結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)假陰性的影響因素

林楚娟, 許曉攀, 郭 藍(lán)

(1. 中山大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 廣東 廣州, 510000; 2. 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 廣東 珠海, 519000)

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染肺部引起的慢性傳染病，占結(jié)核病的80%～90%, 是全球面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一。中國是結(jié)核病高發(fā)國家之一，據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]統(tǒng)計(jì)，中國結(jié)核患者的數(shù)量在世界排名第3。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是結(jié)核病免疫學(xué)檢查方法之一, 2017年中國肺結(jié)核診斷指南將其納入實(shí)驗(yàn)室輔助診斷條件之一[2]。然而T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果不僅可能受MTB感染前的免疫狀態(tài)影響，還可能受到年齡增長(zhǎng)或感染后時(shí)間推移而發(fā)生細(xì)胞因子變化的影響[3]。目前對(duì)T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的影響因素的研究結(jié)果不盡相同。本研究以病原學(xué)、病理學(xué)檢查為確診方法，分析473例活動(dòng)性肺結(jié)核(APTB)患者的人口學(xué)特征、臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，期望篩選出對(duì)T-SPOT.TB假陰性結(jié)果有意義的影響因素，以指導(dǎo)臨床對(duì)T-SPOT.TB假陰性結(jié)果進(jìn)行合理解釋。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過臨床檢驗(yàn)科的LIS系統(tǒng)查閱2019年10月—2021年4月在中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院行T-SPOT.TB項(xiàng)目檢測(cè)的疑似肺結(jié)核病例，根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288—2017)[2]篩選APTB確診病例共473例，其中男325例，女148例，年齡12～93歲，平均(48.05±17.99)歲。根據(jù)T-SPOT.TB的結(jié)果將患者分為陰性組78例與陽性組395例。排除標(biāo)準(zhǔn): 人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性者; 長(zhǎng)期服用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素者; 臨床一般資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果不完整者。

1.2 主要試劑與儀器

T-SPOT.TB試劑購自廣州迪澳生物科技有限公司; 輔助儀器為深圳科視威WD105電子放大鏡。

1.3 T-SPOT.TB檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本類型: 新鮮肝素鈉或肝素鋰抗凝的外周靜脈血4 mL。

1.3.2 操作步驟: 嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.3 結(jié)果判斷: “陽性”有3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。① 陰性對(duì)照孔沒有或不超過10個(gè)斑點(diǎn)，而陽性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)超過20個(gè); ② 陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)，且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6; ③ 陰性對(duì)照孔為6～10個(gè)時(shí)，且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))。若上述標(biāo)準(zhǔn)不符合，且陰陽對(duì)照孔正常時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為“陰性”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 T-SPOT.TB陰性組與陽性組人口學(xué)特征及臨床特征

T-SPOT.TB陰性組平均年齡(54.94±15.83)歲，大于陽性組平均年齡(46.69±18.10)歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 年齡較大是T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的影響因素。性別、涂陰、初治或復(fù)治、影像學(xué)表現(xiàn)有無空洞、是否合并糖尿病和結(jié)核性胸膜炎對(duì)T-SPOT.TB的結(jié)果沒有影響。見表1。

表1 T-SPOT.TB陰性組與陽性組人口學(xué)特征及臨床特征的比較

2.2 T-SPOT.TB結(jié)果與年齡關(guān)系的分層分析

當(dāng)患者年齡分別為≤25歲、26～45歲、46～65歲和>65歲時(shí), T-SPOT.TB的假陰性率依次為5.88%、11.51%、19.19%和26.60%。隨著患者年齡的增加, T-SPOT.TB假陰性率依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。采用Spearman秩相關(guān)分析，得到各年齡段定義值與T-SPOT.TB結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.183,P<0.001)。見表2。

2.3 T-SPOT.TB陰性組與陽性組常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

T-SPOT.TB陰性組尿素水平高于T-SPOT.TB陽性組，總蛋白、白蛋白水平低于T-SPOT.TB陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尿素升高、總蛋白與白蛋白降低是T-SPOT.TB假陰性的影響因素。見表3。

表2 T-SPOT.TB結(jié)果與年齡關(guān)系的分層分析[n(%)]

表3 T-SPOT.TB陰性組與陽性組常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

2.4 T-SPOT.TB假陰性影響因素的多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，尿素升高、總蛋白與白蛋白降低不是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立影響因素，年齡>65歲是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立影響因素。相對(duì)于年齡≤25歲，年齡>65歲時(shí), APTB患者T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的OR值為3.896(95%CI: 1.228～12.361)。見表4。

表4 T-SPOT.TB假陰性影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

T-SPOT.TB是使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來確定受MTB 特異性抗原刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞中可釋放γ-干擾素(IFN-γ)的效應(yīng)T 細(xì)胞的數(shù)量，應(yīng)用的特異性抗原是6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10 kD培養(yǎng)濾過蛋白肽段(CFP-10)[4-6], 對(duì)肺結(jié)核、肺外結(jié)核、結(jié)核潛伏感染及免疫抑制的結(jié)核病患者均能檢測(cè)。目前, T-SPOT.TB是最敏感的檢測(cè)結(jié)核抗原特異性T淋巴細(xì)胞的技術(shù)[7-8]。T-SPOT.TB已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但是對(duì)其結(jié)果的解釋仍具有一定難度。

