岡田酸誘導(dǎo)阿爾茲海默病動物模型的研究進展

張 鑫, 王軍燕, 魏玉婷, 劉鴻鑫, 朱田田, 嚴興科

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院, 甘肅 蘭州, 730000)

阿爾茨海默病(AD)是老年階段最常見的癡呆類型，以進行性認知功能減退為主要特征[1]。隨著人口老齡化的日趨嚴重, AD的發(fā)病率呈不斷上升趨勢。作為全球難治性疾病, AD無法完全根治，當前治療方法僅能緩解相關(guān)癥狀[2]。關(guān)于AD的確切病因及發(fā)病機制至今仍不明確，主要有β-淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)假說、tau蛋白磷酸化假說、膽堿能神經(jīng)元假說、氧化應(yīng)激假說、自由基損傷假說等[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn), tau蛋白磷酸化與AD患者的癡呆程度相關(guān)性更高。tau蛋白磷酸化假說認為, AD發(fā)病是由過度磷酸化tau蛋白(p-tau)聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)而造成神經(jīng)細胞大量損傷引起。因此tau蛋白被很多學(xué)者認為是治療AD的潛在有效靶點[6]，而臨床前模擬以tau蛋白磷酸化為特征的 AD動物模型至關(guān)重要。

目前，已建立的tau蛋白動物模型有rTg4510、JNPL3、pR5等轉(zhuǎn)基因鼠模型[7-8]。但轉(zhuǎn)基因鼠價格較高，且存在基因突變可能，易導(dǎo)致模型鼠出現(xiàn)視覺、嗅覺或肌肉等缺陷，會對行為分析產(chǎn)生影響[9]。岡田酸(OA)是一種強聚醚海洋毒素，可以通過抑制抑制蛋白磷酸酯酶-1(PP1)、蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)活性達到調(diào)控tau蛋白磷酸化水平的目的[10]。根據(jù)該特性以及利用OA造模操作簡單、成本低、造模周期較短等特點, OA被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外tau蛋白磷酸化改變?yōu)樘卣鞯腁D模型制作中，但文獻報道中OA的具體應(yīng)用方法尚不統(tǒng)一。本文對實驗動物選擇、OA制備、注射部位、注射劑量、模型評價以及病理學(xué)機制進行綜述，以期為該種模型應(yīng)用提供參考。

1 實驗動物選擇

文獻[11]報道，腦內(nèi)注射OA的動物模型多為嚙齒類動物，包括C57BL/6 J小鼠、ICR小鼠、昆明種小鼠以及SD、Wistar大鼠等。與小鼠比較, SD、Wistar大鼠具有行為、情緒變化特征，行為表現(xiàn)多樣，情緒敏感，能進行高級神經(jīng)活動研究，且SD大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，更適用于獎勵和懲罰實驗、迷宮實驗等方面的研究[12-13]。研究[14]表明，雌激素對AD有神經(jīng)保護作用，為降低實驗誤差，實驗鼠性別以雄性多見。鼠的體質(zhì)量不同，其大腦區(qū)域的立體定向坐標也會不同，當前各個研究中大鼠腦立體定位坐標參考包新民等[15]的《大鼠腦立體定位圖譜》、GEORGE PAXINOS等[16]的《大鼠腦立體定位圖譜》，小鼠腦區(qū)定位多參考《小鼠腦圖譜》[17]。為更準確進行腦立體定位，本研究選用腦內(nèi)注射OA的大鼠體質(zhì)量(300±50) g, 小鼠體質(zhì)量(26±4) g。根據(jù)現(xiàn)有文獻，本文總結(jié)了OA動物模型的具體制備方法、行為學(xué)表現(xiàn)和病理改變[18-34], 見表1。

2 實驗方案及操作

2.1 OA的制備方法

OA是一種強聚醚海洋毒素，實驗用OA主要從人工培養(yǎng)的甲藻、單細胞海洋微生物中提取，也可進行化學(xué)合成[35]。高純度OA形態(tài)為無色晶體，分子式為C44H68O13，具有親脂性以及很強的穩(wěn)定性，不溶于水[36]。OA通常經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇或甲醇進行溶解后使用[37]。有研究使用可直接溶于水的OA鈉鹽(分子式為C44H67NaO13)和OA銨鹽(分子式為C44H67KO13)進行腦內(nèi)注射。

