miRNA 作為阿爾茨海默病早期診斷的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

王歡，羅興梅

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常見的癡呆形式，具有兩個神經(jīng)病理特征：由淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)肽組成的細(xì)胞外老年斑和由異常過度tau蛋白磷酸化(Ptau)組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。為了明確AD的臨床診斷，許多研究集中在神經(jīng)影像學(xué)和腦脊液和外周血中分子的生物標(biāo)志物。其中正電子發(fā)射斷層掃描(PET-CT)使用碳-11標(biāo)記的匹茲堡化合物B(11C-PIB)對Aβ成像表明，Aβ沉積是一個緩慢的病理過程，可在二十年的時間內(nèi)緩慢發(fā)生。腦脊液中的Aβ和Ptau水平是臨床診斷AD的生物標(biāo)志物，具有很高的準(zhǔn)確性，但通過腰椎穿刺取樣腦脊液是侵入性的，需要熟練的訓(xùn)練,且老年人群接受度差。相比之下，血液取樣方便簡捷，日常可廣泛開展。但其特異性及可靠性目前仍缺乏大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。因此AD的外周特異性標(biāo)記物的檢測，特別是在早期或臨床前階段，仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。最近的一些研究報告了來自血液中的各種分子，即潛在的血液的AD生物標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。本文就血液循環(huán)中miRNA的最新進(jìn)展及其在AD的早期鑒定和評估中可能的作用進(jìn)行綜述。

1 AD的診斷

有研究顯示2018～2019年全球范圍內(nèi)AD患者人數(shù)超過5 500萬。隨著患病率的增加，與AD相關(guān)的社會、經(jīng)濟(jì)和情感成本的全球影響是驚人的，人們對更好的AD治療方式的需求是毋庸置疑的，目前批準(zhǔn)上市的藥物只是針對癥狀治療，而沒有干預(yù)潛在的疾病發(fā)病機(jī)制過程，療效并不令人滿意，特別是對于中度以上的癡呆患者。盡管對AD的分子發(fā)病機(jī)制的理解取得了顯著進(jìn)展，但在十多年的時間里，全球還沒有開發(fā)出明顯有效的臨床治療措施。針對AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)有了多項(xiàng)指南，且最新的指南也將腦脊液中的Aβ和Ptau列入了特異性生物標(biāo)記物的范疇，但由于臨床采樣困難，AD診斷的敏感性和特異性仍然低于人們所期望的水平。目前已有的臨床檢查、神經(jīng)心理測試、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室評估等方法不足以用于疾病的早期階段及臨床前階段，無法啟動成功的預(yù)防或有效的治療措施。臨床上，認(rèn)知障礙的程度多用簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)和蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)以及臨床癡呆評分(CDR)問卷等來評估。但實(shí)際臨床的癡呆分級還要參考其他的因素，如日常生活能力量表(ADL)以及神經(jīng)精神量表評分(NPI)等等。著名的Braak分級是根據(jù)神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)變性順序分為6個階段：Ⅰ橫嗅皮層區(qū)或皮周皮層區(qū)，Ⅱ內(nèi)嗅皮層，Ⅲ海馬區(qū)，Ⅳ杏仁核，Ⅴ丘腦、屏狀核，Ⅵ主要為運(yùn)動感覺區(qū)、視覺皮層。Ⅰ～Ⅱ過度內(nèi)嗅區(qū)階段，Ⅲ～Ⅳ邊緣區(qū)階段，Ⅴ～Ⅵ新皮層階段。目前神經(jīng)影像在AD診斷中也起著關(guān)鍵作用，如單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描或PET-CT的功能成像，它們都是很好的檢測手段，但由于價格昂貴，需要專業(yè)的設(shè)備，因此也很難普及。腦脊液中Aβ和tau蛋白過度磷酸化水平已被納入AD診斷中的特異性標(biāo)志物，然而它們需要一種侵入性的程序來獲取腦脊液，很多患者由于年齡過大，腰椎穿刺困難，也難以在臨床廣泛開展。因此，探討外周生物標(biāo)志物，如血液或尿液特異性標(biāo)志物，將更容易應(yīng)用于臨床早期診斷，也是現(xiàn)在國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

