木薯MeSAP13基因的克隆及其抗細(xì)菌性枯萎病功能鑒定

張子奇，李 可，陳銀華，張銀東，張肖飛，耿夢婷*

木薯基因的克隆及其抗細(xì)菌性枯萎病功能鑒定

張子奇1，李 可1，陳銀華1，張銀東1，張肖飛2，耿夢婷1*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口 570228；2. 國際熱帶農(nóng)業(yè)中心，哥倫比亞 卡利 AA 6713

脅迫相關(guān)蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物對脅迫應(yīng)答和脅迫調(diào)控中起重要作用。木薯是我國重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，細(xì)菌性枯萎?。╟assava bacterial blight, CBB）已嚴(yán)重危害我國木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為了探討木薯基因在抗細(xì)菌性枯萎病中的作用，本研究克隆了我國主栽木薯品種‘華南8號’（SC8）的基因，分析該基因在細(xì)菌性枯萎病病原菌侵染時的表達(dá)模式及其編碼蛋白的基本特性。利用基于木薯花葉病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技術(shù)抑制了基因在木薯SC8葉片中的表達(dá)，通過接種細(xì)菌性枯萎病病原菌HN11對的抗病功能進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在病原菌HN11侵染葉片3 d后基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明木薯基因能夠響應(yīng)病原菌的侵染；在VIGS載體轉(zhuǎn)化木薯葉片40 d后發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)化pCsCMV-A載體的對照葉片相比，在轉(zhuǎn)化pCsCMV-MeSAP13葉片中的表達(dá)量顯著下調(diào)了40%～60%，表明通過VIGS技術(shù)成功抑制了在木薯葉片中的表達(dá)。將病原菌HN11接種至基因沉默葉片和對照植株葉片，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株接種葉片的水漬狀病斑面積顯著大于對照植株接種葉片。分析侵染后0、3、6 d病原菌HN11的繁殖情況發(fā)現(xiàn)，在侵染后3 d和6 d的基因沉默植株接種葉片中，其病原菌數(shù)量顯著高于對照植株接種葉片。以上研究結(jié)果表明，抑制基因的表達(dá)，降低了木薯對細(xì)菌性枯萎病的抗性。

木薯；VIGS；基因；細(xì)菌性枯萎病

木薯（Crantz）是世界三大薯類作物之一，是全球第六大糧食作物，為熱帶地區(qū)7億人口提供主糧[1]。木薯在全球淀粉作物產(chǎn)量中排名第五，其淀粉含量高達(dá)其總貯藏根干重的90%，因此被稱為“地下糧倉”和“淀粉之王”[1-2]。除了作為糧食作物以外，木薯作為工業(yè)以及生物能源的原料在我國占據(jù)重要地位，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。