DMSO被稱為“萬能溶劑”，在常溫下為無色、無臭、呈微苦味的透明液體，體積分數(shù)較高時具有細胞毒性[38]。研究[39]表明，低劑量DMSO (0.1%～2.0%)能造成大鼠和小鼠淋巴細胞、神經(jīng)細胞等多種體外細胞凋亡。甘津凡等[40]使用不同濃度DMSO對斑馬魚胚胎進行干預(yù)，結(jié)果顯示, DMSO濃度僅在0.3%時能造成斑馬魚胚胎發(fā)育障礙，DMSO濃度越高，影響程度越大。

臨床開展研究使用無水乙醇、甲醇進行OA溶解，并與生理鹽水或人工腦脊液進行稀釋注入實驗動物腦內(nèi)。研究[41-42]表明，無水乙醇、甲醇均具有刺激性，二者對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，也具有損害血細胞的作用。目前，對無水乙醇、甲醇的使用沒有明確的安全濃度。JIANG C等[43]發(fā)現(xiàn)，在乙醇處理的蛋白酶體亞單位中，蛋白酶體亞單位發(fā)生了過度磷酸化。YANG M等[44]采用甲醇喂養(yǎng)小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)p-tau蛋白水平增高，海馬神經(jīng)細胞凋亡，小鼠的認知功能也下降。

DMSO、無水乙醇、甲醇對動物神經(jīng)系統(tǒng)均能產(chǎn)生損傷，因此在進行實驗時，給予動物單純進行DMSO、乙醇、甲醇稀釋液腦內(nèi)注射，有助于明確OA溶解劑對實驗動物的影響。

2.2 注射部位和劑量

AD病理表現(xiàn)為腦體積縮小，腦溝加深、變寬，腦回萎縮，以海馬區(qū)萎縮最為明顯[45]。海馬是處理敘述性記憶的主要區(qū)域，參與空間訊息的儲存與處理，因此動物海馬附近的側(cè)腦室及海馬(CA1、3區(qū))是注射OA的主要部位，為使OA有效吸收，需明確注射及留針時間。研究[46]認為，實驗動物進行腦內(nèi)注射時，注射器針頭可引起大腦創(chuàng)傷，導(dǎo)致不必要的腦細胞死亡，干擾實驗結(jié)果，因此在海馬區(qū)附近進行注射或?qū)h離注射處的海馬組織進行結(jié)果分析能有效減少偏差。

研究[47]表明, OA對PP2A、PP1的半抑制濃度(IC50)為0.1～1.0 nmol/L和20～100 nmol/L。ARIAS C等[48]將不同劑量(25、50、150、300 ng)的OA分別注射入Wistar大鼠海馬區(qū)，結(jié)果顯示, OA注射劑量為50 ng、150 ng和300 ng均會對大鼠海馬區(qū)CA1產(chǎn)生損傷，以150 ng和300 ng的損傷最為明顯，注射劑量為25 ng則無明顯影響; 給予大鼠300 ng海馬區(qū)注射后，大鼠易出現(xiàn)頭部抖動、咀嚼、顫抖等不良反應(yīng)。BROETTO N等[49]分別將100、200 ng OA注入大鼠腦內(nèi)，結(jié)果顯示，注射劑量為200 ng的大鼠認知功能低于注射劑量為100 ng的大鼠, p-tau蛋白濃度高于100 ng的大鼠。在其他研究中，通常采用150 ng的OA劑量進行腦內(nèi)注射(見表1)。多數(shù)研究通常將OA一次性注射進動物腦內(nèi)建立AD模型中，但也有使用側(cè)腦室導(dǎo)管埋置術(shù)[50-51]對動物進行多次OA腦內(nèi)注射，或間隔數(shù)天繼續(xù)進行腦內(nèi)注射。