2 Ptau與AD

在20世紀(jì)初，精神病學(xué)家Alzheimer報告一例癡呆癥患者的尸檢大腦中存在“纏結(jié)”的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這些纏結(jié)后來被發(fā)現(xiàn)是由異常聚集體組成的，被稱為淀粉樣纖維，即tau蛋白。正常情況下tau蛋白穩(wěn)定微管的分子軌跡，遞質(zhì)沿著微管在大腦中長的神經(jīng)元投射中運(yùn)輸。但是當(dāng)tau過度產(chǎn)生或從微管上脫落時，它們就會堆積起來，形成各種構(gòu)象的淀粉樣纖維，從一個細(xì)胞傳播到另一個細(xì)胞，以未知的機(jī)制殺死神經(jīng)元。一些證據(jù)表明，各種與tau相關(guān)的癡呆可能是由不同構(gòu)象的纖維引起的。人類tau由位于17號染色體上的MAPT基因編碼，外顯子2、3和10的選擇性剪接產(chǎn)生6個tau亞型，在N末端(0N，1N或2N)含有多達(dá)兩個插入片段，在蛋白的C末端含有3個或4個重復(fù)序列(3R或4R)，tau的缺失剪接，特別是較長tau異構(gòu)體形成的增加，可以導(dǎo)致tau蛋白病。tau主要在神經(jīng)元中表達(dá)，是一種主要的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，參與微管動力學(xué)和組織的調(diào)節(jié)。tau屬于大腦中的主要磷酸化蛋白，過度磷酸化的tau在幾個絲氨酸和蘇氨酸殘基上被磷酸化。tau還受到各種其他翻譯后修飾，包括O-糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化。Lys174位點(diǎn)的tau乙?；罱昏b定為AD患者腦中的早期修飾，這減緩了小鼠模型中tau的周轉(zhuǎn)時間并促進(jìn)了tau聚集。在AD和相關(guān)的tau病變中，微管相關(guān)蛋白tau高度磷酸化并聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，這是神經(jīng)退行性疾病的特征。盡管所謂的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的存在很早就被認(rèn)為是AD患者大腦中主要的蛋白質(zhì)沉積之一，但直到20世紀(jì)60年代，NFT的成對螺旋和直絲才被鑒定為聚集的tau。在AD發(fā)展過程中，tau通過介導(dǎo)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性三聯(lián)體起重要作用，低聚或錯誤折疊的tau可獲得毒性活性并殺死神經(jīng)元。He等通過將人AD-腦源性病理性tau(AD-tau)注射到不過度表達(dá)tau的Aβ斑塊承載小鼠模型中，概括了3種主要類型AD相關(guān)tau病理的形成：圍繞Aβ斑塊(NP Tau)的營養(yǎng)不良神經(jīng)突中tau聚集體、AD樣NFT和NTS，這些不同的tau病理結(jié)構(gòu)使得AD有不同的臨床表現(xiàn)和病程預(yù)后。