病害一直是限制木薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要制約因素之一[3]。木薯細(xì)菌性枯萎?。╟assava bacterial blight, CBB）是由菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種（pv，）引起的細(xì)菌性病害，該病首先發(fā)生于巴西，通過攜帶病原菌的種莖或種子被傳播到世界各地[4]。木薯受細(xì)菌性枯萎病危害的部位主要在葉片及莖稈[5]。在受到危害后，葉片開始出現(xiàn)水漬狀病斑[6]，隨著時間推移，病斑變?yōu)楹稚?，最終導(dǎo)致葉片枯萎、脫落；受害莖稈的病斑在后期變?yōu)楹诤稚?，其周圍附著的葉片逐漸凋零，枝條逐漸萎焉，當(dāng)周圍環(huán)境濕度較大時還會出現(xiàn)黃色菌膿[7]。該病曾導(dǎo)致我國海南地區(qū)木薯產(chǎn)量損失超過20%[7]，這也給許多國家的木薯生產(chǎn)帶來毀滅性的打擊，并已成為世界上重要的檢疫性病害之一[8]。木薯細(xì)菌性枯萎病在生產(chǎn)上主要通過苗期檢疫、藥物防治等措施進(jìn)行防控。我國主栽的華南系列、桂熱系列木薯品種均不抗該病[9]。因此，創(chuàng)制抗細(xì)菌性枯萎病木薯新種質(zhì)，選育抗病新品種，增強(qiáng)我國木薯主栽品種的抗病性是防控細(xì)菌性枯萎病危害木薯種植業(yè)的根本出路。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)木薯的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）編碼基因的表達(dá)受到病原菌HN11侵染的誘導(dǎo)，且該基因能互補(bǔ)擬南芥、突變體阻斷的PTI反應(yīng)，在擬南芥中過表達(dá)基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性[10]，表明參與了木薯對細(xì)菌性枯萎病的抗病過程。利用酵母雙雜技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)室篩選到與MeMAPK1互作的抗逆相關(guān)蛋白MeSAP13，該蛋白具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域。研究表明，在煙草中過表達(dá)水稻基因使煙草植株的抗病性增強(qiáng)[11]；擬南芥基因的過表達(dá)植株表現(xiàn)出對非寄主病原菌丁香假單胞菌（pv.）的敏感性增加，表明在基礎(chǔ)抗性中起關(guān)鍵作用[12]；蘭花SAP蛋白Pha13及擬南芥同源蛋白AtSAP5在植物抗病毒免疫中起著重要的調(diào)控樞紐作用[13]。本研究推測MeSAP13可能與MeMAPK1協(xié)同調(diào)控木薯對細(xì)菌性枯萎病的抗病過程。目前關(guān)于參與木薯抗細(xì)菌性枯萎病過程的作用機(jī)制尚不清楚。本研究克隆了我國主栽木薯品種‘華南8號’（SC8）的基因，分析了該基因在細(xì)菌性枯萎病病原菌侵染時的表達(dá)模式；進(jìn)一步利用VIGS技術(shù)沉默基因的表達(dá)，接種細(xì)菌性枯萎病病原菌，觀察木薯的抗病性變化，確定基因與木薯抗性之間的關(guān)系。本研究對于闡明木薯細(xì)菌性枯萎病的致病機(jī)制具有重要意義，為培育木薯抗病新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料為木薯栽培品種‘華南8號’（SC8），供試菌株細(xì)菌性枯萎病菌（pv.HN11,HN11）由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，VIGS病毒載體pCsCMV-B和pCsCMV-A由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所周鵬老師課題組惠贈。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆及生物信息學(xué)分析 利用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP441]提取木薯SC8葉片RNA。利用RevertAid Master Mix試劑盒（賽默飛世爾科技公司，M1632）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，利用特異性引物VIGS- MeSAP13-F/R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至公司測序。

表1 本研究所用引物

根據(jù)基因序列推導(dǎo)其蛋白序列，分析其理化性質(zhì)，氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和平均親水系數(shù)由在線網(wǎng)站ExPASy （https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測。運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫的在線網(wǎng)站CDD （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb / bwrpsb.cgi）進(jìn)行MeSAP13蛋白的結(jié)構(gòu)域分析。利用在線網(wǎng)站Plant-mPLoc SEfvEf （http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對MeSAP13蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.2基因的表達(dá)模式分析 利用病原菌HN11侵染木薯SC8葉片，采用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取侵染0、3、6 h和1、3、6 d后木薯葉片中的RNA，利用RevertAid Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以為內(nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，引物（EF1a- F/R，MeSAP13-F/R）見表1。利用2ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達(dá)量，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)試驗(yàn)，利用-test方法對結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.2.3VIGS重組載體pCsCMV的構(gòu)建 以木薯cDNA為模板，利用特異性引物VIGS- MeSAP13-F/R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，利用海南壹田生物科技有限公司的Nimble Cloning試劑盒進(jìn)行NC克隆反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，使用引物CsCMV-F/R（表1）進(jìn)行PCR菌落篩選陽性克隆，送至公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，重組載體命名為pCsCMV-。

1.2.4 含VIGS載體的農(nóng)桿菌侵染木薯 將VIGS重組載體pCsCMV-、正對照pCsCMV-B和負(fù)對照pCsCMV-A轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落PCR鑒定出的陽性克隆至5 mL LB（50 μg/mL卡那霉素+ 25 μg/mL利福平）液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。取1 mL過夜培養(yǎng)菌液于50 mL LB（50 μg/mL卡那霉素+25 μg/mL利福平）液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min培養(yǎng)至600值為1.0。將菌液移至50 mL離心管中，4000 r/min離心5 min，棄上清。加入適量10 mmoL/L MES和10 mmoL/L MgCl2混合液重懸菌體，4000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。加入25 mL植物注射液（10 mmoL/L MES+10 mmoL/L MgCl2+ 200 μmoL/L乙酰丁香酮）重懸菌體，在室溫、黑暗條件下靜置3 h。選取長勢良好、狀態(tài)一致的木薯SC8，將菌液用1 mL注射器壓滲至木薯葉片背面，30 d后開始觀察表型變化并拍照記錄。

