補(bǔ)腎化痰祛瘀湯的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制探究*

展 昆，周麗娟，劉瑞琦，伍新林，劉嘉輝，黃穎娟

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種慢性、進(jìn)行性、不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶障礙、認(rèn)知能力下降和行為能力喪失，嚴(yán)重影響患者的日常生活質(zhì)量[1]。新近研究發(fā)現(xiàn)，外源性神經(jīng)毒性物質(zhì)（如常見的不飽和醛類物質(zhì)、亞硝胺類物質(zhì)等）可導(dǎo)致大腦持續(xù)的氧化應(yīng)激損害，從而誘發(fā)AD或加重AD病情[2-3]。丙烯醛（acrolein，ACR）作為飲食和環(huán)境中廣泛存在的、最具活性的不飽和醛類物質(zhì)[4]，被認(rèn)為和AD的發(fā)病密切相關(guān)[5]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)丙烯醛可誘導(dǎo)SD大鼠行為和認(rèn)知障礙，同時(shí)對(duì)HT22細(xì)胞具有神經(jīng)毒性作用，能產(chǎn)生和AD類似的病理?yè)p害[6]。因此，清除丙烯醛誘發(fā)的神經(jīng)毒性作用可能幫助改善AD病情。

目前認(rèn)為AD的發(fā)病是多因素、多環(huán)節(jié)的，西醫(yī)尚缺乏有效的治療方法來阻止或逆轉(zhuǎn)AD的病程進(jìn)展，且藥物治療的有效性仍然不能令人滿意[7-8]。AD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”的范疇，腎虛為本、痰瘀阻滯為標(biāo)的基本病機(jī)貫穿著AD發(fā)生發(fā)展的始終[9]，因此近年來關(guān)于AD的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療均格外側(cè)重對(duì)補(bǔ)腎、化痰、祛瘀等治法的應(yīng)用[10-12]。中藥多環(huán)節(jié)、多途徑的整體治療作用也更契合AD復(fù)雜的病理機(jī)制。

補(bǔ)腎化痰祛瘀湯是由全國(guó)老中醫(yī)藥專家秦鑒教授、金明華、黃穎娟副教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，在臨床治療AD中取得了較好的效果，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)使用丙烯醛誘導(dǎo)SD大鼠神經(jīng)毒性模型和HT22海馬神經(jīng)元毒性模型，通過觀測(cè)補(bǔ)腎化痰祛瘀湯對(duì)SD大鼠行為學(xué)、海馬組織病理學(xué)及HT22細(xì)胞活力的影響，探究其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，以期為中醫(yī)藥清除丙烯醛神經(jīng)毒性作用、防治AD提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量180～220 g，均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0029。大鼠飼養(yǎng)于12 h晝夜交替SPF級(jí)屏障環(huán)境獨(dú)立通氣籠中，溫度控制在24～26℃、相對(duì)濕度45%～55%。大鼠在給予丙烯醛之前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)獲得中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)：IACUC-DB-16-0508。

1.2 細(xì)胞HT22細(xì)胞系由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院提供。

1.3 藥物與試劑 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯，方藥組成：熟地黃15 g，山萸肉15 g，枸杞子15 g，制何首烏15 g，遠(yuǎn)志10 g，石菖蒲10 g，川芎10 g，桃仁12 g，丹參12 g。上述中藥顆粒均由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，按照藥物比例溶于生理鹽水，生藥質(zhì)量濃度為0.362 5 g/mL。鹽酸多奈哌齊片（批號(hào)：100801053，規(guī)格：5 mg/片）購(gòu)于衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司；BDNF抗體（批號(hào)：Ab108319）、TrkB抗體（批號(hào)：Ab18987）、ADAM10抗體（批號(hào)：Ab124695）均購(gòu)自Abcam公司；APP抗體（批號(hào)：2452）、GAPDH抗體（批號(hào)：2118）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；IgG-HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號(hào)：sc-2004）購(gòu)自SANTA CRUZ公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：c11965500）購(gòu)自GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：GNM25200）購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清FBS（批號(hào)：2916754）購(gòu)自美國(guó)MP公司。

