心肌缺血中醫(yī)動物模型制備及中醫(yī)藥防治新進(jìn)展

馮雨菲，何貴新，申永艷，秦偉彬，肖 婷，玉黎燕，胡夢弦，鄭國坤

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022）

心肌缺血是冠心病冠狀動脈管腔閉塞或者狹窄后無法避免的病理狀態(tài)，其特征為心肌底物供應(yīng)不足，心臟供血受限，嚴(yán)重者可發(fā)生心肌缺血性疾病，包括心肌梗死和危及生命的心律失常［1，2］，對人類健康產(chǎn)生巨大威脅。因此，防治心肌缺血一直以來是心血管領(lǐng)域臨床研究及動物實驗研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。中醫(yī)中藥治療是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)幾千年來的經(jīng)驗積累，其治療主張治病求本，以整體觀念為基礎(chǔ)，以辨證論治為特色，優(yōu)勢獨(dú)特，效果顯著，越來越受到人們的重視，然而中醫(yī)藥方證的對應(yīng)關(guān)系及中藥的作用機(jī)制理尚不清楚。借鑒先進(jìn)的動物模型方法用于中醫(yī)的理論研究是提高中醫(yī)臨床療效，促進(jìn)中醫(yī)發(fā)展的有效途徑［3］。其中，病證結(jié)合的動物模型既有西醫(yī)疾病的特點(diǎn)，又有中醫(yī)證候的特征，是中醫(yī)動物模型的新方向。此外，其通過與中醫(yī)臨床診斷相結(jié)合，更加貼合臨床實際也更能準(zhǔn)確地闡明中醫(yī)證候本質(zhì)［4］。因此，成功制備出病證結(jié)合的中醫(yī)動物模型有助于探求中醫(yī)癥候的生物特征以及中醫(yī)藥作用機(jī)制和療效。本文就近年來冠心病心肌缺血常見病證結(jié)合動物模型的制備方法及模型評價以及其中醫(yī)藥的治療情況進(jìn)行整理闡述，為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

心肌缺血屬“胸痹心痛”范疇，臨床表現(xiàn)為胸骨后或心前區(qū)悶痛，甚則胸痛徹背，喘息不得臥。心肌缺血多為本虛標(biāo)實之證，本虛為心脾肝腎虛，心脈失養(yǎng)，標(biāo)實多為血瘀、寒凝、痰濁、氣滯，痹阻心脈，其中血瘀是病理關(guān)鍵，且其病理因素常相兼為?。?］。

1 寒凝血瘀證

1.1 模型制備

寒凝血瘀證是心肌缺血的多發(fā)證型，寒性凝滯，不通則痛，患者常心痛如絞，疼痛難忍，在其模型的制備中可分為藥物干預(yù)和非藥物干預(yù)，同時聯(lián)合寒冷因素。

王朋等［6］在建立心肌缺血寒凝血瘀大鼠模型中采用垂體后葉素單一因素大劑量靜脈注射的方法，借助垂體后葉素可引起血管收縮，心肌耗氧量增加，進(jìn)而引起心肌缺血的病理變化。同時，大鼠注射垂體后葉素后有明顯的寒象，符合寒邪致病特點(diǎn)。為了保證病證結(jié)合模型更貼合中醫(yī)病因和辯證診斷規(guī)律，且根據(jù)心肌缺血冬季多發(fā)以及寒冷刺激致病特點(diǎn)，可采用垂體后葉素聯(lián)合寒冷因素的復(fù)合造模方法，即先將大鼠置于?5℃±1℃的寒冷環(huán)境中進(jìn)行3 h 的寒冷刺激，然后注射垂體后葉素，連續(xù)3 d，通過間斷反復(fù)冷應(yīng)激來促進(jìn)其模型制備［7］。此外，以寒凝加藥物干預(yù)也是復(fù)制心肌缺血寒凝血瘀證動物模型的方法。干預(yù)藥物常選用異丙腎上腺素，而降低室溫或者在冰水中運(yùn)動可對大鼠造成寒凝刺激［8］。