3 miRNA的發(fā)現(xiàn)以及生物學(xué)功能

1993年Lee等在新桿狀線蟲發(fā)育實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA lin-4，miRNA是由大約22個核苷酸組成的非編碼RNA，廣泛分布于真核細(xì)胞中。miRNA通過與其3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基結(jié)合來抑制翻譯或誘導(dǎo)miRNA降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miR在各種細(xì)胞過程中的作用已經(jīng)確定，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖、復(fù)制和衰老。miRNA表達(dá)譜的變化，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過程都有很大的影響，據(jù)研究報道，人類編碼基因中約30%受miRNA調(diào)控。miRNA的發(fā)生途徑在不同的生物體物種和細(xì)胞類型中是相似的。初級加工從細(xì)胞核開始，合成多個發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)，稱為初級miRNA(PRI-miRNA)轉(zhuǎn)錄本。miRNA的二次加工發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，其中前miRNA的發(fā)夾環(huán)被另一種RNaseIII酶Dicer和其他幾種輔助因子進(jìn)一步消化，如干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴激活劑和HIV-1tar RNA結(jié)合蛋白，并產(chǎn)生(21～25 nt)的成熟miRNA雙鏈。其中一條鏈被整合到miRNA核蛋白顆粒(miRNP)中誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISCs)，另一條單鏈被降解。起沉默作用的miRNA可通過與靶基因miRNA3′非編碼區(qū)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，發(fā)揮其對靶基因的調(diào)控作用。若沉默基因與miRNA3′非編碼區(qū)堿基可完全互補(bǔ)配對，則靶基因miRNA降解;若兩者呈不完全互補(bǔ)配對，則阻斷靶基因miRNA的翻譯過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可存在于由細(xì)胞釋放的微囊泡中，其與靶細(xì)胞受體結(jié)合，可影響靶細(xì)胞的功能。miRNA還可穩(wěn)定存在于血漿、血清中，并且容易被檢測出，這提示miRNA可能是一種可用于臨床診斷或者疾病預(yù)后評估的新型無創(chuàng)生物標(biāo)志物，另外，對miRNA功能的干預(yù)也可能是臨床治療的新靶點(diǎn)。

4 miRNA調(diào)控Ptau

最近的研究表明，miRNA參與AD的發(fā)病，并且miRNA可能在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟和腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并可能調(diào)節(jié)幾種神經(jīng)退行性疾病，包括AD。許多腦富集或腦特異性miRNA已經(jīng)被鑒定并被證明在能量代謝、突觸可塑性和記憶形成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在miRNA的電子研究中幾個小組已經(jīng)報道了AD患者或轉(zhuǎn)基因AD模型中的表達(dá)譜，并且已知許多miRNA參與Aβ的產(chǎn)生和清除以及tau病變的演變過程。

4.1 miR-125b與Ptau

有研究顯示，與健康對照組相比，AD患者不同腦區(qū)(Braak階段Ⅲ～Ⅵ)miR-125b表達(dá)顯著增加1.6倍。Banzhaf-Strathmann等發(fā)現(xiàn)miR-125b是Ptau的生理調(diào)節(jié)因子，但不影響總tau水平，他們還發(fā)現(xiàn)了AD中miR-125b的過度表達(dá)，誘導(dǎo)Ptau并損害原代海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活力。在目前的研究中，Banzhaf-Strathmann等證實(shí)了以前的報道，即在AD患者的大腦中miR-125b水平增加，他們在海馬內(nèi)注射miR-125b可誘導(dǎo)Ptau，損害小鼠學(xué)習(xí)能力，提示miR-125b升高可能參與AD的發(fā)病機(jī)制。Ma等證明了miR-125b誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，miR-125b的升高將促進(jìn)Ptau，并激活神經(jīng)元細(xì)胞中的CDK5和p35/25，破壞了神經(jīng)元細(xì)胞中磷酸酶和激酶活性的平衡，直接損害了散發(fā)性AD患者的學(xué)習(xí)和記憶。Nagaraj等提供了最近關(guān)于miRNA作為AD生物標(biāo)志物的綜述，他們在文獻(xiàn)中報告了136個在AD和對照狀態(tài)之間顯著改變的miRNA。在這136個miRNA中，36個被獨(dú)立驗(yàn)證并在兩個或兩個以上的文獻(xiàn)中報告，其中hsa-miR-125b的報告最多共有6次。這些都表明miR-125b可能是AD進(jìn)展的一個新的調(diào)節(jié)因子，可能作為AD治療的治療靶點(diǎn)。

4.2 miR-137b與Ptau

有研究表明miR-137是一種大腦富集的miRNA，已被證明與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，是神經(jīng)元發(fā)育和認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)因子，包括精神分裂癥和AD。miR-137已被確定為精神分裂癥認(rèn)知受損亞型和精神分裂癥陽性癥狀的預(yù)測因子，并作為AD患者中抗體表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。據(jù)報道，絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)是神經(jīng)酰胺從頭合成途徑中的第一個限速酶。SPT的激活可提高神經(jīng)酰胺水平，而SPT的抑制可降低神經(jīng)酰胺水平和神經(jīng)元細(xì)胞死亡，據(jù)報道m(xù)iR-137的缺失會增加SPT，進(jìn)而增加Aβ水平造成AD的發(fā)病。L型鈣(Ca)通道(LTCCs)活性的增加與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，研究報道MiR-137能增加L型鈣(Ca)通道的活性進(jìn)而影響AD的發(fā)病，Yang等發(fā)現(xiàn)miR-137在AD小鼠中的表達(dá)水平較低，miR-137抑制了Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中tau的過度磷酸化,這可能表明miR-137可通過抑制tau的過度磷酸化在AD發(fā)病中起調(diào)節(jié)作用。

