視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間連接完整性的新認(rèn)識

韋嘉儀 綜述 王方 審校

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海200072

視網(wǎng)膜位于眼球壁最內(nèi)層，主要由視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞、感光細(xì)胞和Müller細(xì)胞組成。RPE完整性在維持視網(wǎng)膜功能中起著重要作用。RPE將神經(jīng)視網(wǎng)膜與下層的Bruch膜及有孔的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管分開，并通過分隔脈絡(luò)膜毛細(xì)血管形成血-視網(wǎng)膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)。同時以多種生理功能，如提供視網(wǎng)膜營養(yǎng)因子、維持維生素A視覺循環(huán)、吞噬光感受器脫落盤膜等支持和穩(wěn)定神經(jīng)視網(wǎng)膜的正常功能。RPE的這些重要作用均基于其細(xì)胞間連接的正常和穩(wěn)定。近年，隨著細(xì)胞分子生物學(xué)檢測技術(shù)不斷成熟和發(fā)展，重新認(rèn)識RPE細(xì)胞間連接成為研究熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞間連接異常是許多眼底疾病發(fā)生的基礎(chǔ)或前奏，靶向保護(hù)RPE細(xì)胞間連接對于臨床預(yù)防和治療眼底疾病具有重要的意義。本文就RPE細(xì)胞間連接及其在眼底病變中的作用進(jìn)行綜述。

1 RPE細(xì)胞間連接

大量研究證實，RPE細(xì)胞間連接對于組裝和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重要作用。超微結(jié)構(gòu)下，RPE細(xì)胞間連接主要是緊密連接、黏附連接和縫隙連接。

1.1 緊密連接

緊密連接是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間黏附復(fù)合體，以緊密的膜接觸形成膜內(nèi)擴(kuò)散屏障，維持細(xì)胞表面極性，限制脂質(zhì)細(xì)胞膜內(nèi)外的擴(kuò)散。與其他上皮細(xì)胞不同，RPE的頂面與神經(jīng)組織直接接觸，參與感光細(xì)胞外節(jié)的日常吞噬作用。雖然目前對RPE內(nèi)物質(zhì)在細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)难芯可醵?，但對緊密連接復(fù)合體在健康和疾病狀態(tài)中作用的研究甚少。

緊密連接是由一個復(fù)雜蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)組成的跨膜蛋白和胞漿蛋白在上皮細(xì)胞中的一種細(xì)胞-細(xì)胞連接，構(gòu)成了上皮細(xì)胞兩側(cè)固有的一種屏障，阻止大多數(shù)可溶性分子滲透。早期通過冷凍斷裂電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，緊密連接是以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包繞在頂層膜周圍。最近，通過制作非晶碳樣品在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，緊密連接網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膜內(nèi)的原纖維呈雙鏈形態(tài)，這種雙鏈結(jié)構(gòu)的緊密連接更有助于未來細(xì)化分析其時序性變化。在組織結(jié)構(gòu)上，緊密連接由完整的膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞質(zhì)斑蛋白組成。這些蛋白包括Occludin、Claudins、細(xì)胞黏附因子、Tricellulin以及膜相關(guān)的鳥苷酸激酶家族支架蛋白，即封閉蛋白(zonula occludens，ZO)，包括ZO1、ZO2和ZO3。其中ZO蛋白包含一系列保守的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，即PDZ、SH3和GuK，負(fù)責(zé)連接不同的黏附受體，例如Claudins及其細(xì)胞骨架。緊密連接是特殊結(jié)構(gòu)，即通過形成一條閉鎖小帶完全包圍單層上皮細(xì)胞，從而遮蓋RPE細(xì)胞之間幾乎所有的空間，以維持細(xì)胞極性，有效阻止血漿成分和有毒分子向視網(wǎng)膜移動，并允許液體和溶質(zhì)通過滲透梯度從脈絡(luò)膜脈管系統(tǒng)滲透到視網(wǎng)膜外層。