1.2 模型評價

癥狀和體征是中醫(yī)辨識癥候的主要依據(jù)，一般情況變化常作為評價模型的直觀表現(xiàn)，造模大鼠會出現(xiàn)唇周、爪子顏色紫暗，體溫下降，心率減慢，此皆符合心肌缺血寒凝血瘀證的癥候表現(xiàn)。微觀理化指標(biāo)可輔助辨識癥候，同時顯示西醫(yī)臨床特點(diǎn)。心肌缺血大鼠會出現(xiàn)心電圖ST 段抬高，而心肌微靜脈收縮，紅細(xì)胞流速明顯減慢等反映心肌微循環(huán)出現(xiàn)障礙，同時模型動物的心肌組織會出現(xiàn)缺血病理形態(tài)改變［9］。此外，血清FT3、FT4、TSH 的降低以及血漿中ET 增高、NO 降低可分別反映“寒”的征象以及血管出現(xiàn)痙攣、血瘀，皆為心肌缺血寒凝血瘀證成功復(fù)制的有效評價指標(biāo)［6，7］。

1.3 中醫(yī)藥治療心肌缺血寒凝血瘀證

中藥復(fù)方及單體可通過調(diào)控不同的信號通路及相關(guān)蛋白，進(jìn)而改善心肌缺血寒凝血瘀證的臨床表現(xiàn)，其中血液流變學(xué)的變化是判斷血瘀證是否改善的重要指標(biāo)。劉智等［8］利用藥物干預(yù)與寒冷刺激的方法建立大鼠心肌缺血寒凝血瘀模型，并在研究中發(fā)現(xiàn)，參附注射液可改善寒凝血瘀型大鼠血液的黏、濃、凝、滯狀態(tài)，減輕大鼠血瘀的癥狀，可改變行為學(xué)指標(biāo)，提高寒凝血瘀大鼠的認(rèn)知能力。吳澤民等［10］亦采用相同造模方法發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心湯亦可改善模型大鼠血液黏凝濃聚狀態(tài)，其中，降低血脂代謝水平、降低動脈硬化指數(shù)是養(yǎng)心湯的治療途徑。此外，中藥單體沙棘總黃酮可通過激活PI3K/Bcl-2/Caspase-3 途徑，抑制寒凝血瘀大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［11］，進(jìn)而改善大鼠的心肌缺血情況。

2 痰瘀互結(jié)型

2.1 模型制備

一項胸痹心痛的證型分布研究結(jié)果顯示：痰瘀互結(jié)證型比例高達(dá)31.31%，是心肌缺血的常見證型［12］。痰凝與血瘀是最主要的病理因素，有學(xué)者認(rèn)為在痰瘀互結(jié)的證型中痰為先導(dǎo)，由痰致瘀，以痰為主［13］，故在制備動物模型時常先復(fù)制痰濁壅滯的癥候特點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上通過藥物法或手術(shù)法誘發(fā)冠狀動脈狹窄及梗死以促成心肌缺血的模型復(fù)制。進(jìn)而模擬先痰后瘀，痰瘀互結(jié)的病癥模型。

急性心肌缺血的痰瘀互結(jié)模型常采用冠狀動脈左前降支（LAD）手術(shù)法聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)進(jìn)行制備。中醫(yī)認(rèn)為飲食不節(jié)，過食肥甘厚味，可導(dǎo)致脾胃失健，聚濕成痰，故采用高脂飼料喂養(yǎng)造成脂質(zhì)代謝紊亂以模擬痰瘀互結(jié)證中的“痰”。而手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈左前降支可模擬痰瘀互結(jié)證中的“瘀”，同時形成心肌缺血的病理狀態(tài)［14］。此外，LAD 的缺血狀態(tài)可通過冠脈介入球囊，加壓損傷內(nèi)皮血管來形成［15］，然而此方法實驗技術(shù)要求嚴(yán)格，且所需費(fèi)用較高，應(yīng)用并不廣泛。而慢性心肌缺血的動物模型制備常采用藥物干預(yù)的方法。潘永明等［16］通過靜脈注射維生素D3 和異丙腎上腺素，同時聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)成功復(fù)制慢性心肌缺血痰瘀互結(jié)證小型豬模型。

2.2 模型評價

由于痰瘀互結(jié)證采用復(fù)合因素造模法，動物模型前期多出現(xiàn)體重增加，被毛油膩及舌苔厚膩等痰濁內(nèi)阻證候，后期則會表現(xiàn)出明顯血瘀證的臨床表征?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為冠心病痰瘀互結(jié)證與血脂、血液流變學(xué)、氧自由基、凝血功能、炎癥等改變及基因表達(dá)差異相關(guān)［17］，故相關(guān)指標(biāo)作為評價動物模型的微觀指征。痰濁互瘀型的動物模型血清中TC、TG 和LDL-C 顯著升高，表明其脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常，是“痰濁”出現(xiàn)的先導(dǎo)因素。而模型組全血黏度和還原黏度、紅細(xì)胞電泳時間等血液流變學(xué)的變化血液存在高黏滯性、瘀滯明顯，符合中醫(yī)“血瘀”的病理改變。此外，炎癥因子變化及心功能的改變可反映心肌缺血的造模情況［14-16］。

