 176.6 (C-4), 161.6 (C-5), 158.7 (C-7), 153.9 (C-9), 149.2 (C-3′), 147.9 (C-4′), 147.0 (C-2), 136.2 (C-3), 131.2 (C-3′′), 123.0 (C-2′′), 122.7 (C-1′), 122.2 (C-6′), 116.0 (C-5′), 111.9 (C-2′), 106.0 (C-10), 103.5 (C-8), 98.5 (C-6), 56.0 (3′-OCH3), 25.8 (C-5′′), 21.7 (C-1′′), 18.3 (C-4′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[14]，故鑒定化合物1為8-(3,3-dimethylallyl)isorhamnetin，經(jīng)過(guò)Scifinder查閱發(fā)現(xiàn)該化合物為新的天然產(chǎn)物。

化合物2：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 474.2 [M＋Na]+，分子式為C27H32O6，ECD λmax330 nm，Δ＋10；λmax290 nm，Δ?30。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.56 (1H, dd,= 13.8, 3.0 Hz, H-2), 2.89 (1H, dd,= 16.8, 13.8 Hz, H-3a), 2.65 (1H, dd,= 16.8, 3.0 Hz, H-3b), 6.14 (1H, s, H-8), 6.50 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3′), 3.83 (3H, s, 4′-OCH3), 6.47 (1H, dd,= 8.4, 2.4 Hz, H-5′), 7.39 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6′), 2.51 (2H, m, H-1′′), 2.63 (1H, m, H-2′′), 2.00 (2H, m, H-3′′), 4.98 (1H, t,= 7.2 Hz, H-4′′), 1.50 (3H, s, 6′′-CH3), 1.60 (3H, s, 7′′-CH3), 4.52 (1H, s, H-8′′), 4.60 (1H, s, H-9′′), 1.66 (3H, s, 10′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 75.3 (C-2), 45.5 (C-3), 193.7 (C-4), 164.7 (C-5), 109.5 (C-6), 164.8 (C-7), 93.3 (C-8), 161.9 (C-9), 105.8 (C-10), 119.0 (C-1′), 160.1 (C-2′), 99.8 (C-3′), 159.0 (C-4′), 108.1 (C-5′), 128.5 (C-6′), 28.2 (C-1′′), 48.2 (C-2′′), 32.4 (C-3′′), 124.8 (C-4′′), 132.1 (C-5′′), 17.9 (C-6′′), 25.9 (C-7′′), 149.7 (C-8′′), 111.2 (C-9′′), 19.1 (C-10′′), 55.9 (4′-OCH3), 55.8 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[15]，故鑒定化合物2為(2,2)-6-lavandulyl-7,4-dimethoxy- 5,2-dihydroxylflavanone。

化合物3：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 363.1 [M＋Na]+，分子式為C20H22O5，ECD λmax330 nm，Δ＋9；λmax290 nm，Δ?55。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.41 (1H, dd,= 12.6, 3.0 Hz, H-2), 3.18 (1H, dd,= 16.8, 12.6 Hz, H-3a), 2.70 (1H, dd,= 16.8, 3.0 Hz, H-3b), 5.97 (1H, s, H-6), 7.30 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2H, d,= 9.0 Hz, H-3′, 5′), 3.09 (2H, m, H-1′′), 5.07 (1H, m, H-2′′), 1.59 (3H, s, 4′′-CH3), 1.54 (3H, s, 5′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 77.6 (C-2), 41.3 (C-3), 196.1 (C-4), 160.5 (C-5), 94.6 (C-6), 159.1 (C-7), 106.3 (C-8), 163.7 (C-9), 101.1 (C-10), 128.6 (C-1′), 127.4 (C-2′, 6′), 114.5(C-3′, 5′), 156.9 (C-4′), 20.6 (C-1′′), 122.0 (C-2′′), 129.5 (C-3′′), 16.9 (C-4′′), 24.9 (C-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[16]，故鑒定化合物3為sophoraflavanone B。