1.4 主要儀器WMT-200型Morris水迷宮（成都泰盟科技有限公司）；JJ100型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；XD5-1B型倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Mini型蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）；LG2000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；MM-55785-00型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)SHELLAB公司）；TGL-18R型冷凍高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組、造模和給藥 將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、丙烯醛模型組、中藥對(duì)照組、中藥治療組（丙烯醛+補(bǔ)腎化痰祛瘀湯）、多奈哌齊治療組（丙烯醛+多奈哌齊），每組15只。丙烯醛灌胃濃度和前期實(shí)驗(yàn)濃度一致[6]，即灌胃劑量為2.5 mg/kg。模型組大鼠每天08:00:00使用丙烯醛灌胃1次，2.5 mg/kg，中藥治療組和多奈哌齊治療組大鼠在灌胃丙烯醛的同時(shí)給予相應(yīng)的干預(yù)措施，根據(jù)大鼠與人體體表面積單位換算，補(bǔ)腎化痰祛瘀湯灌胃劑量為8 mL/kg，中藥治療組大鼠每天14:00:00使用補(bǔ)腎化痰祛瘀湯灌胃1次；多奈哌齊治療組按0.42 mg/kg劑量每天14:00:00灌胃鹽酸多奈哌齊片溶液1次，空白對(duì)照組和中藥對(duì)照組大鼠分別采用等體積生理鹽水和補(bǔ)腎化痰祛瘀湯灌胃，8 mL/kg，周期為3個(gè)月。

2.1.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后，分別采用定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。在整個(gè)測(cè)試過程中，平臺(tái)始終置于第三象限，連續(xù)4 d，每天對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行3次訓(xùn)練，第4天撤除安全平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。分別記錄各組大鼠到達(dá)安全平臺(tái)的時(shí)間（即逃避潛伏期）、120 s內(nèi)穿越原安全平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)（即穿越平臺(tái)次數(shù)）。

2.1.3 HE染色觀察大鼠海馬病理形態(tài)變化 行為學(xué)檢測(cè)后，將大鼠進(jìn)行麻醉、灌注直至大鼠肢體變得僵硬，冰上取腦并分離完整的海馬組織。用于病理切片的鼠腦置于4%多聚甲醛中固定6 h后，浸于30%蔗糖溶液中脫水，至腦組織沉至瓶底后取出，石蠟包埋，制作大鼠海馬CA1區(qū)4 μm厚的橫斷面腦切片，脫蠟脫水后置于蘇木素染液5～10 min，經(jīng)蒸餾水沖洗、鹽酸乙醇分化后置于伊紅染液浸染3～5 min，蒸餾水沖洗后依次脫水和透明，封片拍照。

2.1.4 Western blotting法 檢 測(cè) 海 馬 中BDNF/TrkB、APP及ADAM10的蛋白表達(dá)水平BCA試劑盒測(cè)定大鼠海馬組織蛋白質(zhì)濃度。按照20 μg蛋白計(jì)算上樣量，將組織樣品裂解液和凝膠上樣緩沖液混合。用5%濃縮膠和10%分離膠，SDS-PAGE電泳后取BDNF、TrkB、APP及ADAM10蛋白所在的凝膠條帶進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)印。隨后浸入5%脫脂牛奶中封閉90 min。將稀釋好的一抗均勻覆蓋于PDVF膜表面4℃過夜孵育，用TBST洗3次，每次10 min。將稀釋好的二抗加入PDVF膜表面室溫孵育1 h，用TBST洗滌膜3次，每次5 min。用ECL試劑盒進(jìn)行顯色曝光，使用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。使用Image J分析各樣本灰度值。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥物制備與細(xì)胞模型制備 將補(bǔ)腎化痰祛瘀湯顆粒制成每毫升含1 g生藥的溶液（以上藥物共114 g，加至生理鹽水中，總?cè)莘e為114 mL，反復(fù)攪拌離心過夜，直至完全溶解），離心后多次過濾除菌，取濾液置于冰箱備用。細(xì)胞用時(shí)以無血清培養(yǎng)基稀釋，過濾除菌。中藥終溶液配制方法：如5%中藥即95 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基+5 μL中藥溶液。多奈哌齊片溶液制備：將多奈哌齊片碾碎至粉末，用PBS溶解制成1 mmol/L的溶液，多次過濾除菌，取濾液置于冰箱備用，臨用前稀釋成10 μmol/L濃度。

HT22海馬神經(jīng)元毒性模型的制備：按照課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，ACR神經(jīng)損害模型采用25 μmol/L丙烯醛對(duì)HT22細(xì)胞作用24 h，即得。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物保護(hù)濃度測(cè)定 將HT22細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)半數(shù)抑制濃度（IC50）曲線，采取IC50值的1/2、1/4、1/8濃度的中藥含藥培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、2%中藥組、3%中藥組、5%中藥組、10%中藥組、多奈哌齊組。對(duì)照組加入空白培養(yǎng)基，其余組分別采用含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，即各組加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測(cè)定各組光密度（OD值），檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化。