1.2.5基因的沉默效果檢測 利用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取接種40 d后木薯葉片中的RNA，利用RevertAid Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)對基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。用于qRT-PCR的引物見表1。利用2ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達(dá)量，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，利用-test方法對結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.2.6 木薯植株接種細(xì)菌性枯萎病及發(fā)病情況統(tǒng)計 將保存的木薯細(xì)菌性枯萎病病原菌HN11在含有氯霉素的LPGA固體培養(yǎng)基中28℃倒置培養(yǎng)2 d。挑取單克隆菌落于5 mL含有氯霉素LPGA液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min培養(yǎng)約16 h。吸取200 μL菌液涂布于含有氯霉素的LPGA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h左右。用10 mmoL/L MgCl2洗下菌體，4000 r/min離心5 min收集菌體，并用10 mmoL/L MgCl2清洗菌體2～3次，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL（600≈ 0.1）。陰性對照為10 mmoL/L MgCl2，用去除針頭的1 mL注射器將菌液接種至葉片背面。在接種后的3 d和6 d觀察木薯葉片水漬狀病斑擴(kuò)散情況并拍照記錄。

1.2.7 葉片病斑的細(xì)菌生長計數(shù) 用直徑為1 cm的打孔器取下接種HN11后的0、3、6 d木薯葉片，置于已滅菌的研缽中，加入1 mL MgCl2充分研磨，吸取100 μL上層研磨液，加入900 μL無菌水中得到稀釋液，以此類推，稀釋10倍、100倍、1000倍。取3個連續(xù)稀釋的濃度梯度的100 μL上清涂布于LPGA固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)量，根據(jù)平板上的菌落數(shù)計算葉片中的活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeSAP13基因的克隆

提取木薯SC8葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以此為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增條帶長度為522 bp（圖1），克隆測序所得基因序列（Manes.14G001000）與Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome- next.jgi.doe. gov/info/ Mesculenta_v8_1）的信息一致。

2.2 MeSAP13基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線網(wǎng)站分析基因開放閱讀框，顯示基因全長522 bp，由一個外顯子編碼。利用在線網(wǎng)站ExPASy分析木薯MeSAP13蛋白的生理生化性質(zhì)，結(jié)果顯示MeSAP13蛋白理論分子式為C793H1275N235O247S15，理論相對分子質(zhì)量為18.5 kDa，理論等電點(diǎn)pI值為8.44。該蛋白富含丙氨酸（Ala，9.8%）、賴氨酸（Lys，8.7%）、纈氨酸（Val，8.7%）、半胱氨酸（Cys，6.9%）、甘氨酸（Gly，6.9%）、絲氨酸Ser（Gly，6.9%）、天冬酰胺（Asn，6.4%）、脯氨酸（Pro，6.4%）、谷氨酸（Glu，5.2%）。MeSAP13蛋白親水指數(shù)從-2.744到2.222（負(fù)值表示親水性，正值表示疏水性），親水性平均指數(shù)為-0.349，表明該蛋白水溶性較好。MeSAP13蛋白的理論不穩(wěn)定系數(shù)為26.36，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用NCBI站點(diǎn)Conserved Domain Database分析MeSAP13蛋白保守結(jié)構(gòu)域（圖2），發(fā)現(xiàn)MeSAP13蛋白N端具有典型的A20鋅指結(jié)構(gòu)域，C端具有AN1鋅指結(jié)構(gòu)域，是典型的鋅指蛋白。利用在線網(wǎng)站Plant-mPLoc SEfvEf預(yù)測MeSAP13蛋白可能定位于細(xì)胞核。

M: DL2000 DNA marker.

