蚊蟲腸道菌群的多樣性與應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 彪，康 迅，王悅鑫，吳興勇，符慧敏，康 樂，夏乾峰

（1. 海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199；2. 海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；3.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

蚊蟲與人類生活密切相關(guān)，是非常重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲，通過叮咬人和脊椎動(dòng)物，可傳播登革病毒（dengue virus）、寨卡病毒（zika virus）、瘧原蟲（Plasmodium）等多種病原體［1?5］，給全世界的公共衛(wèi)生防疫帶來巨大的挑戰(zhàn)。腸道作為蚊蟲對(duì)病原微生物的首道重要防線，定植著大量微生物群，包括浮游生物（水藻類等）、細(xì)菌與真菌等，而目前在對(duì)蚊蟲腸道微生物的研究中，受到廣泛關(guān)注的是細(xì)菌［6］。自2007 年人類微生物組計(jì)劃（HMP，2007 年NIH）啟動(dòng)以來，越來越多的研究表明，菌群在與宿主的互作共生過程中，在多方面與宿主的生命活動(dòng)存在著密切的聯(lián)系［7，8］。本文通過對(duì)蚊蟲腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的多樣性、影響因素，腸道菌群對(duì)蚊蟲的生命活動(dòng)及媒介效能的影響研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 蚊蟲腸道菌群的多樣性