表1 OA腦內(nèi)注射動物建模方法、學(xué)習(xí)記憶能力檢測和機制

2.3 模型評價

模型復(fù)制結(jié)束后，通過學(xué)習(xí)記憶能力檢測評價模型是否成功。本文對學(xué)習(xí)記憶能力檢測方法進行總結(jié)，包括Morris水迷宮(MWM)、新物體識別實驗(ORT)、巴恩斯(Barnes)迷宮、Y迷宮(YM)。

Morris水迷宮實驗[52]利用動物(大鼠、小鼠)會游泳但不喜水的特點，將其放于水中尋找隱藏在水中的平臺。該實驗主要用于測試動物對空間位置感的學(xué)習(xí)記憶能力。水池是MWM最主要的附件之一，大、小鼠所需游泳池尺寸不一，小鼠約為大鼠的50%, 平臺直徑也較小(7.5 cm)。實驗中水溫和水的渾濁度是實驗的關(guān)鍵，水溫一般要求20 ℃左右，為避免實驗動物在水中觀察到平臺，通常使用二氧化鈦、牛奶使水池中的水變渾濁。該實驗指標是將以鼠每日4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為鼠當日的學(xué)習(xí)成績; 在空間探索實驗時，對規(guī)定時間內(nèi)鼠穿過平臺所在位置的次數(shù)、所在目標象限停留時間等進行統(tǒng)計，以評估鼠的空間記憶能力。

新物體識別實驗[53]是利用嚙齒類動物對新奇物體喜探究的習(xí)性建立的評定其記憶識別能力的檢測方法。該實驗不需要任何獎勵或懲罰，是通過記錄和計算實驗動物對熟悉物和新物體的探索時間進行記憶力評估。為更好地模擬人類學(xué)習(xí)記憶行為，在進行該實驗時，需保持外界環(huán)境安靜，保證動物在自由活動狀態(tài)下進行新舊事物探索。該實驗由3個階段構(gòu)成: 適應(yīng)期、熟悉期和測試期。實驗指標包括實驗動物對物體的辨別指數(shù)(DI)和識別指數(shù)(RI)。DI=(探索新物體時間-探索舊物體時間)/(探索新物體時間+探索舊物體時間)，正分表示在新物體上花費的時間更多，負分表示在舊物體上花費時間更多，零分表示無效偏好。RI=探索新物體時間/(探索新物體時間+探索舊物體時間)×100%, >50%表示對新物體偏好, <50%對舊物體偏好, 50%表示無偏好。

巴恩斯迷宮[54]是利用嚙齒類動物避光喜暗、喜探索的特性建立的，用于評估實驗室嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)記憶、導(dǎo)航能力，較Morris水迷宮應(yīng)激性小。實驗時將動物放置在迷宮中央，通過適當刺激，如強風(fēng)、燈光、噪音等，強制動物躲藏，同時記錄動物找到正確洞口的時間、進入錯誤洞口的次數(shù)、重復(fù)進入錯誤的洞口數(shù)。Barnes迷宮的構(gòu)建和測試方法根據(jù)實驗對象不同有所不同，如一些迷宮外線索對大鼠有效，對小鼠可能需要迷宮內(nèi)線索進行指引，并需要遮擋迷宮外視野。該方法需要4～7次的測試來檢測嚙齒類動物學(xué)習(xí)和記憶能力。

Y迷宮[55]由3個臂組成，各個臂夾角120°，該實驗包括食物獎賞測試和電刺激測試。食物獎賞測試是利用嚙齒動物對新環(huán)境的探究習(xí)性來進行，動物不需要學(xué)習(xí)任何規(guī)則; 電刺激測試是利用嚙齒動物避光喜暗習(xí)性設(shè)計，通過電刺激促使處在陰暗區(qū)的動物逃離至光亮區(qū)。YM將動物在各個臂停留的時間作為評價其空間識別記憶能力的指標，以動物在各個臂的穿梭次數(shù)作為其活動能力的指標。

