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    新風(fēng)膠囊通過調(diào)控miR?126?VEGF/PI3K/AKT 信號通路改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血瘀狀態(tài)的作用機制研究

    2022-04-20 12:04:30林章英黃傳兵張皖東王桂珍陳瑞蓮
    關(guān)鍵詞:血瘀內(nèi)皮細胞血小板

    林章英,汪 元,黃傳兵,張皖東,王桂珍,陳瑞蓮,龔 雪

    (1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病一科,安徽 合肥 230031)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種由于關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)慢性炎癥及免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致靶器官損傷為主要特點的自身免疫性疾病,可嚴重影響患者的生活質(zhì)量,臨床上主要表現(xiàn)為骨及關(guān)節(jié)軟骨的破壞,血管炎及血瘀狀態(tài)等[1,2]。RA的基本病理改變?yōu)榛ぱ?、血管翳和血管炎等的形成,與患者體內(nèi)高凝狀態(tài)、血管內(nèi)皮增生、血小板異常升高等密切相關(guān)。RA 屬于“尪痹”范疇,中醫(yī)認為久病必瘀,瘀血是導(dǎo)致本病纏綿難愈重要原因,瘀血為RA 的主要病因與病理產(chǎn)物,同時又作為其主要的發(fā)病機制貫穿在RA 疾病發(fā)生、發(fā)展過程。

    本研究團隊認為脾虛濕盛、氣血虧虛、痰瘀互結(jié)是RA 的基本病機,提出“益氣健脾通絡(luò)”的治療方法,創(chuàng)制新風(fēng)膠囊(Xinfeng Capsule,XFC)運用于臨床,療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn),RA 患者體內(nèi)普遍存在高凝狀態(tài)[2],而XFC 可能通過抑制異?;罨腘F-κB 通路,升高抑炎因子白細胞介素-10(interleu?kine-10,IL-10)的水平,降低致炎因子IL-17、IL-6 的水平,調(diào)節(jié)了機體細胞因子網(wǎng)絡(luò),從而使RA 患者體內(nèi)的部分凝血酶原時間(activated partial thrombo?plastin time,APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、凝血酶時間(thrombin time,TT)、D 二聚體(d-dimer,D-D)、纖維蛋白原(fibrinogen,F(xiàn)BG)、血小板(platelet,PLT)、血小板激活因子、血小板活化因子-乙酰水解酶趨向新的一種平衡狀態(tài),進而改善RA 患者血瘀狀態(tài)[3]。同時我們在臨床中發(fā)現(xiàn)RA 患者中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia growth factor,VEGF)表達水平增加,且與疾病活動密切相關(guān)[4]。VEGF 是一種極為重要的促血管生成因子,可與滑膜血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合,促進滑膜血管新生和血管翳形成,增加血管通透性和炎性因子的釋放[5],從而參與RA 血瘀病理進程。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)/絲-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)信號通路與微血管損傷及血管新生的發(fā)生機制有關(guān)[6],是VEGF 下游信號通路中極其重要的組成部分,可在血管生成中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用,過表達PI3K或AKT 能誘導(dǎo)廣泛的新血管生成及增大已存在的血管[7],與RA 患者的血瘀狀態(tài)密切相關(guān)。而miR-126 是血管新生信號通路中的正向調(diào)節(jié)因子,過表達miR-126 可激活VEGF/PI3K/AKT 信號通路,增強血管通透性,促進滑膜血管翳形成[8]。本文通過觀察miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號通路的變化,探討XFC 改善RA 血瘀狀態(tài)的可能機制。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    選擇60 例就診于我院風(fēng)濕免疫科住院的RA患者,住院時間為2020 年5~12 月。其中男性23例,女性37 例,年齡27~70 歲,病程最短1 年,最長23 年。依據(jù)隨機數(shù)字表法分為XFC 治療組30 例和來氟米特(LEF)對照組30 例。兩組在性別、年齡、病程方面比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已獲得安徽省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者已簽訂知情同意書。

    1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

    參照2010 年美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同提出的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)[9],總分≥6 分可診斷為RA。

    1.3 血瘀證癥狀的評分標(biāo)準(zhǔn)

    中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)按照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定了“血瘀證癥狀分級量化表”[10]。將關(guān)節(jié)刺痛、唇色、舌質(zhì)、脈象、皮下瘀斑、肌膚甲錯根據(jù)不同程度按照正常、輕、中、重,分別計為0、1、2、3 分。

    1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

    (1)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)符合活動期診斷標(biāo)準(zhǔn)者;(3)年齡18~75 歲;(4)曾經(jīng)使用非甾體類抗炎藥及慢作用抗風(fēng)濕藥的患者,須停藥3 個月以上才可入組。(5)自愿簽署知情同意書。

    1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

    (1)不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者;(2)合并有嚴重疾病以及嚴重關(guān)節(jié)外表現(xiàn);(3)精神異常的患者;(4)孕婦或哺乳期女性;(5)被研究者認為不宜進行此項臨床試驗者。