化合物4：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 377.4 [M＋Na]+，分子式為C21H22O5，ECD λmax330 nm，Δ＋12；λmax290 nm，Δ?45。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.31 (1H, dd,= 12.0, 3.0 Hz, H-2), 2.90 (1H, dd,= 16.8, 12.0 Hz, H-3a), 2.55 (1H, dd,= 16.8, 3.0 Hz, H-3b), 6.14 (1H, s, H-6), 7.28 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.77 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3′, 5′), 3.11 (2H, m, H-1′′), 5.10 (1H, m, H-2′′), 1.61 (3H, s, 4′′-CH3), 1.55 (3H, s, 5′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 79.9 (C-2), 46.1 (C-3), 192.8 (C-4), 163.7 (C-5), 93.2 (C-6), 164.1 (C-7), 109.8 (C-8), 163.7 (C-9), 105.7 (C-10), 131.4 (C-1′), 128.7 (C-2′, 6′), 116.0 (C-3′, 5′), 158.6 (C-4′), 22.6 (C-1′′), 123.8 (C-2′′), 131.5 (C-3′′), 17.7 (C-4′′), 22.5 (C-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[17]，故鑒定化合物4為5-methylsophoraflavanone B。

化合物5：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 461.2 [M＋Na]+，分子式為C26H30O6，ECD λmax330 nm，Δ＋13；λmax290 nm，Δ?58。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.60 (1H, dd,= 7.8, 2.4 Hz, H-2), 2.88 (1H, dd,= 16.8, 3.0 Hz, H-3b), 2.71 (1H, dd,= 16.8, 13.2 Hz, H-3a), 3.84 (3H, s, 5-OCH3), 6.14 (1H, s, H-6), 6.30 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3′), 6.37(1H, dd,= 8.4, 2.4 Hz, H-5′), 7.32(1H, d,= 8.4 Hz, H-6′), 2.50 (2H, m, H-1′′), 2.64 (1H, m, H-2′′), 2.00 (2H, m, H-3′′), 4.98 (1H, t,= 7.2 Hz, H-4′′), 1.51 (3H, s, 6′′-CH3), 1.60 (3H, s, 7′′-CH3), 4.55 (1H, s, H-9′′), 4.61 (1H, s, H-9′′), 1.67 (3H, s, 10′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 74.1 (C-2), 45.6 (C-3), 193.9 (C-4), 161.8 (C-5), 93.2 (C-6), 164.9 (C-7), 109.5 (C-8), 164.8 (C-9), 105.7 (C-10), 118.4 (C-1′), 156.7 (C-2′), 107.6 (C-3′), 159.5 (C-4′), 103.3 (C-5′), 128.5 (C-6′), 28.2 (C-1′′), 48.2 (C-2′′), 32.3 (C-3′′), 124.8 (C-4′′), 132.0 (C-5′′), 17.8 (C-6′′), 25.9 (C-7′′), 149.7 (C-8′′), 111.3 (C-9′′), 19.1 (C-10′′), 55.9 (5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[18]，故鑒定化合物5為苦參酮。

化合物6：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 445.2 [M＋Na]+，分子式為C26H30O5，ECD λmax330 nm，Δ＋20；λmax290 nm，Δ?62。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.24 (1H, dd,= 13.2, 3.0 Hz, H-2), 2.93 (1H, d,= 16.2 Hz, H-3a), 2.64 (1H, dd,= 16.2, 3.0 Hz, H-3b), 6.10 (1H, s, H-6), 7.32 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d,= 8.4 Hz, H-3′, 5′), 2.41 (2H, m, H-1′′), 2.58 (1H, m, H-2′′), 1.95 (2H, m, H-3′′), 4.93 (1H, t,= 7.2 Hz, H-4′′), 1.56 (3H, s, 6′′-CH3), 1.60 (3H, s, 7′′-CH3), 4.56 (1H, s, H-9′′), 4.46 (1H, s, H-9′′), 1.47 (3H, s, 10′′-CH3), 3.80 (3H, s, 5-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 80.1 (C-2), 46.4 (C-3), 193.1 (C-4), 161.9 (C-5), 93.4 (C-6), 164.9 (C-7), 109.5 (C-8), 164.3 (C-9), 105.7 (C-10), 131.5 (C-1′), 128.9 (C-2′, 6′), 116.3(C-3′, 5′), 158.9 (C-4′), 28.2 (C-1′′), 48.5 (C-2′′), 32.4 (C-3′′), 124.7 (C-4′′), 132.1 (C-5′′), 17.9 (C-6′′), 25.9 (C-7′′), 149.6 (C-8′′), 111.3 (C-9′′), 19.1 (C-10′′), 55.9 (5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[19]，故鑒定化合物6為苦參醇U。