1.2 黏附連接

黏附連接位于緊密連接正下方，可穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能并執(zhí)行多種功能，包括維持細(xì)胞間黏附、調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架、參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞間通訊等，同時也受到多種細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)。黏附連接有3個分子結(jié)構(gòu)域，即微絲、細(xì)胞內(nèi)噬菌斑和膜結(jié)構(gòu)域。其核心蛋白包括經(jīng)典鈣粘蛋白超家族的跨膜糖蛋白，包括E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和P-鈣粘蛋白等，及連接蛋白家族成員，包括p120-連環(huán)蛋白，β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白等。鈣粘蛋白的黏附連接對于神經(jīng)上皮的完整性至關(guān)重要，賦予了上皮堅固性和可塑性雙重功能特征，使得當(dāng)組織損傷后可通過快速的細(xì)胞間接觸重塑加速傷口愈合。此外，黏附連接的堅固性特征在限制細(xì)胞遷移中起著至關(guān)重要的作用。

黏附連接的核心成分鈣粘蛋白分子簇是通過反式的親和相互作用介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附。經(jīng)典的鈣粘蛋白在許多上皮細(xì)胞中為E-鈣粘蛋白，由跨膜受體介導(dǎo)，以蛋白復(fù)合物形式發(fā)揮作用。E-鈣粘蛋白的非結(jié)構(gòu)化胞質(zhì)區(qū)域可直接與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，β-連環(huán)蛋白依次與α-連環(huán)蛋白結(jié)合，形成鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物。復(fù)合物中結(jié)合的α-連環(huán)蛋白還可通過其肌動蛋白結(jié)合域與F-肌動蛋白相互作用。這種鈣粘蛋白與肌動蛋白細(xì)胞骨架的相互作用，構(gòu)成了上皮的堅固性和可塑性。黏附連接在生物生長發(fā)育中也起到了重要作用。一項針對果蠅眼發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，黏附連接對于果蠅視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮發(fā)育、視網(wǎng)膜細(xì)胞極性、控制光感受器狀態(tài)等方面具有重要作用。

雖然黏附連接研究領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)步，但是許多重要的問題仍存在爭議。最近一個新觀點更新了傳統(tǒng)的黏附連接由鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白與肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合組成穩(wěn)定復(fù)合物模型的認(rèn)識，認(rèn)為黏附連接是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)其相關(guān)蛋白與相鄰細(xì)胞的對應(yīng)物產(chǎn)生短暫連接以及E-鈣粘蛋白參與肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑，通過Rac、Cdc42和Arp2/3活性促進(jìn)細(xì)胞表面片狀和絲狀突起；這些動態(tài)突起進(jìn)一步促進(jìn)了E-鈣粘蛋白相互作用和聚集；這樣黏附連接會不斷重復(fù)形成并加強(qiáng)。盡管鈣粘蛋白與β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白形成復(fù)合物，但這種鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物與肌動蛋白細(xì)胞骨架無關(guān)；α-連環(huán)蛋白不直接將細(xì)胞黏附蛋白錨定到肌動蛋白細(xì)胞骨架上，而是作為一種調(diào)節(jié)蛋白來控制肌動蛋白纖維動力學(xué)。

Gaonac'h-Lovejoy等研究顯示，Ras家族小G蛋白基因

Rap1

突變上皮細(xì)胞的黏附連接會濃縮在細(xì)胞一側(cè)，而失去其正常的位置分布。以往研究認(rèn)為黏附連接和緊密連接互不相關(guān)，最新證據(jù)表明二者之間高度依賴，且之間存在直接連接和信號連接關(guān)系，例如，ZO-1通過與Afadin、α-連環(huán)蛋白和肌動蛋白結(jié)合后的相互作用促進(jìn)緊密連接和黏附連接，同時通過信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)黏附連接的成熟和緊密連接的后續(xù)組裝。