2.3 中醫(yī)藥治療心肌缺血痰瘀互結(jié)證

丹蔞片具有寬胸通陽、化痰散瘀的功效，常用于心肌缺血痰瘀互結(jié)證的防治。在高脂飲食聯(lián)合冠狀動脈結(jié)扎法建立的模型大鼠中，丹蔞片能改善其血液高黏滯狀態(tài)、血脂代謝紊亂，同時抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而縮小心肌梗死面積，減輕心肌損傷，對心肌缺血具有明顯保護(hù)作用［18］。此外，由川芎、丹參等多味活血行氣藥組成的痰瘀同治方可對抗痰瘀互結(jié)型小豬自由基氧化損傷，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)心肌損傷［19］。由于中藥治療心肌缺血痰瘀互結(jié)證的療效確切，且安全性好，越來越受到臨床上的重視。研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片［20］、葛蘭心寧軟膠囊［21］、化瘀祛痰方［22］等現(xiàn)代復(fù)方制劑，以及加味瓜蔞薤白半夏湯［23］、溫膽湯合四物湯［24］等經(jīng)典方劑都可有效改善心肌缺血痰瘀互結(jié)證患者的臨床癥狀。

3 氣虛血瘀證

3.1 模型制備

胸痹多為本虛標(biāo)實之證，氣能行血，氣虛則見血瘀，故氣虛之證和血瘀之象常并重，而瘀血阻滯心脈則出現(xiàn)心肌缺血的現(xiàn)象，所以氣虛血瘀證是胸痹心痛最常見的臨床證型［25］。

氣虛血瘀證的病癥結(jié)合動物模型合可采用單純結(jié)扎左冠脈前降支根部進(jìn)行制備，然而此方法建立的模型僅能反映臨床病理表現(xiàn)，缺乏病因?qū)W基礎(chǔ)，故中醫(yī)癥候并不明顯［26］。利用復(fù)合因素分階段建立心肌缺血?dú)馓撗鲎C的癥候模型及疾病模型是較為理想的病證結(jié)合的造模方法。常用的干預(yù)因素包括疲勞、饑餓、飲食控制等。秦漢等［27］建立小鼠的動物模型時，首先采用游泳+饑餓+高脂飲食的復(fù)合方法誘導(dǎo)小鼠，進(jìn)行第一階段氣虛血瘀證的模型制備，然后采用腹腔注射垂體后葉素，進(jìn)行第二階段心肌缺血的造模復(fù)制。此外，先建立心肌缺血動物模型，后經(jīng)過外界因素干預(yù)建立氣虛血瘀模型亦成功建立心肌缺血?dú)馓撗鲎C的病證結(jié)合模型［28］。不過目前研究中多采用先癥候模型后疾病模型的復(fù)制方法。

3.2 模型評價

氣虛血瘀證患者常出現(xiàn)倦怠乏力、精神萎靡等氣虛的表現(xiàn)以及唇甲青紫、舌質(zhì)紫暗等血瘀證候，故以此作為參考，對模型動物的宏觀表征進(jìn)行評價。造模后模型動物出現(xiàn)倦怠少動，活動無力，毛發(fā)枯槁、對外界刺激反應(yīng)遲鈍，以及鼻尖、口唇、掌心、舌面發(fā)生不同程度地變紫變暗等表現(xiàn)貼合氣虛血瘀癥候。此外，全血黏度及血漿黏度顯著升高可將其定性為血瘀。而心率增快，心電圖示T 波低平或倒置可將其定位在心，故心肌缺血?dú)馓撗鲎C小鼠模型復(fù)制成功［27，28］。黃爍等［26］對單純結(jié)扎冠狀動脈、控制飲食復(fù)合結(jié)扎冠狀動脈、疲勞跑步復(fù)合結(jié)扎冠狀動脈、控制飲食+疲勞跑步雙因素復(fù)合結(jié)扎冠狀動脈4 種冠心病氣虛血瘀證大鼠模型建立方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疲勞運(yùn)動復(fù)合結(jié)扎冠脈方法復(fù)制的動物模型優(yōu)于其他3 種方法，且在中醫(yī)的證候特征方面表現(xiàn)更完整，更符合臨床實際發(fā)病的原因與特征，是值得推廣的造模方法。