蚊蟲在幼蟲羽化為成蟲前，主要孽生在積水的環(huán)境中，不同的蚊種，對(duì)孽生水質(zhì)的要求各有差異，成蟲其孽生環(huán)境因可飛行相比較幼蟲而言變得相對(duì)復(fù)雜多變［9］。從食物獲取的來源分析，幼蟲以單細(xì)胞生物、有機(jī)碎屑和小型無脊椎動(dòng)物為食，雄蚊則通常以花粉蜜腺為食，而成年雌蚊則以吸食脊椎動(dòng)物血液作為食物的主要來源［10，11］，這也為產(chǎn)卵提供了必要的營養(yǎng)，而此相對(duì)特殊的食物鏈也為病原生物在宿主之間進(jìn)行傳播提供了必要的途徑［12］。絕大部分蚊蟲定植在腸道的菌群主要是通過飲食從環(huán)境中獲得，僅少部分是直接通過垂直傳播途徑獲得［13，14］，此觀點(diǎn)獲得多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)的支持，第一，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蚊子幼蟲孵化時(shí)腸道內(nèi)沒有細(xì)胞外菌群；其次，對(duì)蚊蟲腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，在幼蟲腸道鑒定出的大多數(shù)菌群與其水生棲息地中存在的群落高度重疊；第三，蚊蟲擁有高度可變的腸道群落［6，15?17］。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)蚊蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)由體外細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)轶w外細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)合宏基因組學(xué)測序技術(shù)的研究［18］，該技術(shù)極大地促進(jìn)了對(duì)不能體外培養(yǎng)的菌群調(diào)查研究。目前除罕見難以鑒別的序列外，蚊蟲已鑒定的腸道細(xì)菌群落多樣性與脊椎動(dòng)物相比，蚊蟲腸道中的細(xì)菌群落多樣性相對(duì)較低（約200 種）［12］，但單從蚊蟲的腸道細(xì)菌群落多樣性與其它從環(huán)境中獲得腸道菌群的代謝性昆蟲相比，其腸道菌群構(gòu)成還是很可觀［13］。不同的蚊種，對(duì)生境的喜好各有不同，伊蚊幼蟲孽生以民房周邊的容器積水（缸、罐、盆、竹筒、樹洞、輪胎等）為主，阿蚊幼蟲則孽生在室內(nèi)、畜舍、廁所積水內(nèi)生棲居多，按蚊幼蟲孽生以遮陰，水質(zhì)清涼的稻田、沼澤、洼地積水等環(huán)境為主，而庫蚊則孽生在房屋附近污水或水缸中，成蟲因其能飛行，以及需要尋找合適的產(chǎn)卵環(huán)境，其孽生環(huán)境范圍較廣［10，11，19］。研究表明，在幼蟲期和成蟲期其腸道中，大多數(shù)已鑒定的菌群以革蘭氏陰性需氧菌或兼性厭氧菌為主，主要隸屬4 個(gè)優(yōu)勢(shì)門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes） 和 放 線 菌 門（Actinobacte?ria）［6，15?17，20?23］，定植的常見菌株包括擬桿菌門的伊麗莎白菌（Elizabeth）、金黃桿菌（Chryseobacterium），變形菌門的假單胞菌（Pseudomonadaceae）、沙雷氏菌（Serratia）、沃爾巴克氏體菌（Wolbachia）、腸桿菌（Enterobacter）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter），在伊蚊與按蚊的腸道中還普遍發(fā)現(xiàn)Asaia 菌與泛菌（Pan?toea）的存在［16，24，25］。研究發(fā)現(xiàn)，同種蚊蟲的幼蟲與成蟲因生境不同以及生長發(fā)育的影響，多數(shù)情況下，幼蟲中的細(xì)菌物種多樣性始終高于成蟲［6，15，17，22］，而實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的蚊種與野外采集的同一蚊種相比，其腸道菌群多樣性更低［15，16，20］，并且野外采集的蚊種，雌蚊腸道的菌群多樣性要高于雄性［24］。在對(duì)多個(gè)采樣點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，同一種或不同物種的個(gè)體在同一地點(diǎn)和相同采集日期之間的腸道菌群組成比來自不同地點(diǎn)和相同采集日期的個(gè)體腸道菌群更為相似［6，16，22］，但目前并沒有證據(jù)證明在相同的采樣區(qū)域，同種或不同種蚊種的幼蟲與成蟲的腸道就存在某特定的“核心”菌群［26］。大多數(shù)的研究結(jié)果不約而同地指向不同蚊種之間和蚊蟲內(nèi)部的細(xì)菌多樣性因采集地點(diǎn)的不同而有較大的差異，而同一地點(diǎn)各蚊蟲腸道可有相似的菌群結(jié)構(gòu)［6，16，17，21，22，27?29］，并且蚊蟲從環(huán)境中獲取的 腸道菌群與其他昆蟲和脊椎動(dòng)物的相關(guān)研究結(jié)論相似［30］，這一系列研究說明蚊蟲所處的生境對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成起著主導(dǎo)性作用。在特定地區(qū)，影響腸道菌群組成的次要因素還包括蚊蟲進(jìn)食食物的pH 值、碳水化合物的含量、代謝途徑等均能對(duì)腸道菌群的結(jié) 構(gòu) 產(chǎn) 生 影 響［20，31，32］，腸 道 菌 群 還 隨 著 年 齡 的 變 化而發(fā)生著變化，這也許是腸道菌群跟蚊蟲競爭糖源相關(guān)［33，34］。而間日瘧原蟲可以通過調(diào)節(jié)按蚊腸道的鐵代謝來引起腸道菌群的早期抑制［34］，從而引起腸道菌群的改變。

