L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃芩解毒顆粒水提取工藝*

羅朝亮，韋開聽，龍立活，陸治宇，周賢強(qiáng)，張 浩，吳芳芳△，陳 路

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園·西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；2.廣西壯要方醫(yī)院，廣西 南寧 530150）

五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》卷七十二方，由金銀花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子、野菊花組方[1］，具有清熱解毒、消散疔瘡之功效，消癰散結(jié)之功偏重，主治熱毒蘊(yùn)蒸肌膚所致疔瘡癰腫。廣西壯要方醫(yī)院對(duì)五味消毒飲原處方進(jìn)行了加減，增加黃芩清熱燥濕、穿心蓮瀉火解毒、梔子涼血消癰，減去紫花地丁、紫背天葵子，最終形成了由黃芩、山銀花、穿心蓮、蒲公英、野菊花、梔子6味藥材組方的黃芩解毒顆粒，旨在提升其清熱、涼血、解毒之功效，治療風(fēng)熱感冒的療效良好。為保證改良后處方的質(zhì)量和療效，提高制劑的安全性與可控性，本研究中對(duì)黃芩解毒顆粒的制劑工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為該制劑的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210型高效液相色譜儀（美國瓦里安公司）；BSA124S型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為萬分之一）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率200 W，頻率40 kHz）；ZF-8型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110715-201821，含量以95.4 %計(jì)）；黃芩（產(chǎn)地山西，批號(hào)為20180902），山銀花（產(chǎn)地湖南，批號(hào)為20190401），穿心蓮（產(chǎn)地廣西，批號(hào)為20190501），蒲公英（產(chǎn)地湖北，批號(hào)為20181201），野菊花（產(chǎn)地湖北，批號(hào)為20180701），梔子（產(chǎn)地江西，批號(hào)為20180801），均購于廣西仙茱中藥科技有限公司，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園藍(lán)鳴生主任藥師鑒定為正品；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件[2-7］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（48∶52∶0.1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

取黃芩苷對(duì)照品0.025 5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為0.243 3 mg/mL）；精密量取對(duì)照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，即得黃芩苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.121 7 mg/mL）。分別取正交試驗(yàn)項(xiàng)下黃芩解毒顆粒浸膏樣品各0.2 g，精密稱定，共9份，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取除去黃芩以外的其他藥材，按優(yōu)選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.1.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芩苷色譜峰分離效果良好，且陰性對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Baicalin A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1，2，3，4，5，6，7，8 mL，分別置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=33.46X+2.279 7，r=0.999 7（n=8）。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.243～1.946μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限確定：取2.1.2項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品溶液，用50%甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時(shí)的進(jìn)樣量計(jì)算檢測(cè)限和定量限。結(jié)果黃芩苷的檢測(cè)限為7.5 ng，定量限為22.4 ng。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件在1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日間精密度，并記錄峰面積。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為0.79%（n=6），日間精密度RSD為1.25%（n=18），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批樣品1 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，1，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.63%（n=7），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品1 g，精密稱定，共6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.82%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取黃芩苷對(duì)照品0.039 3 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為0.374 9 mg/mL）；取已知黃芩苷含量的樣品0.5 g，精密稱定，共9份，依次精密加入上述黃芩苷對(duì)照品貯備液3，6，9 mL，各3份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of baicalin（n=9）

2.1.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷含量。

2.2 干膏得率測(cè)定

取樣品水提濃縮稠膏適量，精密稱定，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，轉(zhuǎn)移至烘箱，以105℃干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，按公式[干膏得率（%）=（干膏質(zhì)量×稠膏總質(zhì)量）/（藥材飲片質(zhì)量×取樣量）×100%］計(jì)算。

2.3 單因素試驗(yàn)[8-9］

加水量：按處方稱取藥材5份，分別按藥材量的6倍、8倍、10倍、12倍、14倍加水，置鍋中煎煮1.0 h，濾過，水浴蒸發(fā)濃縮成浸膏。按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芩苷回收率和干膏得率。結(jié)果見圖2 A?？梢?，加入藥材8倍、10倍、12倍量水時(shí)，藥材干浸膏得膏和黃芩苷回收率均較高，且從8倍量起增加趨于平緩。故加水量選擇加入8倍、10倍、12倍進(jìn)行正交試驗(yàn)。

煎煮時(shí)間：按處方稱取藥材5份，分別加入8倍量水，煎煮提取1次，煎煮時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，濾過，水浴蒸發(fā)濃縮成浸膏。按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芩苷回收率和干膏得率，結(jié)果見圖2 B?？梢姡逯髸r(shí)間為1.0 h時(shí)，黃芩苷回收率和干膏得率均最大。故煎煮時(shí)間選擇0.5，1.0，1.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