2.2.3 MTT法測(cè)定與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將HT22細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、2%中藥組、3%中藥組、5%中藥組、多奈哌齊組，空白對(duì)照組和模型組加入空白培養(yǎng)基，給藥組采用含相對(duì)應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)，預(yù)處理1 h后，每組均再加入25 μmol/L丙烯醛，24 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，并在倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.2.4 Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白及BDNF/TrkB通路抑制劑細(xì)胞毒性測(cè)定 將HT22細(xì)胞分為空白對(duì)照組、中藥對(duì)照組、模型組、中藥治療組和多奈哌齊組，各組細(xì)胞Western blotting檢測(cè)及分析方法同“2.1.4”。將HT22細(xì)胞分為模型組、抑制劑組、5%中藥組和多奈哌齊組，采用BDNF/TrkB通路抑制劑K252a干預(yù)HT22細(xì)胞，再予補(bǔ)腎化痰祛瘀湯和多奈哌齊治療，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，方法同“2.2.3”。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 各組大鼠行為學(xué)比較 與空白對(duì)照組比較，丙烯醛模型組大鼠定位航行時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與丙烯醛模型組比較，中藥治療組和多奈哌齊治療組大鼠定位航行時(shí)間均明顯縮短（P＜0.01），平臺(tái)穿越次數(shù)均明顯增加（P＜0.05），且兩組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)相當(dāng)；中藥對(duì)照組大鼠定位航行時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠行為學(xué)比較 （±s，n=15）

3.1.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變 空白對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和細(xì)胞核形態(tài)正常，神經(jīng)元之間邊界清楚，排列整齊；與空白對(duì)照組比較，中藥對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)無明顯改變；而丙烯醛模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，細(xì)胞核縮小變形；與丙烯醛模型組比較，中藥治療組和多奈哌齊治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)均出現(xiàn)明顯改善，神經(jīng)元數(shù)量增多，且中藥治療組改善效果更為明顯。（見圖2）

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變 （HE，×400）

3.1.3 各組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，丙烯醛模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01），APP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與丙烯醛模型組比較，中藥治療組和多奈哌齊治療組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），APP蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）。中藥對(duì)照組大鼠海馬組織BDNF、TrKB、ADAM10、APP蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表達(dá)Western blotting圖

圖4 各組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=15）

3.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊對(duì)HT22細(xì)胞活性的影響 與空白對(duì)照組比較，2%中藥、3%中藥、5%中藥、10 μmol/L多奈哌齊均可在一定程度上提高細(xì)胞存活率，提示其對(duì)HT22細(xì)胞無明顯毒性作用；而10%中藥使HT22細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01），提示10%中藥可能存在細(xì)胞毒性，故后續(xù)研究不再采用10%中藥。（見圖5～6）

圖5 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)后各組HT22細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

圖6 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)后各組HT22細(xì)胞存活率比較 （±s，n=3）

3.2.2 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊對(duì)HT22神經(jīng)元毒性模型的影響 與模型組比較，5%中藥和10 μmol/L多奈哌齊均能顯著提高受丙烯醛神經(jīng)毒性影響的細(xì)胞活力（P<0.01），2%中藥、3%中藥同樣能提高丙烯醛影響下的HT22細(xì)胞活力（P<0.05），但效果不如5%中藥明顯，故后續(xù)機(jī)制研究采用5%補(bǔ)腎化痰祛瘀湯。（見圖7～8）

圖7 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)神經(jīng)毒模型后各組HT22細(xì)胞形態(tài)圖 （×200）

圖8 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)神經(jīng)毒模型后各組HT22細(xì)胞存活率比較 （±s，n=3）

3.2.3 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊對(duì)HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01），APP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；中藥治療組和多奈哌齊組HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），APP蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；中藥對(duì)照組HT22細(xì)胞中APP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01），BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖9～10）

圖9 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)后各組HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表達(dá)Western blotting圖

圖10 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯及多奈哌齊干預(yù)后各組HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=5）

3.2.4 補(bǔ)腎化痰祛瘀湯對(duì)BDNF/TrKB通路的特異性 與模型組比較，抑制劑組HT22細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），提示K252a可加劇丙烯醛的細(xì)胞毒性。5%中藥組和多奈哌齊組細(xì)胞存活率均明顯高于抑制劑組（P＜0.05）。（見圖11）

圖11 BDNF/TrkB通路抑制劑干預(yù)后各組HT22細(xì)胞存活率比較 （±s，n=3）

4 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD的病位在腦，與心、腎、肝、脾相關(guān)。AD患者年老體弱，腎虛精虧，髓海不足；同時(shí)五臟虛損，精、氣、血、津液運(yùn)行無力，以致痰濁瘀血內(nèi)生，痰蒙清竅，瘀阻腦竅，神機(jī)失用，發(fā)為癡呆。所以治療當(dāng)以充髓養(yǎng)腦、開郁逐痰、活血通竅為主。補(bǔ)腎化痰祛瘀湯中熟地黃、制何首烏補(bǔ)腎益精，補(bǔ)血填髓；枸杞子、山萸肉滋補(bǔ)肝腎，澀精固脫；石菖蒲、遠(yuǎn)志共起開竅豁痰、醒神益智、交通心腎之功；川芎、丹參、桃仁活血祛瘀，養(yǎng)血行氣；諸藥合用共奏補(bǔ)腎化痰祛瘀之功。