3.3 中醫(yī)藥治療心肌缺血?dú)馓撗鲎C

目前，氣虛血瘀證以益氣活血法為主要的治療原則，研究發(fā)現(xiàn)，在改善心功能、改善血液流變學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮、減輕炎癥反應(yīng)等方面，益氣活血類方及中藥效果顯著，且相關(guān)研究已提供循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)［29］。養(yǎng)心氏片是以養(yǎng)心理論為基礎(chǔ)的氣血雙調(diào)方。其藥理學(xué)及臨床研究表明，養(yǎng)心氏片通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)綜合調(diào)節(jié)，可改善臨床癥狀，提高運(yùn)動耐量，且應(yīng)用安全性高，是雙心疾病氣虛血瘀證的專家推薦用藥［30］。此外，保元活血顆粒［31］、參芪逐瘀湯［32］、生脈冠心方［33］等益氣活血方都可不同程度的緩解心肌缺血癥狀及氣虛血瘀癥候的嚴(yán)重程度。張淼［34］基于meta 分析和數(shù)據(jù)挖掘?qū)σ鏆饣钛街委熜募∪毖獨(dú)馓撗鲎C進(jìn)行系統(tǒng)評價，結(jié)果表明，益氣活血方可提高臨床有效率，降低患者炎癥反應(yīng)及血脂水平，而數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)黃芪、丹參、紅花、川芎是應(yīng)用最廣泛的益氣活血藥。

4 腎虛血瘀證

4.1 模型制備

冠心病心肌缺血雖病位在心，實質(zhì)卻與五臟相關(guān)，尤與腎關(guān)系密切，且此病好發(fā)于40 歲以后的中老年患者，其腎元存在不同程度的匱乏。有學(xué)者認(rèn)為腎元虧虛是胸痹發(fā)生的始動因素，而瘀血為重要實邪，二者相互交織致使疾病遷延難愈［35］。

周晟芳等［36］采用“左冠狀動脈前降支結(jié)扎方法聯(lián)合注射氫化可的松法”復(fù)制心肌缺血腎虛血瘀病證結(jié)合模型，同時，采取驚嚇、置于寒冷環(huán)境并皮下注射氫化可的松的方法制備非疾病腎虛血瘀證候模型，通過在中醫(yī)癥候方面對比，2 種模型無明顯差異，皆符合中醫(yī)臨床腎虛血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)，表明手術(shù)法聯(lián)合皮下注射氫化可的松是復(fù)制病證結(jié)合模型穩(wěn)定可行方法。而結(jié)扎左冠狀動脈前降支是公認(rèn)的心肌缺血動物模型復(fù)制方法，廣泛應(yīng)用于心臟相關(guān)模型制備。氫化可的松可導(dǎo)致內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)功能紊亂，是建立腎虛證動物模型較為穩(wěn)定的方法。且氫化可的松所使用的給藥劑量、持續(xù)天數(shù)的不同，可分別復(fù)制出腎陽虛和腎陰虛模型［37］。多項研究證實術(shù)后7 d 連續(xù)注射3.7 mg/kg的氫化可的松可制備出腎陽虛的動物模型。

4.2 模型評價

“心悸、胸悶心痛、畏寒肢冷、舌淡紫、脈弱而澀或結(jié)代”是腎虛血瘀證常見臨床表現(xiàn)，故通過心率、呼吸、體溫的變化來體現(xiàn)模型動物“心悸”、“胸悶心痛”、“畏寒肢冷”癥狀的出現(xiàn)，結(jié)果顯示腎虛血瘀證大鼠心率及體溫降低，同時呼吸頻率增快。此外，造模后大鼠一般情況較差，體質(zhì)量減少，身體狀況下降同時伴有精神不濟(jì)，易激惹，畏寒肢冷，小便失禁，活動減少。血液流變學(xué)指標(biāo)全血黏度及卡松黏度升高以及心電圖ST 段上抬T 波改變是血瘀證形成以及心肌缺血造模成功的標(biāo)志［36］。