1.3 縫隙連接

超微結(jié)構(gòu)下，相鄰上皮細(xì)胞間的縫隙連接結(jié)構(gòu)為約2 nm的窄隙，此區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞間通道允許離子、小分子和低分子量代謝物在相鄰細(xì)胞之間擴(kuò)散，以保證上皮細(xì)胞的許多生理功能，包括傳導(dǎo)電信號和調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號功能等。在脊椎動物中縫隙連接由來自相鄰細(xì)胞的連接小體并置形成的縫隙連接蛋白組成。最新研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接通道的門控特性和通透性取決于縫隙連接蛋白同工型及其翻譯后修飾。組成視網(wǎng)膜的細(xì)胞中都存在縫隙連接，其中也包括RPE細(xì)胞。據(jù)報道，在黃斑變性、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變以及相關(guān)動物模型中，縫隙連接均與RPE細(xì)胞損傷有關(guān)。例如壓力或者損傷情況下，縫隙連接通過降低代謝緩解細(xì)胞間壓力，其相連細(xì)胞可以共享代謝產(chǎn)物。但在更高壓力下，細(xì)胞間縫隙連接反而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物耗盡而逐步導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1.4 橋粒

橋粒被定義為鈣依賴性錨定連接點，其主要由橋粒鈣粘蛋白家族(包括desmocollins和desmoglein)，Armadillo蛋白家族(包括plakoglobin和plakophilins)和血小板溶素家族(主要為desmoplakin)3種基因家族組成。橋粒通過與中間絲耦合發(fā)揮細(xì)胞間黏附作用，其中plakoglobin和plakophilins與desmoplakin直接相連，并介導(dǎo)橋粒鈣粘蛋白與中間絲相連。超微結(jié)構(gòu)下相鄰的RPE細(xì)胞間橋粒呈對稱分布，但RPE細(xì)胞與Bruch膜間這種特化結(jié)構(gòu)呈半橋粒狀態(tài)。橋粒是一種多蛋白復(fù)合體，且其中間絲錨定在質(zhì)膜上可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，賦予了RPE細(xì)胞之間、RPE與基底膜較強(qiáng)的黏附力和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的抗機(jī)械力能力。

2 RPE細(xì)胞間連接在眼底病變中的作用

2.1 RPE細(xì)胞間連接與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)被定義為孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)和RRD手術(shù)后在玻璃體及視網(wǎng)膜內(nèi)外表面形成無血管的纖維細(xì)胞性增生膜，進(jìn)而收縮和牽拉視網(wǎng)膜所致的一類病變。目前玻璃體切割術(shù)、鞏膜扣帶術(shù)是PVR主要的治療方式。盡管在PVR發(fā)病機(jī)制研究和手術(shù)技巧上已經(jīng)有了長足進(jìn)步，但是嚴(yán)重PVR視網(wǎng)膜不能有效復(fù)位仍是其復(fù)位術(shù)失敗的主要原因。正常靜止?fàn)顟B(tài)下，RPE細(xì)胞通過緊密連接和黏附連接結(jié)合在一起，并通過半橋粒附著在Bruch膜上。RRD發(fā)生后，靜止的RPE將暴露于玻璃體和血液衍生的細(xì)胞因子和生長因子環(huán)境下，導(dǎo)致RPE細(xì)胞從Bruch膜上脫落。在整個病變過程中，RPE細(xì)胞丟失了黏附連接中的E-鈣粘蛋白、緊密連接中的ZO-1蛋白和縫隙連接中的縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)等上皮連接標(biāo)志物，最終細(xì)胞間連接分解。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞保留了重編程能力，可連續(xù)地從極化上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，提示其功能發(fā)生障礙，其機(jī)制可能與緊密連接破壞、錯誤折疊的蛋白積累以及一些關(guān)鍵途徑失調(diào)有關(guān)。連接復(fù)合物的破壞使RPE細(xì)胞在細(xì)胞因子和生長因子的刺激下激活信號通路，如β-連環(huán)蛋白/Wnt和Hippo信號傳導(dǎo)，啟動上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，這是PVR發(fā)生的重要機(jī)制。除此之外，Bao等研究證明在RPE細(xì)胞中E-鈣粘蛋白、ZO-1和Cx43共定位且彼此直接結(jié)合，它們之間的相互作用對于RPE功能具有重要作用，敲低其中1種蛋白質(zhì)的表達(dá)就會導(dǎo)致其他2種蛋白表達(dá)下調(diào)。Yao等研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白7可通過Smad2/3途徑抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β介導(dǎo)的RPE細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的上調(diào)以及E-鈣粘蛋白和ZO-1的下調(diào)，并抑制RPE收縮。Hazim等和Lidgerwood等專注研究緊密連接形成機(jī)制，先后證明維生素B家族成員煙酰胺是RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中緊密連接形成的必要因素；RPE細(xì)胞中溶血磷脂酸以受體依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)緊密連接。該發(fā)現(xiàn)有助于尋找新的PVR治療干預(yù)措施。