化合物7：黃色無(wú)定形粉末（甲醇）。ESI-MS/: 377.1 [M＋Na]+，分子式為C20H18O6。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.23 (1H, s, H-6), 8.10 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,= 9.0 Hz, H-3′, 5′), 3.50 (2H, m, H-1′′), 5.22 (1H, t,= 7.6 Hz, H-2′′), 1.80 (3H, s, 4′′-CH3), 1.67 (3H, s, 5′′-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 148.0 (C-2), 137.0 (C-3), 177.6 (C-4), 160.1 (C-5), 98.7 (C-6), 162.8 (C-7), 107.6 (C-8), 160.1 (C-9), 104.5 (C-10), 124.0 (C-1′), 130.5 (C-2′, 6′), 116.3(C-3′, 5′), 155.5 (C-4′), 22.4 (C-1′′), 123.9 (C-2′′), 132.4 (C-3′′), 25.9 (C-4′′), 18.2(C-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[20]，故鑒定化合物7為去甲脫水淫羊藿黃素。

化合物8：無(wú)色油狀物（甲醇）。ESI-MS/: 285.3 [M＋K]+，分子式為C15H22N2O。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 2.82 (1H, m, H-2a), 2.00 (1H, m, H-2b), 1.75 (2H, m, H-3), 2.26 (1H, m, H-4a), 1.85 (1H, m, H-4b), 2.22 (1H, m, H-5), 2.70 (1H, m, H-6), 1.91 (1H, m, H-7), 1.75 (1H, m, H-8a), 1.68 (1H, m, H-8b), 1.48 (1H, m, H-9a), 1.61 (1H, m, H-9b), 2.82 (1H, m, H-10a), 2.00 (1H, m, H-10b), 3.97 (1H, m, H-11), 1.46 (1H, m, H-12a), 2.22 (1H, m, H-12b), 6.64 (1H, m, H-13), 5.81 (1H, m, H-14), 4.05 (1H, dd,= 13.2, 4.8 Hz, H-17a), 3.15 (1H, t,= 13.2 Hz, H-17b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 58.3 (C-2), 22.1 (C-3), 28.7 (C-4), 36.0 (C-5), 64.7 (C-6), 42.8 (C-7), 27.3 (C-8), 21.6 (C-9), 58.3 (C-10), 52.9 (C-11), 28.3 (C-12), 140.9 (C-13′), 124.2 (C-14), 167.7 (C-15), 43.1 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[21]，故鑒定化合物8為槐果堿。

化合物9：無(wú)色油狀物（甲醇）。ESI-MS/: 285.1 [M＋Na]+，分子式為C15H22N2O2。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 2.82 (2H, m, H-2), 1.75 (2H, m, H-3), 2.26 (1H, m, H-4a), 1.85 (1H, m, H-4b), 2.22 (1H, m, H-5), 1.63 (1H, m, H-6), 1.91 (1H, m, H-7), 1.75 (1H, m, H-8a), 1.68 (1H, m, H-8b), 3.83 (1H, m, H-9), 3.47 (1H, m, H-10a), 4.03 (1H, m, H-10b), 1.46 (1H, m, H-11), 2.22 (2H, m, H-12), 6.62 (1H, m, H-13), 5.77 (1H, m, H-14), 4.05 (1H, dd,= 13.2, 4.8 Hz, H-17a), 3.15 (1H, t,= 13.2 Hz, H-17b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 54.7 (C-2), 18.5 (C-3), 24.9 (C-4), 27.1 (C-5), 61.9 (C-6), 27.1 (C-7), 23.3 (C-8), 18.2 (C-9), 54.6 (C-10), 38.8 (C-11), 32.0 (C-12), 139.4 (C-13), 123.3 (C-14), 165.2 (C-15), 49.8 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[22]，故鑒定化合物9為9α-羥基槐果堿。

