基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究

馬新利，武海英，張婷婷，王秋明，張 暋△

(1.鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心有限公司實(shí)驗(yàn)診斷部，河南 鄭州 450000；2.河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，河南 鄭州 450003)

妊娠期高血壓疾病是孕婦妊娠期特有的一種疾病，包括妊娠期高血壓、子癇前期-子癇，妊娠合并慢性高血壓和慢性高血壓伴發(fā)子癇前期，發(fā)病率占妊娠期并發(fā)癥的2%～8%，是導(dǎo)致全世界范圍內(nèi)產(chǎn)婦和胎兒死亡的首要病因之一[1]。妊娠期高血壓疾病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今為止發(fā)病機(jī)制依然不明確，但是隨著人類(lèi)基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)妊娠期高血壓疾病的病因研究關(guān)注點(diǎn)開(kāi)始集中于遺傳因素上。大量研究發(fā)現(xiàn)，CORIN基因[2]、NR3C2基因[3]、AGTR1基因[4]、AGT基因[5]、NOS3基因[6]、STOX1基因[7]、ERAP2基因[8]、MMP-9基因[9]、TNF-α基因[10]、IL-10基因[10]、GAS6基因[11]、MTHFR基因[12]和EPHX1基因[13]的多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，本研究選取以上13個(gè)基因的熱點(diǎn)研究位點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)探討基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病易感性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6—12月在河南省人民醫(yī)院住院的46例妊娠期高血壓疾病孕產(chǎn)婦為研究組，同時(shí)選取同期住院的50例健康孕產(chǎn)婦為對(duì)照組。妊娠期高血壓疾病參考《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg，產(chǎn)后12周內(nèi)血壓恢復(fù)正常。排除患有肝、腎疾病，心臟病，糖尿病等其他嚴(yán)重并發(fā)癥者。

1.2儀器與試劑 外周血基因組DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)試劑盒，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)采用Agena Complete iPLEX?Pro Genotyping Reagent Set，基因分型使用Agena MassARRAY?Analyzer 4儀器。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 抽取患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，顛倒混勻后吸取200 μL，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，用Nanodrop檢測(cè)待檢基因組DNA，確保DNA濃度在10 ng/μL以上，260 nm和280 nm處吸光度比值(A260/A280)在1.6～2.0，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2基因分型 選取文獻(xiàn)報(bào)道可能與妊娠期高血壓疾病相關(guān)的Corin(rs387906895、rs387906894)、NR3C2(rs41511344)、AGTR1(rs5186)、AGT(rs4762、rs699、rs388972)、NOS3(rs1799983、rs2070744)、STOX1(rs1341667、rs10509305)、ERAP2(rs2549782)、TNF-α(rs1800629、rs1799724)、IL-10(rs1800896)、GAS3(rs1803628)、MTHFR(rs1801133)、EPHX1(rs1051740)基因多態(tài)性位點(diǎn)，利用美國(guó)Agena公司的AgenaCx軟件設(shè)計(jì)PCR引物和單堿基延伸引物。提取好的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，SAP純化，單堿基延伸反應(yīng)，樹(shù)脂脫鹽純化后將樣品點(diǎn)樣到芯片上，采用Agena MassARRAY?Analyzer 4對(duì)提取的樣本進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，應(yīng)用Typer Analyzer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

2 結(jié) 果

2.1妊娠期高血壓疾病危險(xiǎn)因素的單因素分析結(jié)果 2組在收縮壓和舒張壓2個(gè)指標(biāo)上比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)妊娠期高血壓疾病血壓標(biāo)準(zhǔn)(收縮壓≥140 mm Hg，舒張壓≥90 mm Hg)，實(shí)驗(yàn)分組符合預(yù)期。2組在年齡、體重、妊娠時(shí)間和文化程度方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組妊娠期高血壓病史人數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 妊娠期高血壓疾病危險(xiǎn)因素的單因素分析

2.22組基因型和等位基因頻率比較 統(tǒng)計(jì)研究組和對(duì)照組18個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)基因型結(jié)果見(jiàn)表2。15個(gè)SNP位點(diǎn)(rs3889728、rs1799983、rs4762、rs1051740、rs10509305、rs2070744、rs1803628、rs1799724、rs1341667、rs1801133、rs2549782、rs5186、rs699、rs1800629、rs1800896)具有基因多態(tài)性，3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs387906895、rs41511344和rs387906894)沒(méi)有基因多態(tài)性。