煎煮次數(shù)：按處方稱取藥材5份，分別加入8倍量水，煎煮1.0 h，分別煎煮1次、2次、3次、4次，濾過，合并濾液，水浴蒸發(fā)濃縮成浸膏。按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芩苷回收率和干膏得率，結(jié)果見圖2 C?？梢?，煎煮2次后，黃芩苷回收率趨于平緩甚至下降，干膏得率逐漸增大。故煎煮次數(shù)選擇1次、2次、3次進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 單因素試驗(yàn)優(yōu)選黃芩解毒顆粒水提取工藝A.Amount of water addition B.Decocting time C.Decocting timesFig.2 Optimization of water extraction process of Huangqin Jiedu Granules by the single factor test

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以干膏得率和黃芩苷回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以加水量（因素A）、煎煮時(shí)間（因素B）、煎煮次數(shù)（因素C）為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見表2。按制劑處方比例稱取黃芩解毒顆粒方藥材飲片280 g，其中黃芩50 g，山銀花35 g，穿心蓮50 g，蒲公英50 g，野菊花45 g，梔子50 g，共9份，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)與試驗(yàn)。結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

由表3極差分析可知，以干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，影響因素由大至小為煎煮時(shí)間（因素B）＞煎煮次數(shù)（因素C）＞加水量（因素A），且B2，C2，A2最佳，但A1與A2的差異不大；以黃芩苷回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，影響因素由大至小為煎煮時(shí)間（因素B）＞煎煮次數(shù)（因素C）＞加水量（因素A），且B2，C2，A1最佳。采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為對(duì)結(jié)果有顯著影響，結(jié)果見表4。可見，以干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，煎煮時(shí)間（因素B）為顯著影響因素（P＜0.05），而加水量、煎煮次數(shù)均為無顯著影響因素（P＞0.05）；以黃芩苷回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)均為無顯著影響因素（P＞0.05）。綜合考慮成本和提取效率，確定最佳工藝為A1B2C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次1.0 h，濾過，水浴蒸發(fā)，濃縮成稠膏。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按制劑處方比例稱取黃芩解毒顆粒處方藥材飲片280 g，各3份，按優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行煎煮，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算干膏得率和黃芩苷回收率。結(jié)果見表5?？梢姡筛嗟寐屎椭笜?biāo)性成分黃芩苷回收率高且穩(wěn)定，表明優(yōu)選工藝合理、可行。

表5 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%，n=3）Tab.5 Results of the verification test of the optimal extraction process（%，n=3）

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

五味消毒飲為中醫(yī)常用方劑，其方劑及加減方廣泛應(yīng)用于治療眼科早期瞼腺炎[10］、外科急性關(guān)節(jié)炎[11］、痤瘡[12］、濕疹[13］等疾病，卻鮮見報(bào)道治療風(fēng)熱感冒等發(fā)熱性疾病。廣西壯要方醫(yī)院以廣西壯藥[14］應(yīng)用為理論基礎(chǔ)，通過辨證論治，對(duì)五味消毒飲進(jìn)行加減而創(chuàng)制黃芩解毒顆粒。方中，黃芩為君藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血等功效[15］。評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇是本研究的關(guān)鍵步驟之一。黃芩為君藥，起主要治療作用。黃芩苷為黃芩的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗過敏等藥理作用[16-18］，與本方專用于治療熱毒侵襲引發(fā)的風(fēng)熱感冒一致。考慮本方為復(fù)方中藥制劑，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為多成分共同作用，故選擇黃芩苷回收率和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 色譜條件選擇

方法學(xué)考察關(guān)系到試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，由于黃芩解毒顆粒為新創(chuàng)制劑，相關(guān)研究較少，系統(tǒng)參數(shù)確定困難。曾考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，色譜峰峰形和分離度均不理想，最終采用甲醇-水-磷酸（48∶52∶0.1，V/V/V）作為流動(dòng)相的效果較好；曾考察不同品牌色譜柱[Kromasil 100-5 C18柱、Agilent Eclipse XDB C18柱、Diamomsil C18柱，（250 mm×4.6 mm，5μm）］，結(jié)果色譜峰峰形和分離度均符合要求。

3.3 水提取工藝方法評(píng)價(jià)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)常用于優(yōu)化生產(chǎn)工藝，本研究中采用L9（34）正交試驗(yàn)確定了黃芩解毒顆粒的最佳水提取工藝，操作簡(jiǎn)便、指標(biāo)成分含量高，可用于規(guī)?；a(chǎn)。黃芩解毒顆粒提取工藝的初步研究可為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。