化合物10：無(wú)色油狀物（甲醇）。ESI-MS/: 267.3 [M＋Na]+，分子式為C15H20N2O。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 3.78 (1H, m, H-2a), 3.22 (1H, m, H-2b), 3.22 (1H, s, H-3a), 2.25 (1H, m, H-3b), 3.22 (2H, s, H-4), 4.07 (1H, m, H-5), 4.01 (1H, m, H-6), 2.36 (1H, m, H-7), 2.36 (2H, m, H-8), 1.66 (2H, m, H-9), 3.49 (2H, m, H-10), 6.23 (H, m, H-12), 6.40 (1H, m, H-13), 7.45 (1H, m, H-14), 4.25 (1H, dd,= 13.2, 4.8 Hz, H-17a), 2.63 (1H, t,= 13.2 Hz, H-17b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 52.0 (C-2), 19.4 (C-3), 24.0 (C-4), 34.5 (C-5), 64.2 (C-6), 33.1 (C-7), 23.3 (C-8), 18.9 (C-9), 52.0 (C-10), 148.3 (C-11), 109.1 (C-12), 141.5 (C-13), 118.8 (C-14), 165.3 (C-15), 50.6 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[21]，故鑒定化合物10為槐胺堿。

化合物11：無(wú)色油狀物（甲醇）。ESI-MS/: 267.4 [M＋Na]+，分子式為C15H20N2O。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.54 (1H, d,9.6 Hz, H-3), 7.53 (1H, dd,9.0, 1.8 Hz, H-4), 6.41 (1H, d,6.6 Hz, H-5), 3.20 (1H, m, H-7), 2.26 (1H, m, H-8a), 1.64 (1H, m, H-8b), 3.68 (1H, d,12.6 Hz, H-9), 4.15 (1H, d,15.6 Hz, H-10a), 3.68 (1H, m, H-10b), 3.48 (1H, s, H-11), 2.34 (1H, d,13.8 Hz, H-12a), 1.90 (1H, m, H-12b), 2.62 (1H, s, H-13a), 1.32 (1H, s, H-13b), 1.93 (1H, m, H-14a), 1.80 (1H, t,10.8 Hz, H-14b), 4.07 (1H, m, H-15a), 3.18 (1H, m, H-15b), 4.07 (1H, m, H-15a), 3.48 (1H, s, H-17b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 58.3 (C-2), 22.1 (C-3), 28.7 (C-4), 36.0 (C-5), 64.7 (C-6), 42.8 (C-7), 27.3 (C-8), 21.6 (C-9), 58.3(C-10), 52.9 (C-11), 28.3 (C-12), 140.9 (C-13), 124.2 (C-14), 167.7 (C-15), 43.1 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[23]，故鑒定化合物11為臭豆堿。

化合物12：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 198.7 [M＋Na]+，分子式為C8H6O4。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.36 (1H, s, H-2), 6.99 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 7.53 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 6.12 (2H, s, -OCH2O), 12.75 (1H, s, -OH)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 125.1 (C-1), 108.9 (C-2), 147.6 (C-3), 151.2 (C-4), 108.2 (C-5), 124.9 (C-6), 101.3 (OCH2O), 166.8 (COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[24]，故鑒定化合物12為胡椒酸。

化合物13：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 189.1 [M＋Na]+，分子式為C10H14O2。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.19 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2, 6), 7.09 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3, 5), 5.16 (1H, d,= 4.2 Hz, 7-OH), 4.68 (1H, t,= 5.8 Hz, 8-OH), 4.49 (1H, dd,= 10.3, 5.9 Hz, H-8a), 3.37 (1H, m, H-8b), 2.60 (2H, m, H-9), 1.17 (3H, t,= 7.6 Hz, H-10)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 143.4 (C-4), 143.1 (C-1), 127.7 (C-3, 5), 125.6 (C-2, 6), 73.9 (C-7), 67.5 (C-8), 28.2 (C-9), 15.6 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[25]，故鑒定化合物13為1-(4-ethylphenyl)-1,2-ethanediol。