2 腸道菌群對(duì)蚊蟲生長發(fā)育的影響

腸道菌群在蚊蟲的生長發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色［7，8］，通過不同方式給蚊蟲提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)［35，36］。早期有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自然水生環(huán)境中的菌群數(shù)量減少時(shí)，蚊子在幼蟲時(shí)期表現(xiàn)出更高的死亡率或延遲到蛹期的生長［22］，在對(duì)埃及伊蚊（Aedes aegypti）自蟲卵培育開始，通過無害化構(gòu)建無菌幼蟲，在與正常養(yǎng)殖的對(duì)照組相比較，也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組不生長，且一齡幼蟲在幾天后死亡，在通過人為地添加正常的菌群或者酵母（Saccharomyces）后，可以恢復(fù)其正常的生長［15，37］。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)只有喂食活菌才能支持埃及伊蚊的生長發(fā)育，這在其它的幾種蚊種的實(shí)驗(yàn)中也得到證明［15，17，22］，另外還發(fā)現(xiàn) 腸 道 細(xì) 菌 對(duì) 幼 蟲 的 蛻 皮 也 是至關(guān)重要［38］。而在最近的一項(xiàng)研究則表明，在完全沒有菌群的培養(yǎng)生境下，給予正常的營養(yǎng)物質(zhì)，依舊能將埃及伊蚊從卵培養(yǎng)到成蚊并繼續(xù)培養(yǎng)到下一代，無菌蚊蟲發(fā)育正常，僅僅在發(fā)育的時(shí)間存在延遲［39］，在給予按蚊的食物中提高細(xì)菌的豐度能加速幼蟲的生長發(fā)育［31］，這些證據(jù)表明腸道菌群的次級(jí)代謝產(chǎn)物有可能是調(diào)節(jié)蚊蟲生長發(fā)育非常重要的影響因素。研究還發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis）以色列亞種制劑則有抑制搖蚊生長發(fā)育的作用［40］，而埃及伊蚊的腸道細(xì)菌能影響其對(duì)血粉的消化，其機(jī)制考慮是沙雷氏菌與腸桿菌通過產(chǎn)生溶血酶，以此增進(jìn)蚊蟲吸血后營養(yǎng)的吸收［41］。雖然到目前為止，絕大部分腸道菌群影響蚊蟲生長發(fā)育的具體機(jī)制沒有被深入研究鑒定，但通過這一些列的表觀現(xiàn)象還是能說明，腸道菌群及次級(jí)產(chǎn)物在蚊蟲的生命各個(gè)階段起著不可或缺的作用。

3 腸道菌群對(duì)蚊蟲免疫調(diào)控的影響

媒介效能是蚊蟲感染病原體后，將病原復(fù)制增殖并傳播給其它宿主的能力［42］。腸道菌群與蚊蟲宿主長期保持著寄生或共生的關(guān)系，菌群在自身的生命活動(dòng)過程中，通過菌群自身及其次級(jí)產(chǎn)物從多途徑影響著蚊蟲的媒介效能，在蚊蟲免疫系統(tǒng)的發(fā)展和功能中扮演著重要的角色［43，44］。研究表明腸道菌群通過感染蚊蟲能激活其中腸免疫基因的表達(dá)［33］，而按蚊被感染不同的沙雷氏菌種后，其對(duì)瘧原蟲感染的效能也有所變化［45］，而沙雷氏菌還可以促進(jìn)登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒（Chikungu?nya Virus）對(duì)蚊蟲的感染［46?48］，目前研究考慮其機(jī)制為沙雷氏菌通過其分泌的多肽結(jié)合埃及伊蚊中腸表面的抗增值蛋白，以此促進(jìn)蚊蟲對(duì)登革病毒易感，而芳香沙雷氏菌通過分泌P40 蛋白，再與蚊蟲中腸細(xì)胞的線粒體上的孔蛋白相結(jié)合，從而抑制蚊蟲的免疫力，促進(jìn)基孔肯雅病毒的感染［46，47］。