2.2 RPE細(xì)胞間連接與年齡相關(guān)性黃斑變性

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種進(jìn)行性慢性疾病，因黃斑感光細(xì)胞損傷導(dǎo)致患者發(fā)生不可逆視力喪失。RPE長期耗氧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷及生理過程中代謝產(chǎn)物不斷累積是AMD發(fā)生的主要因素，且氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞自噬功能異常也加速這一病理過程。氧化應(yīng)激反應(yīng)直接結(jié)果是RPE細(xì)胞間連接蛋白不能正常成熟或失去表達(dá)，破壞RPE完整性從而導(dǎo)致oBRB破壞。

Borras等通過體外研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體因子H(complement factor，CFH)基因中的Y402H多態(tài)性與AMD發(fā)生密切關(guān)聯(lián)；重組CFH可抵抗氧化脂質(zhì)4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)誘導(dǎo)的ARPE-19和多能干細(xì)胞誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化損傷，其原因在于CFH能加強(qiáng)RPE細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定oBRB。自噬是維持RPE上皮形態(tài)和功能的關(guān)鍵調(diào)控途徑。自噬在AMD發(fā)病機(jī)制中的作用研究廣泛，但仍有許多未解答的問題，其中包括RPE細(xì)胞自噬異常后對RPE細(xì)胞間連接蛋白的影響。Ji Cho等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體外HO誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞氧化損傷后，硫氧還原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表達(dá)迅速下調(diào)，同時細(xì)胞的多項生物活力發(fā)生變化，包括自噬活性增加，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激導(dǎo)致AMPK激活有關(guān)，而AMPK是自噬過程中細(xì)胞能量感知和細(xì)胞信號調(diào)控的重要激酶；RPE細(xì)胞自噬異?？芍苯悠茐木o密連接，破壞RPE的完整性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在TXNIP蛋白缺失的ARPE-19細(xì)胞中，ZO-1蛋白基本消失，而肌動蛋白應(yīng)力纖維顯著增加，因此研究者認(rèn)為應(yīng)力纖維很可能是利用其張力直接破壞RPE細(xì)胞間的緊密連接；此外，該研究還顯示

TXNIP

基因敲除后可上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的表達(dá)，導(dǎo)致RPE細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增加，這是AMD的另一種病理學(xué)基礎(chǔ)。

最新研究證實，淀粉樣蛋白β可以在體內(nèi)外激活RPE細(xì)胞的核因子(nuclear factor，NF)-κB信號通路，即通過NF-κB信號傳導(dǎo)途徑破壞RPE細(xì)胞的緊密連接。抑制NF-κB信號傳導(dǎo)可防止淀粉樣蛋白β介導(dǎo)的緊密連接破壞，有助于探索AMD治療的新靶點。Warden等的研究證明，膽汁酸牛磺膽酸可以通過保護(hù)RPE細(xì)胞間的緊密連接抑制細(xì)胞在百草枯誘導(dǎo)下的氧化損傷。氨基酸同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高引發(fā)的高同型半胱氨酸血癥通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)破壞BRB，從而誘發(fā)AMD，而抑制或消除NMDAR能夠通過恢復(fù)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，抑制Hcy誘導(dǎo)的BRB分解，對治療AMD有一定的臨床意義。