2.4 相關(guān)病理學(xué)機制

Tau蛋白過度磷酸化引起的NFTs是AD發(fā)病的關(guān)鍵，tau蛋白磷酸化程度受蛋白激酶與磷酸酶調(diào)節(jié)。GSK-3β[56]、MAPK[57]和CDK5等[58]蛋白激酶能促進tau蛋白在多個與AD發(fā)生相關(guān)的位點磷酸化。磷酸化后的tau蛋白可由PP2A等磷酸酶去磷酸化。蛋白激酶與蛋白激酶，蛋白激酶與磷酸酶，被證實存在協(xié)同作用，相互影響[59]。

炎癥是AD的一個重要特征，越來越多的證據(jù)表明，炎癥會影響tau蛋白磷酸化。如TNF-α、IL-1β、白細胞介素-18(IL-18)等被證明與tau蛋白磷酸化有關(guān)[60]。IL-1β能夠調(diào)控p38MAPK、GSK-3β, 進而影響tau磷酸化[61-62]。IL-18能調(diào)節(jié)N-甲基-D-天門冬氨酸水平，影響蛋白激酶引起tau蛋白磷酸化，并提高體內(nèi)神經(jīng)元tau蛋白的釋放[63]。

研究[64-65]表明, Aβ能與腦內(nèi)氧化氫酶相互作用，促使神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激和細胞凋亡加快，而tau蛋白能擴大Aβ引起的微管丟失，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥等。膽堿能神經(jīng)元活性異常也能導(dǎo)致Aβ的沉積和tau蛋白過度磷酸化[66]。新神經(jīng)元和突觸的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的分化、成熟和存活在與神經(jīng)生長因子有關(guān)，同時也與tau蛋白磷酸化存在密切聯(lián)系[67]。

因此, OA腦內(nèi)注射的動物模型，不僅能將與tau蛋白磷酸化有關(guān)的蛋白活性作為干預(yù)AD的療效評價指標，也可針對不同AD假說進行相關(guān)蛋白濃度檢測。

3 小 結(jié)

OA種類多樣，常規(guī)OA不溶于水，需在DMSO、甲醇、乙醇中溶解才能使用，也有OA鈉鹽、OA銨鹽能直接溶于水。當前研究的OA腦內(nèi)注射的鼠種多為SD大鼠，按照腦立體定位圖譜標準，模型鼠體質(zhì)量需嚴格控制，因受雌激素對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，雄性鼠是首選模型復(fù)制對象。OA腦內(nèi)注射部位多選雙側(cè)或單側(cè)腦內(nèi)海馬、側(cè)腦室; OA的注射劑量與濃度需根據(jù)動物耐受程度進行制備; 經(jīng)OA腦內(nèi)注射頻次、手術(shù)后的行為學(xué)檢測時間尚不統(tǒng)一; AD模型檢測方法種類繁多，其中以Morris水迷宮應(yīng)用最為廣泛; OA腦內(nèi)注射動物模型相關(guān)病理學(xué)檢測應(yīng)圍繞tau蛋白磷酸展開。

綜上所述，利用OA腦內(nèi)注射建立的AD模型在行為學(xué)和形態(tài)學(xué)上與AD臨床癥狀相似，且符合tau蛋白磷酸化改變的AD發(fā)病機制。本文將相關(guān)實驗的造模條件進行總結(jié)，為今后tau蛋白磷酸化為特征的AD模型建立和機制的研究、干預(yù)手段等提供理論依據(jù)和實驗參考。但OA腦內(nèi)注射建模方法仍存在相應(yīng)問題，不同的實驗室在OA的使用劑量、給藥部位、時間以及頻次等方面存在差異，多次注射OA和一次性O(shè)A注射產(chǎn)生的模型結(jié)果是否存在差異，需進一步研究。為更貼近臨床AD患者病理特征，研究采用OA聯(lián)合其他AD造模方法建立AD動物模型，除研究機制存在一定差異外，認知功能無明顯差異。臨床上相關(guān)研究仍然較少，需要進行進一步研究。