根據(jù)基因型計(jì)算結(jié)果顯示，研究組和對(duì)照組間rs1799983、rs1051740和rs2070744位點(diǎn)基因型比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他位點(diǎn)基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。等位基因計(jì)算結(jié)果顯示，rs1051740和rs2070744等位基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他位點(diǎn)基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。位點(diǎn)rs1051740和rs2070744的等位基因C在妊娠期高血壓疾病人群中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)度(95%可信區(qū)間)[OR(95%CI)]分別為1.82(0.99～3.34)和2.24(0.90～5.57)。見(jiàn)表2。

表2 研究組和對(duì)照組 SNP 位點(diǎn)基因型和等位基因分布結(jié)果

3 討 論

目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明，妊娠期高血壓疾病的發(fā)生和發(fā)展與遺傳相關(guān)[15-16]。本研究分析了文獻(xiàn)報(bào)道與妊娠期高血壓疾病相關(guān)的18個(gè)SNP位點(diǎn)，15個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因在研究組和對(duì)照組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，rs3889728 位點(diǎn)基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是等位基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明這16個(gè)SNP位點(diǎn)可能與妊娠期高血壓疾病無(wú)關(guān)，初步推測(cè)可能與種族、地理環(huán)境和樣本量不足有關(guān)。

rs2070744是NOS3基因中的一個(gè)SNP，NOS3主要分布于冠狀血管和心腔面的內(nèi)膜，可以催化生成一氧化氮。一氧化氮為內(nèi)皮舒張因子，具有調(diào)節(jié)血管舒張、抑制血管平滑肌增殖等功能。本研究中rs2070744位點(diǎn)組間基因型和等位基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C等位基因在妊娠期高血壓疾病人群中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高，可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病的高危因子。推測(cè)可能的機(jī)制為rs2070744是啟動(dòng)子區(qū)域中的一個(gè)SNP,NOS3基因rs2070744位點(diǎn)基因多態(tài)性影響mRNA的表達(dá)水平，使酶合成降低，從而導(dǎo)致一氧化氮的合成降低，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙誘發(fā)妊娠期高血壓疾病。本研究與文獻(xiàn)[17-18]研究結(jié)果相符合，驗(yàn)證了本研究結(jié)果的有效性，在一定程度上提高了本研究成果的可信度。

rs1051740是EPHX1基因中的一個(gè)SNP，環(huán)氧化物水解酶是一種重要代謝酶，其參與外源性化學(xué)物質(zhì)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化第二時(shí)相的反應(yīng)，編碼該酶的基因存在一定程度的變異，使其在代謝過(guò)程中的作用發(fā)生相應(yīng)改變。本研究rs1051740位點(diǎn)組間基因型和等位基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C等位基因在妊娠期高血壓疾病人群中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高，可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病的高危因子。推測(cè)可能的機(jī)制為rs1051740是EPHX1基因第3號(hào)外顯子中的一個(gè)SNP，rs1051740位點(diǎn)發(fā)生T>C轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致EPHX1第113密碼子由TAC轉(zhuǎn)換為CAC，其編碼的氨基酸殘基由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而降低酶的活性，使脂類(lèi)代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損引起妊娠期高血壓疾病。

綜上所述，NOS3和 EPHX1 的基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病有一定的關(guān)聯(lián)，是該病發(fā)病率高的潛在遺傳易感基因。本研究發(fā)現(xiàn)，年齡、體重、妊娠時(shí)間和文化程度不是妊娠期高血壓疾病的危險(xiǎn)因素，妊娠期高血壓病史是妊娠期高血壓疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。故推測(cè)妊娠期高血壓病史可能與NOS3和 EPHX1 的基因多態(tài)性有關(guān)。但是，本研究樣本數(shù)量有限，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。其次，NOS3基因的SNP位點(diǎn) rs2070744和EPHX1基因的SNP位點(diǎn)rs1051740多態(tài)性導(dǎo)致蛋白表型的差異，不同突變形式的蛋白究竟通過(guò)何種機(jī)制或信號(hào)通路影響妊娠期高血壓遺傳易感性，值得深入研究。本研究從基因多態(tài)性方面為妊娠期高血壓疾病的早期臨床篩選提供候選基因，為妊娠期高血壓疾病的早期診斷、治療提供了分子生物學(xué)依據(jù)。