4.3 miR-138b與Ptau

miR-138b可調(diào)控多種基本生物學(xué)過程，包括樹突棘形態(tài)發(fā)生、耐熱性獲得和胚胎期心臟模式調(diào)節(jié)。miR-138通過靶向酰基蛋白硫酯酶1(APT1)負(fù)調(diào)控樹突棘形態(tài)發(fā)生，一種調(diào)節(jié)突觸蛋白質(zhì)棕櫚?；癄顟B(tài)的酶。此外，Siegel等發(fā)現(xiàn)，miR-138通過降低SIRT1(一種NAD依賴性組蛋白脫乙酰酶)的表達(dá)，作為軸突再生的新型抑制劑發(fā)揮作用。Wang等發(fā)現(xiàn)miR-138b是大量存在于大腦中的RNA，在AD病人中增加，miR-138b的過度表達(dá)，會激活糖原合成酶(GSK-3β)，增加HEK293/tau細(xì)胞中的Ptau，目前已經(jīng)證實(shí)維甲酸受體α(RARA)是miR-138的直接靶點(diǎn)，RARA的存在大量地抑制了GSK-3β的活性，減少了由miR-138引起的tau活性，miR-138可通過靶定RARA/GSK-3β通道來促進(jìn)Ptau。

4.4 miR-98與Ptau

有研究表明，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在大腦中的重要作用包括其對新陳代謝、神經(jīng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌和認(rèn)知功能的貢獻(xiàn)，IGF-1通過抑制糖原合成酶激酶3，促進(jìn)Aβ從腦中清除并抑制Ptau，因此增加IGF-1的表達(dá)被認(rèn)為是AD潛在的治療策略。研究證明了miR-98在體外抑制了IGF-1的翻譯，并通過下調(diào)IGF-1，使得IGF-1的表達(dá)減少，來增加Aβ的形成和tau蛋白的磷酸化。由于miR-98廣泛參與突觸可塑性、IL-6和IL-10的產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其他參與Aβ形成和tau蛋白磷酸化調(diào)控的分子可能受到miR-98的調(diào)控。綜上所述，miR-98在體外負(fù)向調(diào)控IGF-1的翻譯并促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生和Ptau。

5 miRNA作為AD診斷的生物標(biāo)記

衰老是AD和許多其他神經(jīng)退行性疾病的最大危險因素，在衰老過程中，細(xì)胞的變化導(dǎo)致疾病易感性和死亡率的增加，由于miRNA在細(xì)胞衰老和衰老過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，它們可能在評估AD的風(fēng)險中也起著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，表現(xiàn)出高度的時空特異性，主要參與神經(jīng)元的形成、分化和突觸可塑性，并可能調(diào)節(jié)幾種神經(jīng)退行性疾病，包括AD。miRNA是一類天然存在的調(diào)節(jié)廣泛基因表達(dá)的短非編碼RNA，有研究認(rèn)為miRNA的失調(diào)與一系列疾病有關(guān)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如AD、亨廷頓病和多發(fā)性硬化癥等。miRNA除了影響Aβ的產(chǎn)生過程外，還參與tau蛋白的磷酸化和去磷酸化，從而導(dǎo)致NFT的形成。miRNA存在于組織中，與mRNA不同，miRNA在包括血清、血漿和CSF在內(nèi)的生物流體中足夠穩(wěn)定。此外，它們中的許多靶基因直接參與AD病理生理學(xué)分子，如Preenilins、BACE-1、APP。因此，循環(huán)miRNA有可能成為一類新型的非侵入性和敏感的生物標(biāo)志物。