    1.6 治療方案

    治療組予以口服新風(fēng)膠囊(3 粒,3 次/d),對照組予以口服來氟米特片(1 粒,1 次/d),均連續(xù)服用30 d。兩組患者在研究中可根據(jù)情況使用非甾體消炎止痛藥,但要避免使用免疫抑制劑及治療RA 的其他中成藥。

    1.7 實驗室指標(biāo)檢測

    D-D、FBG、TT、APTT、PT、PLT、血小板平均體積(mean platelet volume,MPV)、血小板分布寬度(platelet distribution width,PDW)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrulli?nated peptide,CCP)均由安徽省中醫(yī)院檢驗中心檢測。

    1.8 ELISA 檢測血清

    按照ELISA 試劑盒說明書操作測定VEGF、PI3K、AKT、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、IL-6 和IL-35 水平。

    1.9 實時熒光定量PCR 法檢測miR-126

    根據(jù)實時熒光定量PCR 試劑盒說明書檢測miR-126 含量。

    1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以xˉ±s或者中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,兩組比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗,相關(guān)性分析采用spearman 分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組治療前后血瘀癥狀積分比較

    與治療前相比,兩組治療后血瘀癥狀、體征明顯改善(P<0.05~0.01);與LEF 組治療后相比,XFC 組治療后關(guān)節(jié)刺痛、舌質(zhì)、皮下瘀斑、血瘀總積分明顯改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 兩組治療前后血瘀癥狀積分比較(分,n=30)Tab 1 Comparison of blood stasis symptom score between the two groups before and after treatment (score,n=30)

    2.2 兩組治療前后炎癥指標(biāo)、細胞因子比較

    與治療前比較,治療后兩組CRP、ESR、RF、CCP、IL-6、TNF-α 等指標(biāo)均顯著下降,IL-35 顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與LEF 組比較,XFC 組IL-35 治 療 后 較LEF 組 升 高 明 顯,ESR、TNF-α、IL-6 降低明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表2。

    表2 兩組治療前后炎癥指標(biāo)、細胞因子比較(n=30)Tab 2 Comparison of inflammatory indicators and cytokines between the two groups before and after treatment (n=30)

    2.3 兩組治療前后血瘀相關(guān)指標(biāo)比較

    與治療前相比,治療后兩組的D-D、FBG、PLT下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),APTT、TT、PT、MPV、PDW 無明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與LEF 組相比,XFC 組D-D、FBG、PLT 下降更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

    表3 兩組治療前后血瘀相關(guān)指標(biāo)比較(n=30)Tab 3 Effects of the two groups on blood stasis related indexes in RA patients (n=30)

    2.4 兩組治療前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比較

    與治療前相比,兩組治療后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與LEF 組 治 療 后 相 比,XFC 組 治 療 后VEGF、miR-126、PI3K、AKT 水平降低更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表4。

    表4 兩組治療前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比較(n=30)Tab 4 Effects of the two groups on miR-126,VEGF,PI3K and AKT in RA patients (n=30)

    2.5 RA 患者血瘀指標(biāo)與細胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相關(guān)性分析

    RA 患者血瘀總積分與CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 成正相關(guān),與IL-35 表達成負相關(guān)(P<0.05,P<0.01);D-D與CRP、ESR、CCP、IL-6、VEGF 成 正 相 關(guān)(P<0.05,P<0.01);FBG 與CRP、CCP、VEGF、PI3K、AKT 成正相關(guān)(P<0.05,P<0.01);PLT 與CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、VEGF、PI3K、AKT成正相關(guān)(P<0.01);MPV 與PI3K 成負相關(guān)(P<0.01);PDW 與CCP 成負相關(guān)(P<0.05)。見表5。

    表5 血瘀指標(biāo)與細胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相關(guān)性分析(r)Tab.5 Correlation analysis of blood stasis indicators with cytokines,miR-126,VEGF,PI3K and AKT(r)

    3 討論

    RA 屬于中醫(yī)“歷節(jié)病”、“風(fēng)濕”、“鶴膝風(fēng)”、“白虎病”的范疇,其早見于《素問·痹論》,與風(fēng)、寒、濕三氣有關(guān)。而RA 的發(fā)病不僅與風(fēng)寒濕等外感邪氣有關(guān),與內(nèi)因也有關(guān)系,《醫(yī)宗金鑒·痹癥總括》指出:“脾虛謂氣虛之人病諸痹也”。指出脾氣虧虛,正氣不足,是RA 血瘀形成主要病理基礎(chǔ),本團隊在臨床實踐中將“從脾論治”應(yīng)用于臨床,研制出新風(fēng)膠囊治療RA,新風(fēng)膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣四位藥物組成。劉赟等[11]研究發(fā)現(xiàn),黃芪注射液的早期干預(yù),能調(diào)節(jié)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物、血小板的水平,改善微循環(huán)障礙。薏苡仁新芽提取物可以使PI3K/AKT 通路失活,致使細胞周期延長和細胞凋亡,減少血管新生[12]。同時,薏苡仁注射液可下調(diào)實驗性腹腔粘連大鼠血管內(nèi)皮細胞因子水平表達,從而進一步抑制纖維蛋白原釋放,同時可降低促炎細胞因子IL-1、TNF-α 的表達水平[13]。雷公藤甲素可抑制血小板的病理性聚集,與此同時也有調(diào)節(jié)機體血瘀狀態(tài)的作用[14]。蜈蚣可使小鼠TT、APTT、PT 明顯延長[15],改善血瘀狀態(tài)??v觀全方,XFC 具有健脾化濕、活血通絡(luò)之效,對RA 血瘀狀態(tài)有明顯療效。