化合物14：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 221.2 [M＋Na]+，分子式為C9H10O5。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.33 (2H, s, H-2, 6), 3.88 (3H, s, 3, 5-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 169.9 (COOH), 148.8 (C-3, 5), 141.70 (C-4), 122.0 (C-1), 108.3 (C-2, 6), 56.7 (3, 5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[26]，故鑒定化合物14為丁香酸。

化合物15：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/149.3 [M＋Na]+，分子式為C6H6O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.52 (1H, d,= 8.7 Hz, H-6), 6.55 (1H, dd,= 8.6, 2.1 Hz, H-5), 6.27 (1H, d,= 1.8 Hz, H-3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 140.9 (C-1), 151.2 (C-2), 107.9 (C-3), 152.8 (C-4), 110.2 (C-5), 121.3 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[27]，故鑒定化合物15為1,2,4-苯三酚。

化合物16：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 217.4 [M＋Na]+，分子式為C10H10O4。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.14 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 7.02 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 6.68 (1H, dd,= 8.6, 1.8 Hz, H-6), 7.55 (1H, d,= 16.8 Hz, H-7), 6.32 (1H, d,= 16.8 Hz, H-8), 3.80 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 126.2 (C-1), 111.6 (C-2), 149.5 (C-3), 148.3 (C-4), 115.9 (C-5), 121.3 (C-6), 144.9 (C-7), 116.0 (C-8), 168.5 (C-9), 56.2 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[28]，故鑒定化合物16為阿魏酸。

化合物17：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 279.2 [M＋Na]+，分子式為C11H12O7。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.52 (1H, s, H-2), 3.14 (1H, d,= 13.9 Hz, H-3a), 2.99 (1H, d,= 13.9 Hz, H-3b), 7.07 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.66 (1H, d,= 8.5 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 174.9 (C-1), 76.3 (C-2), 81.4 (C-3), 42.0 (C-4), 175.8 (C-5), 128.0 (C-1′), 132.5 (C-2′, 6′), 115.7 (C-3′, 5′), 157.2 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[29]，故鑒定化合物17為羥芐基酒石酸。

4 抗腫瘤活性測(cè)試

采用MTT法評(píng)估了從苦參根提取物中分離得到的7個(gè)異戊烯基黃酮（1～7）和4個(gè)生物堿（8～11）分別對(duì)人腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)對(duì)HepG2、HeLa 2種細(xì)胞選擇5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）作為陽(yáng)性藥，對(duì)H460、A549、H1299、HCC1806、MCF-7細(xì)胞選擇順鉑作為陽(yáng)性藥，結(jié)果顯示，4種生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞均無(wú)抑制作用，7種異戊烯基黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其中化合物5對(duì)H1299和H460具有良好的抑制活性，其抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥順鉑。化合物4對(duì)A549和化合物5對(duì)MCF-7的抑制效果與陽(yáng)性藥相當(dāng)。

表1 化合物1～11對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

Table 1 Anti-tumor activities of compounds 1—11

化合物IC50/(μmol·L?1)A549H1299H460HCC1806MCF-7HepG2HeLa 126.3±0.960.1±1.528.3±1.566.7±2.261.5±1.745.8±2.148.5±1.1 247.6±2.270.8±0.654.2±2.578.3±1.569.1±1.260.5±3.351.3±4.6 320.1±1.258.2±1.624.2±0.656.7±1.359.4±1.339.5±1.544.9±1.8 415.2±1.349.2±1.868.4±1.671.2±0.955.2±2.529.8±0.867.8±1.6 525.2±0.822.6±1.213.6±0.549.5±1.118.6±0.835.1±1.932.8±0.9 630.5±2.537.8±4.126.6±1.352.7±1.882.3±1.993.4±1.697.2±1.2 736.4±2.655.2±1.635.9±2.269.9±5.575.1±2.337.5±3.839.4±3.3 8＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100 9＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100 10＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100 11＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100 5-FU/////14.5±1.215.9±0.2 順鉑12.6±1.224.5±1.018.2±1.133.2±0.816.2±1.2//