研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，年齡較大、女性、白蛋白降低、HIV合并感染和涂片陰性是T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立影響因素。但也有研究[11-12]表示，患者的性別、年齡和基礎(chǔ)疾病等因素對(duì)T-SPOT.TB結(jié)果的影響較小。本研究發(fā)現(xiàn)，性別、涂陰、治療史(初治或復(fù)治)、影像學(xué)表現(xiàn)有無空洞、是否合并糖尿病和結(jié)核性胸膜炎對(duì)T-SPOT.TB的結(jié)果沒有影響。涂陽患者與涂陰患者T-SPOT.TB的陽性率分別為85.04%(216/254)、81.74%(179/219), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.334), 提示T-SPOT.TB對(duì)涂陰肺結(jié)核患者具有同樣的診斷價(jià)值。

初治患者指首次確診為肺結(jié)核，且之前未規(guī)律服用抗結(jié)核藥物; 復(fù)治患者指曾確診過肺結(jié)核并已規(guī)律服用抗結(jié)核藥物，且在醫(yī)生指導(dǎo)下停用藥物，而本次入院后確診為APTB復(fù)發(fā)并再次啟動(dòng)抗結(jié)核治療。本研究結(jié)果顯示，抗結(jié)核治療史對(duì)T-SPOT.TB的結(jié)果沒有影響，故該試驗(yàn)對(duì)復(fù)治的結(jié)核病患者T-SPOT.TB具有同樣的診斷價(jià)值。研究[13]顯示, T-SPOT.TB檢測(cè)肺結(jié)核合并糖尿病的陰性率高于單純肺結(jié)核。但本研究結(jié)果與梁麗麗等[14]研究結(jié)果一致，合并糖尿病不是T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的影響因素。不同糖尿病患者的病程、應(yīng)用降糖藥物及血糖的控制情況有所不同，這可能是導(dǎo)致出現(xiàn)不同結(jié)果的原因。張群[15]研究結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎是導(dǎo)致結(jié)核病患者T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立影響因素。有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性腦膜炎是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者是否合并結(jié)核性胸膜炎，對(duì)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果并沒有影響。作者認(rèn)為，結(jié)核發(fā)病部位對(duì)T-SPOT.TB的敏感度有一定的影響，而肺結(jié)核患者是否合并其他部位的結(jié)核病變對(duì)T-SPOT.TB結(jié)果沒有影響。

肺結(jié)核空洞是指患者的影像學(xué)檢查所顯示的肺組織病變，主要是由結(jié)核菌造成肺部侵蝕引起。本研究中，涂陽患者出現(xiàn)空洞的比率為50.39%(128/254), 顯著高于涂陰患者的19.18%(42/219)(P<0.001), 可見肺結(jié)核空洞患者體內(nèi)結(jié)核菌的載量較高且處于活躍狀態(tài)，患者的結(jié)核病情可能較重并處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。但有無空洞并沒有對(duì)T-SPOT.TB的結(jié)果造成影響，與陶學(xué)芳等[17]研究結(jié)果一致，該試驗(yàn)的結(jié)果與結(jié)核病的嚴(yán)重程度無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)年齡較大、尿素升高、總蛋白與白蛋白降低是T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的影響因素。T-SPOT.TB的假陰性率隨患者年齡的增長(zhǎng)而增高, Spearman秩相關(guān)分析得到各年齡段定義值與T-SPOT.TB結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.183,P<0.001), 與羅衛(wèi)紅等[18]研究結(jié)果一致。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡>65歲是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立影響因素。相對(duì)于年齡≤25歲，患者年齡>65歲時(shí), T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的OR值為3.896(95%CI: 1.228～12.361)。本研究認(rèn)為，老年人免疫細(xì)胞功能逐漸減弱，在受到結(jié)核特異性抗原刺激時(shí)，釋放的IFN-γ減少，導(dǎo)致T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性。尿素、總蛋白、白蛋白的濃度與患者的年齡、肝腎功能狀態(tài)有關(guān)，老年人更容易合并肝、腎功能異常等問題，這可能是T-SPOT.TB陰性組尿素升高、總蛋白與白蛋白降低的原因。隨著社會(huì)老齡化加重，老年人結(jié)核發(fā)病率顯著升高[19], 75～79歲達(dá)到高峰[20]。T-SPOT.TB試驗(yàn)應(yīng)用于臨床結(jié)核病診斷的實(shí)際敏感度普遍低于試劑盒說明書所給的敏感度，這可能與老年人結(jié)核病患病率的升高有關(guān)。

綜上所述，年齡>65歲是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立影響因素。老年人是一個(gè)特殊的群體，其容易合并其他基礎(chǔ)疾病，這可能對(duì)T-SPOT.TB的結(jié)果解釋具有一定影響。