圖2 MeSAP13蛋白的保守結(jié)構(gòu)與分析

2.3 MeSAP13基因的表達(dá)模式分析

為了探究木薯基因是否能夠響應(yīng)病原菌入侵，本研究用木薯細(xì)菌性枯萎病病原菌HN11侵染扦插盆栽45 d的木薯SC8。以不含病原菌的10 mmoL/L MgCl2為對照，分別取0、3、6 h和1 d、3 d、6 d木薯葉片，通過qRT-PCR技術(shù)檢測木薯基因的表達(dá)量變化。結(jié)果如圖3所示，HN11侵染3 d后，基因表達(dá)量顯著升高10倍，6 d后基因表達(dá)量下降，推測基因能夠響應(yīng)HN11侵染。

2.4 VIGS沉默效果的表型分析

陽性對照pCsCMV-B為含有病毒基因與指示基因的重組質(zhì)粒，陰性對照pCsCMV-A為僅含有病毒基因的質(zhì)粒。用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌去侵染野生型木薯SC8的葉片，利用病毒在植物體內(nèi)擴(kuò)增從而達(dá)到沉默目的基因的效果，含有指示基因的正對照會使植物合成葉綠素的能力受阻，導(dǎo)致新葉部分出現(xiàn)褪綠白化的現(xiàn)象[14]。如圖4所示，侵染大約40 d后，pCsCMV-B成功轉(zhuǎn)化的木薯新葉出現(xiàn)了明顯的白化表型，而轉(zhuǎn)化pCsCMV-A或pCsCMV的木薯新葉則無明顯變化。以正對照沉默指示基因產(chǎn)生的表型來指示基因的沉默效果，表明本研究所用的沉默體系能夠有效沉默木薯基因。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

圖4 VIGS接種后木薯表型變化

2.5 MeSAP13基因沉默效果檢測

為進(jìn)一步驗(yàn)證基因是否被有效沉默，利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。取VIGS沉默40 d后的pCsCMV和陰性對照pCsCMV-A木薯新葉葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板檢測基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在轉(zhuǎn)pCsCMV-木薯新葉中的表達(dá)量顯著降低，下降了40%～ 60%，說明基因表達(dá)受到了有效的沉默（圖5）。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.6 MeSAP13基因沉默后對木薯細(xì)菌性枯萎病抗病性的影響

為進(jìn)一步探究基因在木薯抗細(xì)菌性枯萎病中的作用，將病原菌HN11接種至沉默木薯葉片，以轉(zhuǎn)化pCsCMV-A木薯植株葉片為陰性對照。當(dāng)HN11侵染3 d后，葉片背面逐漸開始出現(xiàn)水漬狀病斑；侵染6 d后，可以明顯地看到病斑面積開始逐漸擴(kuò)大，且沉默后的pCsCMV植株產(chǎn)生的水漬狀病斑大于負(fù)對照pCsCMV-A（圖6A）。此結(jié)果說明沉默基因后植株對的病原菌HN11抗性減弱。

為了能夠?qū)Πl(fā)病程度進(jìn)行量化，利用ImageJ軟件計算葉片背面的病斑面積大小，并計算平均值（單位為mm2）。取各植株不同時間點(diǎn)的病斑面積大小繪制成柱狀圖，并進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果如圖6B所示，沉默3 d和6 d后的pCsCMV植株的病斑面積均顯著高于陰性對照pCsCMV-A，分別升高了49%和39%，說明沉默基因后木薯葉片對細(xì)菌性枯萎病的抗病性降低了。

為了進(jìn)一步確定侵染后木薯葉片的發(fā)病程度，利用細(xì)菌生長計數(shù)對不同時間點(diǎn)葉片病斑中病原菌的繁殖情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，侵染0 d時，各轉(zhuǎn)化木薯葉片病斑中細(xì)菌數(shù)目差異并不顯著，但在侵染3 d和6 d后，沉默基因的木薯葉片中含有的細(xì)菌數(shù)量高于陰性對照（圖6C）。證明了沉默基因促進(jìn)了HN11的增殖，導(dǎo)致木薯抗病性降低。