5 討論

苦參為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，用藥歷史悠久?？鄥⒅械幕钚猿煞种饕獮樯飰A類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，而黃酮類(lèi)化合物主要以二氫黃酮為主。在結(jié)構(gòu)解析方面，本研究運(yùn)用一維核磁（1H-NMR、13C-NMR）確定二氫黃酮化合物（2～6）的平面構(gòu)型，并用ECD譜的Cotton效應(yīng)來(lái)確定化合物2位手性碳的絕對(duì)構(gòu)型，即在280～300 nm為負(fù)Cotton效應(yīng)，且在320～340 nm為正Cotton效應(yīng)，則表明二氫黃酮的2位碳為型；若在280～300 nm為正Cotton效應(yīng)，且在320～340 nm為負(fù)Cotton效應(yīng)，則表明二氫黃酮的2位碳為型[30]，這大大提高了化合物結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性。大量的藥理研究發(fā)現(xiàn)，苦參中的化合物具有良好的抗腫瘤活性，在體外活性篩選方面，本研究發(fā)現(xiàn)在相同給藥劑量濃度下異戊烯基黃酮類(lèi)化合物比生物堿具有更好的抗腫瘤活性，為進(jìn)一步研究抗腫瘤藥物提供一定的借鑒意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents ofand its antitumor activities

LONG Guo-qing, WANG Dong-dong, HU Gao-sheng, WEI Jiang-chun, WANG An-hua, JIA Jing-ming

School of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

To study the chemical constituents of Kushen () and its antitumor activities.The compounds were isolated and purified using macroporous resin column chromatography, silica gel column chromatography, ODS column chromatography and semi-preparative HPLC, and their structures were elucidated by means of physicochemical properties and spectroscopic analysis. And the 11 compounds were evaluated using relevantanti-tumor activities against breast squamous carcinoma cells (HCC1806), human breast cancer cells (MCF-7), human cervical cancer cells (HeLa), human lung cancer cells (A549, H1299 and H460), and human hepatoma cells(HepG2).Seventeen compounds were isolated from 70% ethyl alcohol extract from the roots ofand identified as 8-(3,3- dimethylallyl)isorhamnetin (1), 6-lavandulyl-7,4-dimethoxy-5,2-dihydroxylflavanone (2), sophoraflavanone B (3), 5- methylsophoraflavanone B (4), kurarinone (5), kushenol U (6), 8-prenylkaempferol (7), sophocarpine (8), 9αhydroxysophocarpine (9), sophoramine (10), anagyrine (11), piperic acid (12), 1-(4-ethylphenyl)-1,2-ethanediol (13), syringic acid (14), 1,2,4-benzenetriol (15), ferulic acid (16), and piscidic acid (17). Compound 5 showed good inhibitory activities against H1299 and H460, and its inhibitory effect was stronger than that of cisplatin with IC50values of (22.6 ± 1.2) μmol/L and (13.6 ± 0.5) μmol/L, respectively. In addition, the inhibitory activities of compound 4 against A549 cells and compound 5 against MCF-7 cells were comparable to that of the positive drug.Among them, compound 1 is a new natural product, and compounds 2, 12—15 are isolated from genusfor the first time. Compound 5 showed good inhibitory activities against H1299 and H460, which provide scientific basis for further research on new anti-tumor drugs of isopentenyl flavonoids in.

Ait.; antitumor activity; kurarinone; isopentenyl flavonoids; piperic acid; syringic acid; 8-(3,3-dimethylallyl)isorhamnetin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 0978 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.003

2021-09-20

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1701200）；遼寧省“興遼英才計(jì)劃”項(xiàng)目（XLYC1902101）

龍國(guó)清（1994—），男，博士，湖南鳳凰人，主要研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)與活性研究。E-mail:sylongguoqing@163.com

賈景明，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及有效成分代謝調(diào)控。E-mail: jiajingming@163.com

王安華，講師，博士，主要從事中藥及天然產(chǎn)物的成分分離及活性評(píng)價(jià)。E-mail: sywanganhua@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]