2.3 RPE細(xì)胞間連接與糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是發(fā)達(dá)國家工作年齡人群致盲的重要原因。DR的主要病理性特征是視網(wǎng)膜內(nèi)、外屏障破壞，新生血管生成和視網(wǎng)膜神經(jīng)變性。在糖尿病進(jìn)展過程中由于RPE細(xì)胞之間的緊密連接蛋白表達(dá)降低、緊密連接復(fù)合物分解致使脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的生物大分子可通過RPE細(xì)胞間隙滲漏，形成黃斑水腫。Lopes等研究證明，δ阿片受體激動劑治療可以通過上調(diào)claudin-1、ZO-1等緊密連接蛋白，抑制DR模型中視網(wǎng)膜病變早期VEGF、色素上皮衍生因子的表達(dá)，證明其具有治療DR的潛能。

Zhang等研究表明，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠RPE細(xì)胞HIF-1α和JNK信號通路被激活，細(xì)胞中ZO-1和Occludin表達(dá)下降，從而導(dǎo)致PRE完整性破壞和oBRB功能受損；而促紅細(xì)胞生成素可通過下調(diào)HIF-1α和JNK信號表達(dá)，穩(wěn)定緊密連接蛋白的表達(dá)及oBRB的完整性。體外高糖處理的ARPE-19細(xì)胞會發(fā)生RPE細(xì)胞間緊密連接丟失和形態(tài)學(xué)損傷，而維生素D可修復(fù)這一變化，這一發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠眼得到證實。另有研究表明，Norrin蛋白丟失將導(dǎo)致DR表型，VEGF誘導(dǎo)的DR中oBRB損害可以通過注射Norrin蛋白抑制，其機(jī)制是Norrin蛋白以黏附連接中β-連環(huán)蛋白依賴的方式恢復(fù)緊密連接中Claudin-5的表達(dá)并恢復(fù)oBRB的功能及完整性。在轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠眼中，葡萄糖/淀粉樣蛋白β觸發(fā)的活性氧和晚期糖基化終產(chǎn)物生成可使RPE中ZO-1、Occludin-1、基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)水平下降，桉樹素可以通過對抗這些產(chǎn)物，維持RPE細(xì)胞間連接和細(xì)胞的完整性。這些保護(hù)因子可以通過穩(wěn)定細(xì)胞連接表達(dá)、維持RPE完整性來抑制DR的發(fā)生和發(fā)展。

3 總結(jié)與展望

在生理以及病理狀態(tài)下，RPE細(xì)胞間連接對于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的建立和維持至關(guān)重要。RPE細(xì)胞作為神經(jīng)視網(wǎng)膜層和脈絡(luò)膜層交界處的重要支持細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞間連接的完整性是維持RPE穩(wěn)定的首要基礎(chǔ)。在病理條件下，RPE細(xì)胞間連接，尤其是緊密連接和黏附連接破壞常常是導(dǎo)致各種眼底病變的觸發(fā)因素。近年越來越多研究開始聚焦RPE細(xì)胞間的連接蛋白變化，甚至以這些蛋白的變化作為疾病診斷和治療效果指標(biāo)。

有關(guān)RPE細(xì)胞間連接和眼底病變之間關(guān)系的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用尚不完善。例如，細(xì)胞間連接蛋白破壞的具體分子機(jī)制還不清楚；關(guān)于RPE細(xì)胞間縫隙連接破壞與疾病發(fā)生關(guān)系的研究較少；通過何種給藥方式以靶向保護(hù)受損部位等問題都值得繼續(xù)研究和探討?？傊?，隨著RPE細(xì)胞間連接蛋白維持RPE完整性研究的不斷深入，有望為眼底疾病診斷和治療帶來新的策略和手段。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突