5.1 AD中載脂蛋白E及miR-107

AD是一種進(jìn)行性、年齡依賴性疾病，其特征是Aβ的積累，在載脂蛋白E(ApoE)的幫助下迅速清除。ApoE由位于19號染色體上的ApoE基因編碼。載脂蛋白E4對AD的發(fā)病機(jī)制有多方面的影響，包括脂質(zhì)和脂蛋白的失調(diào)，如載脂蛋白血漿水平，以及降低Aβ清除和葡萄糖代謝，減少神經(jīng)元信號傳導(dǎo)，增強(qiáng)神經(jīng)炎癥和線粒體功能障礙，另外還增加氧化應(yīng)激。長時間的氧化應(yīng)激，除了DNA損傷外，還可能引起RNA損傷并影響RNA水平上的表達(dá)，包括miRNA的變化，例如hsa-miR-107-5p(miR-107)。miR-107由可溶性Aβ管理，并調(diào)節(jié)Aβ的產(chǎn)生。

5.2 血清miR-501-3p作為與AD進(jìn)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物

Hara等發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-501-3p在同一捐贈者的AD腦中顯著上調(diào)。hsa-miR-501-3p在培養(yǎng)細(xì)胞中的過表達(dá)，模仿了AD大腦中的hsa-miR-501-3p上調(diào)，導(dǎo)致了128個基因的顯著下調(diào)，這些基因過度表達(dá)了基因本體論術(shù)語、DNA復(fù)制和有絲分裂細(xì)胞周期，結(jié)果表明hsa-miR-501-3p是一種新的血清生物標(biāo)志物，可能與AD大腦中發(fā)生的病理事件相對應(yīng)。

5.3 血清miRNA可作為AD早期診斷的非侵入性生物標(biāo)志物

有研究表明，miRNA的循環(huán)水平譜有可能作為有價值的生物標(biāo)志物用于各種疾病的診斷、分期和進(jìn)展監(jiān)測。Rui等報告了一種新的9-miRNA(hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-181c-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-148b-5p，hsa-miR-106b-3p，hsa-miR-6119-5p，hsa-miR-1246和hsa-miR-660-5p)，其可用作檢測AD的生物標(biāo)記物。其研究表明，不同的血清miRNA的異常表達(dá)發(fā)生在AD的不同階段。在9個miRNA中，hsa-miR-22-3p具有最好的敏感性(81.8%)和特異性(70.9%)。有研究數(shù)據(jù)表明，差異表達(dá)的血清miRNA可以作為生物標(biāo)志物來提高AD的診斷，尤其是早期診斷，并對其臨床分期進(jìn)行分類。

6 展望

雖然使用正電子發(fā)射斷層掃描的腦脊液神經(jīng)成像和腦脊液中生物標(biāo)志物的測量已經(jīng)顯示出對AD的極好的診斷準(zhǔn)確性，但這些方法的高成本和侵襲性限制了它們的應(yīng)用。因此，迫切需要可靠的生物標(biāo)志物來檢測AD早期或臨床前階段，以便實(shí)施預(yù)防性治療策略。目前沒有足夠的敏感性和特異性生物標(biāo)志物可以用于AD的最終診斷，特別是在疾病的早期階段。血清是一種有吸引力的生物標(biāo)志物來源，它易于收集，對患者造成的不適最小，在臨床試驗(yàn)和頻繁測試中具有更大程度的依從性。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，主要參與神經(jīng)元的形成、分化和突觸可塑性，而且可以釋放在外周血中，循環(huán)血清miRNA可以為AD的診斷提供一種快速、非侵入性和經(jīng)濟(jì)有效的方法。綜合各研究報道，部分miRNA可抑制或促進(jìn)Ptau，干預(yù)相應(yīng)miRNA介導(dǎo)的信號通路途徑，以此影響AD致病，并可能成為AD診斷的生物標(biāo)志物，目前尚需大量臨床研究數(shù)據(jù)對miRNA早期診斷AD的特異性進(jìn)行論證，這也將是診斷該病潛在的具有廣泛前景的研究方向。