被變形桿菌（Proteus）感染后的埃及伊蚊，其中腸上皮細(xì)胞的多種抗菌肽基因可被激活表達(dá)，以此能增強(qiáng)蚊蟲對(duì)病毒的免疫力［49］。更有意思的發(fā)現(xiàn)是色素細(xì)菌（Chromobacterium）不僅能抑制腸道內(nèi)多種細(xì)菌的生長［50］，還有著廣泛的抗病原體活性，它不僅可顯著地減少岡比亞按蚊（Anopheles gambi?ae）對(duì)瘧原蟲的感染，還能減少登革病毒對(duì)埃及伊蚊的感染，但具體的作用機(jī)制目前并沒有太多的深入研究［51］。岡比亞按蚊在進(jìn)食含有抗生素的血液后，其對(duì)瘧原蟲免疫力有所降低［36］。Moreira 研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)告沃爾巴克氏體通過感染埃及伊蚊，能降低登革病毒和基孔肯雅病毒（CHIKV）感染埃及伊蚊的能力［52］，而近期報(bào)道也表明，沃爾巴克氏體能顯著的抑制寨卡病毒感染埃及伊蚊［53］，已報(bào)道的沃爾巴克氏體對(duì)埃及伊蚊免疫調(diào)控的途徑是，沃爾巴克氏體通過感染埃及伊蚊，激活蚊蟲的ROS?Tall 通路，以此來增強(qiáng)埃及伊蚊的免疫力，減低埃及伊蚊對(duì)病原體及寄生蟲的易感性［54］。該菌在通過感染按蚊后，可以激活按蚊的免疫系統(tǒng)，也能顯著抑制瘧原蟲卵囊的形成，達(dá)到減少瘧原蟲的傳播［55］。沃爾巴克氏體為母系遺傳［56］，其在昆蟲的生殖過程中所表現(xiàn)出的胞質(zhì)不親和性（cytoplasmic incompatibil?ity，CI）是目前沃爾巴克氏體運(yùn)用到昆蟲種群控制的基礎(chǔ)，基于CI 的蚊種節(jié)育技術(shù)已經(jīng)在多地進(jìn)行野外實(shí)驗(yàn)［57］，并證明該方法可以有效地控制白紋伊蚊種群數(shù)［58］。而另外的團(tuán)隊(duì)通過按蚊腸道感染厚壁菌門的球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus），利用該菌其合成的Mtx 與Bin 毒力蛋白，可以高效地創(chuàng)傷按蚊，從而達(dá)到對(duì)按蚊種群的控制［59］，達(dá)到生物控蚊防傳染病的目的。而在生物滅蚊的另一個(gè)被廣泛關(guān)注的是利用Xenorhabdus屬與Photorhabdus屬的不同菌種來實(shí)現(xiàn)生物滅蚊［60，61］，目前已發(fā)現(xiàn)24 個(gè)Xenorhabdus菌種與5 個(gè)Photorhabdus菌種具備殺蚊蟲的特性，其殺蚊途徑考慮是這些菌種通過感染蚊蟲后，細(xì)菌的相關(guān)基因編碼低分子量蛋白質(zhì)、次級(jí)毒素復(fù)合物和具有殺蟲劑活性的代謝物，使蚊種患病受傷甚至致死，從而達(dá)到滅蚊，切斷病原傳播途徑，目前多項(xiàng)研究已經(jīng)證明了它們對(duì)滅蚊具有較強(qiáng)的有效性，且對(duì)環(huán)境與人類友好［62?68］。這一系列的研究結(jié)果為將來開發(fā)出更多用于滅蚊的化合物和生物制劑提供了研究基礎(chǔ)。

4 展望

蚊蟲對(duì)傳染病的傳播依舊是目前全球公共衛(wèi)生安全所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一，而滅蚊仍是應(yīng)對(duì)的最佳選擇。然而傳統(tǒng)的化學(xué)防蚊，其對(duì)人居環(huán)境不友好以及快速的產(chǎn)生耐藥蚊蟲，使找到新的控蚊手段顯得更為迫切需要。近年來，通過對(duì)蚊蟲、腸道菌群以及病原三者間互作關(guān)系深入研究成果的展現(xiàn)，為生物防蚊以及防媒介傳染病提供了新的思路。伴隨著高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、宏基因組學(xué)等相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，極大地推動(dòng)了蚊蟲與腸道菌群的相關(guān)研究，并展現(xiàn)出腸道菌群在蚊蟲免疫調(diào)節(jié)、生物媒介、種群控制、生長發(fā)育等多方面強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)作用，從多方面揭示了腸道菌群對(duì)蚊蟲影響的機(jī)制。為進(jìn)一步闡明蚊媒介傳染病的傳播因素以及在生物滅蚊、防控媒介傳染病的應(yīng)用開拓了新方向。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉彪：撰寫文章；康迅：查找文獻(xiàn)，提供參考建議，修改文章；王悅鑫、吳興勇、符慧敏：修改文章；康樂、夏乾峰：對(duì)文章撰寫提供指導(dǎo)建議。