AD的病理學(xué)特征主要包括β-淀粉樣蛋白（Amyloid-beita peptides，Aβ）沉積而形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化所形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)及神經(jīng)元的變性丟失[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)丙烯醛具有神經(jīng)毒性，不僅可以導(dǎo)致SD大鼠認(rèn)知功能障礙，引起大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的丟失，同時(shí)丙烯醛能在HT22神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生神經(jīng)毒性，誘發(fā)類似AD的病理表現(xiàn)。這與本課題組前期研究結(jié)果一致[6]。而補(bǔ)腎化痰祛瘀湯和多奈哌齊均可改善這一病理?yè)p害，提高受丙烯醛影響的HT22細(xì)胞活力，表明補(bǔ)腎化痰祛瘀湯和多奈哌齊具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用。且從海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損害恢復(fù)程度上看，補(bǔ)腎化痰祛瘀湯的改善作用更為明顯。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的重要成員，廣泛分布于海馬和皮層等區(qū)域，對(duì)減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的損傷、大腦神經(jīng)元的發(fā)育、軸突和樹突的生長(zhǎng)及突觸的可塑性具有十分重要的意義[14-15]。BDNF可與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）特異性結(jié)合，通過磷酸化TrkB受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。BDNF/TrkB信號(hào)通路與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]，有研究發(fā)現(xiàn)AD患者大腦海馬和前額皮質(zhì)中BDNF及TrkB蛋白表達(dá)均明顯降低[17-18]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)AD大鼠海馬組織中BDNF表達(dá)升高能夠改善AD的癥狀，阻斷BDNF/TrkB通路可加劇海馬神經(jīng)元損害[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)丙烯醛作用后大鼠海馬組織和HT22細(xì)胞內(nèi)BDNF/TrkB通路蛋白水平均明顯降低，且BDNF/TrkB信號(hào)通路抑制劑K252a作用可加重丙烯醛神經(jīng)毒性，表明丙烯醛可能通過損壞BDNF/TrkB信號(hào)通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。而給予補(bǔ)腎化痰祛瘀湯后可明顯提升BDNF/TrkB通路蛋白水平，提示補(bǔ)腎化痰祛瘀湯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能是上調(diào)BDNF/TrkB信號(hào)通路。

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）作為Aβ的主要來源，在大腦內(nèi)的過多表達(dá)可能會(huì)增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[20]，故降低APP的表達(dá)、減少Aβ的沉積仍然是目前AD藥物治療的重要途徑[8]。APP在生理?xiàng)l件下可經(jīng)非淀粉樣途徑被α內(nèi)分泌酶分解成不具有神經(jīng)毒性的可溶性片段sAPPα，而在病理?xiàng)l件下則經(jīng)淀粉樣途徑被β、γ內(nèi)分泌酶剪切成具有神經(jīng)毒性的Aβ，且兩種途徑呈競(jìng)爭(zhēng)性代謝關(guān)系，因此去整合素金屬蛋白酶10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）作為主要的α內(nèi)分泌酶在減少Aβ沉積方面具有重要意義[21-22]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADAM10的活性升高可以促進(jìn)APP分解、降低丙烯醛濃度，進(jìn)而提高AD患者的認(rèn)知功能[23]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，丙烯醛不僅可以誘導(dǎo)大鼠海馬和HT22神經(jīng)細(xì)胞APP的過多表達(dá)，同時(shí)會(huì)降低具有神經(jīng)保護(hù)作用的ADAM10水平，而補(bǔ)腎化痰祛瘀湯治療后能降低APP在海馬組織和HT22神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)能明顯提升ADAM10水平，并通過這一途徑，最終減少Aβ沉積，表明補(bǔ)腎化痰祛瘀湯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與增加ADAM10表達(dá)、促進(jìn)APP蛋白分解有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎化痰祛瘀湯可改善外源性丙烯醛誘導(dǎo)的SD大鼠認(rèn)知功能障礙并減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，同時(shí)降低丙烯醛對(duì)HT22細(xì)胞的神經(jīng)毒性，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其潛在的作用機(jī)制可能為上調(diào)BDNF/TrkB信號(hào)通路以減輕海馬神經(jīng)元損傷、增加ADAM10表達(dá)、促進(jìn)APP蛋白分解，最終可能通過減少Aβ沉積，幫助改善AD病情。