4.3 中醫(yī)藥治療心肌缺血腎虛血瘀證

腎虛血瘀證是老年冠心病的病理基礎(chǔ)，其兩個致病因素相互影響，腎虛導(dǎo)致血瘀，血瘀又加重腎虛，故治療時當(dāng)補(bǔ)腎祛瘀，標(biāo)本兼顧［38］。滋腎活血方是以首烏、桑葚、括樓、薤白、三七等組成，是國醫(yī)大師劉志明治療冠心病腎虛血瘀證的臨床經(jīng)驗方，以“補(bǔ)腎、通陽、祛邪”三法為治療總則，效如桴鼓。劉如秀等［39，40］研究發(fā)現(xiàn)，滋腎活血方可抗炎、穩(wěn)定動脈斑塊、緩解心肌缺血的嚴(yán)重程度，同時，其可調(diào)節(jié)心肌組織蛋白組學(xué)變化，改善能量代謝、保護(hù)細(xì)胞骨架，從而達(dá)到改善腎虛血瘀證冠心病心肌缺血的臨床作用。另外，復(fù)方三七護(hù)脈湯［41］、愈本通冠丸［42］、益腎活血解毒湯［43］都可緩解冠心病穩(wěn)定型心絞痛腎虛血瘀證患者的臨床癥狀，同時降低血脂水平及炎癥反應(yīng)。

5 心肌缺血動物模型問題分析

目前，病證結(jié)合的造模方法多樣，然而中醫(yī)動物模型所存在的問題無法忽略，心肌缺血病證結(jié)合模型的復(fù)制率較低，且手術(shù)或藥物干預(yù)與真實發(fā)病具有較大的差距。此外，盡管病證結(jié)合動物模型能部分體現(xiàn)西醫(yī)臨床特點(diǎn)及中醫(yī)癥候表現(xiàn)，然而與臨床患者仍具有較大的差異。中醫(yī)講究四證合參，尤重視舌相和脈相的診察，然而由于動物形體的特殊性，尚不能將舌脈作為懂動物模型中醫(yī)癥候的辯證依據(jù)。其次，中醫(yī)對胸痹心痛證型特點(diǎn)描述精準(zhǔn)，主次分明，然而目前對動物模型的癥候評價無法細(xì)化至此，一些簡單的評價指標(biāo)。另外，部分中醫(yī)證型的造模方法尚不清晰且對于虛實區(qū)分尚不明確，例如，垂體后葉素和寒冷因素聯(lián)合造模的方法既可用于心肌缺血寒凝血瘀的模型復(fù)制，也應(yīng)用于心肌缺血陽虛血瘀的模型復(fù)制［44］，此外，高脂飲食飼養(yǎng)即用于痰濁內(nèi)阻型的實證模型制備，也應(yīng)用于脾虛痰阻型的虛實夾雜模型［45］。

6 小結(jié)

心肌缺血是誘發(fā)心律失常，心臟功能障礙，心肌梗死和猝死的主要原因，是現(xiàn)代心血管研究中最廣泛的研究課題之一。動物模型作為人類疾病研究的重要工具，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中［46］。能夠復(fù)制出與人類疾病相似度高、重復(fù)性好的動物模型是動物實驗研究到臨床研究中不可缺少的一步［47］。病證結(jié)合動物模型既體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治的特點(diǎn)，又能得到西醫(yī)對疾病病理組織變化和診斷評價的支持，使得中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)化、理論化、客觀化，是實現(xiàn)中醫(yī)現(xiàn)代化的重要工具［48］。

心肌缺血的疾病模型復(fù)制途徑很多，開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支是心肌缺血應(yīng)用最為廣泛復(fù)制方法，且操作可控、價格低廉、重復(fù)性強(qiáng)，是心血管疾病研究者的首選［49］。此外，球囊介入損傷法以及冠狀動脈周圍安放Ameroid 縮窄器法也可進(jìn)行心肌缺血模型復(fù)制［50］。藥物誘導(dǎo)法常用的藥物有垂體后葉素和異丙腎上腺素，后者可建立急性和慢性模型［51］。而心肌缺血的中醫(yī)癥候模型可通過外界因素模擬中醫(yī)發(fā)病病因如寒冷、勞累、高脂飲食等，同時，藥物干預(yù)也可形成中醫(yī)癥候表現(xiàn)。病證結(jié)合模型的評價模式多從“因-脈-證-治”方面建立宏觀、微觀多種形式相輔相成［52］。由于目前心肌缺血病證結(jié)合模型存在問題較多，仍需要不斷探索及完善，努力彌補(bǔ)中醫(yī)臨床客觀化指標(biāo)不足的缺點(diǎn)，使之被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)同，促進(jìn)中醫(yī)藥走向世界［53］。