    現(xiàn)階段血瘀證發(fā)病機理尚未完全研究清楚,但多數(shù)研究者認為其具體表現(xiàn)為高黏滯狀態(tài)和高凝狀態(tài),而凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)是判定血瘀證的重要實驗室指標(biāo)[16-18]。因此,凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)有助于在RA 疾病早期發(fā)現(xiàn)患者血瘀狀態(tài)的改變從而指導(dǎo)臨床選方用藥,更好地延緩RA 患者的疾病進展。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)[19],與正常組比較,RA患者外周血中D-D、FBG、PLT 顯著升高(P<0.01),TT 延長(P<0.01),RA 患者外周血中凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)與臨床癥狀體征、DAS28、疾病活動性指標(biāo)成正相關(guān),因此RA 患者血瘀狀態(tài)的預(yù)防和改善有重要臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn),XFC 組可以改善疾病活動性指標(biāo)、血瘀癥狀體征,降低血瘀癥狀總評分、D-D、FBG、PLT(P<0.05,P<0.01)水平。與LEF 組相比,XFC 組治療后降低更明顯(P<0.05,P<0.01),提示新風(fēng)膠囊在緩解RA 患者活動的同時,還可改善其血瘀狀態(tài)。

    RA 血瘀狀態(tài)的機制可能與血管新生及血管翳的形成密切相關(guān)。VEGF 是血管新生的誘導(dǎo)介質(zhì)[20],是血管翳形成的關(guān)鍵因子。同時,VEGF 在其下游PI3K-AKT 的信號級血管新生中,VEGF 可作為血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原,促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移,同時還可以促進間質(zhì)膠原酶分泌,降解細胞基質(zhì)[21]。PI3K/AKT 作為VEGF 的下游信號通路,可經(jīng)由PI3K-AKT 下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2 和叉頭轉(zhuǎn)錄因子促進內(nèi)皮細胞增殖和血管新生[22,23],參與血瘀狀態(tài)的發(fā)成。miR-126 可通過調(diào)控VEGF 表達對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[24],促進血管新生,與RA 血瘀狀態(tài)密切相關(guān)。同時,miR-126 可通過影響PIK3R2 基因,從而調(diào)控PI3K/AKT 信號通路而發(fā)揮其在血管新生、細胞增殖、分化遷移等功能[25]。有研究指出在體外實驗中,IL-35 能抑制VEGF 誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞遷移、成管及血管生成素2 的分泌[26]。TNF-α 可以促進內(nèi)皮細胞黏附白細胞,進而刺激內(nèi)皮細胞分泌炎性物質(zhì),從而激活凝血系統(tǒng),抑制纖溶[27],且TNF 與其受體結(jié)合以后可以影響VEGF的增殖與遷移,影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血管增生水平,導(dǎo)致骨與軟骨的損傷[28]。IL-6 促進RA 血管增生 主 要 是 通 過 與TNF-α、IL-1 及IL-17 的協(xié)同作用而增加VEGF 及CCL28 的表達[29]。本次研究發(fā)現(xiàn),RA 患者血瘀總積分、血瘀相關(guān)指標(biāo)與TNF-α、IL-6、IL-35、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 均具有相關(guān)性。說明RA 患者的血瘀狀態(tài)與miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號通路及炎癥因子密切相關(guān)。XFC治療后,疾病活動性指標(biāo)、miR-126、VEGF、PI3K、AKT、TNF-α、IL-6、D-D、FBG、PLT 水平明顯下降(P<0.01),IL-35 顯著升高(P<0.01),提示XFC 可能對miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號通路具有抑制作用,下調(diào)促炎因子IL-6、TNF-α 水平,上調(diào)抑炎因子IL-35 水平,從而降低D-D、FBG、PLT 水平,緩解RA 血瘀狀態(tài)。

    綜上所述,miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號通路的異?;罨cRA 患者的血瘀狀態(tài)密切相關(guān),XFC 可以改善RA 患者的血瘀狀態(tài),其機制可能是通過抑制miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號通路的活化,調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò),從而達到延緩或抑制血瘀狀態(tài),減少關(guān)節(jié)病變。本研究僅進行了臨床研究,將在今后的實驗中進一步開展細胞實驗加以驗證,以提高結(jié)論的可靠性。

    作者貢獻度說明:

    林章英:完成數(shù)據(jù)采集,分析數(shù)據(jù),撰寫論文等;汪元:設(shè)計實驗,并對論文提出指導(dǎo)意見;黃傳兵、張皖東、王桂珍、陳瑞蓮、龔雪:參與研究設(shè)計和研究實施及收集數(shù)據(jù)。

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