3 討論

本課題組前期利用酵母雙雜交篩選木薯抗細(xì)菌性枯萎病關(guān)鍵蛋白MeMAPK1的互作蛋白MeSAP13。本研究在木薯SC8中克隆到該互作蛋白的編碼基因后，通過序列比較發(fā)現(xiàn)該蛋白可能是一個SAP蛋白，因此，對基因及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在植物中，脅迫相關(guān)蛋白SAPs一般含有N-端A20鋅指結(jié)構(gòu)域和C-端AN1鋅指結(jié)構(gòu)域[15]。通過A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和組合形式將SAP蛋白分為4種類型，包括A20、AN1、A20+AN1、AN1+AN1[16]。其中，A20+AN1是植物中最常見的類型，比如水稻OsSAP1～OsSAP9，擬南芥AtSAP1～AtSAP10均含有A20+AN1鋅指結(jié)構(gòu)域[17]。本研究通過分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MeSAP13蛋白也含有A20+AN1鋅指結(jié)構(gòu)域。此外，基因中不含或含有少量的內(nèi)含子是此類蛋白的一個重要特點(diǎn)[18]，比如水稻基因家族中有11個基因沒有內(nèi)含子，番茄中有7個基因不含內(nèi)含子。本研究的木薯基因也不含內(nèi)含子。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子可以延遲調(diào)控反應(yīng)，表達(dá)水平對應(yīng)激反應(yīng)迅速變化的基因含有明顯較低的內(nèi)含子密度[19]。大部分SAPs定位于細(xì)胞核中，比如擬南芥AtSAP5[20]、小麥TaSAP1[21]、檉柳ThSAP6[22]、大麥HvSAP、HvSAP12[23]等均定位于細(xì)胞核。本研究中的MeSAP13也定位于細(xì)胞核中。綜上所述，基因及編碼蛋白與其他作物中的有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此我們認(rèn)為該基因是木薯中的一個基因。本研究對木薯SC8接種病原菌HN11，通過實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，侵染3 d后木薯基因的表達(dá)量上調(diào)，是對照的10倍。在其他植物中，基因也響應(yīng)病原菌的侵染，葡萄基因在白粉菌的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量在感病初期上調(diào)5倍[24]；香蕉基因在枯萎病菌Foc TR4侵染4 d后其表達(dá)量上調(diào)7.9倍[25]。表明本研究克隆的基因參與木薯對病原菌HN11侵染的響應(yīng)過程。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

VIGS（virus-induced gene silencing）技術(shù)是通過攜帶植物基因轉(zhuǎn)錄本序列的重組病毒侵染植物，激活宿主的核酸序列特異性降解系統(tǒng)，使得植物內(nèi)源基因沉默，從而引起表型變異，是鑒定植物基因功能的重要方法[26]。VIGS技術(shù)相比于傳統(tǒng)基因功能分析方法而言，具有快速、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，它避免了許多傳統(tǒng)基因功能分析方法的局限性[27]。目前，VIGS技術(shù)已在禾本科、十字花科、茄科、豆科等植物中廣泛應(yīng)用[28]。TUO等[14]利用木薯普通花葉病毒建立了木薯VIGS體系，為木薯基因功能鑒定提供了新技術(shù)。本研究利用CsCMV介導(dǎo)的VIGS技術(shù)對木薯基因進(jìn)行抗細(xì)菌性枯萎病功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)沉默后的基因表達(dá)量降低，削弱了木薯對細(xì)菌性枯萎病病原菌HN11的抗性，病菌更易于繁殖，病斑面積增大。此結(jié)果表明參與木薯先天免疫途徑，抑制基因的表達(dá)降低了木薯對細(xì)菌性枯萎病的抗性，但基因是否正調(diào)控木薯對細(xì)菌性枯萎病的抗性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果為下一步深入闡明基因在調(diào)控木薯抗病機(jī)制中的作用提供了基礎(chǔ)。

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Cloning of CassavaGene and Identification of Its Function Against Cassava Bacterial Blight

ZHANG Ziqi1, LI Ke1, CHEN Yinhua1, ZHANG Yindong1, ZHANG Xiaofei2, GENG Mengting1*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. International Center for Tropical Agriculture, Cali AA 6713, Colombia

Stress-associated proteins (SAPs) play an important role in plant response to stress and stress regulation. Cassava is an important food crop and economic crop in China, however, cassava bacterial blight (CBB) has seriously harmed the healthy development of cassava industry in China.In order to explore the role of cassavagene in cassava resistance to CBB, this study cloned the3 gene of cassava cultivar SC8, and analyzed the expression pattern of this gene in the infestation of bacterial blight pathogens and the basic characteristics of the coding protein.The expression ofin cassava SC8 leaves was inhibited by cassava mosaic virus-mediated gene silencing (VIGS) technology, and the resistance function ofwas identified by inoculating the bacterial blight pathogenHN11.The results showed that the expression ofwas significantly upregulated 3 d after the pathogenHN11 infected the leaves, indicating thatcould respond to the infection of pathogenic bacteria; after 40 days of transformation of cassava leaves with VIGS vector, it was found that the expression ofin the transformedleaves was significantly reduced by 40%-60% compared with the control leaves of the transformedvector, showing that the expression ofin cassava leaves was successfully inhibited by VIGS technology.The pathogenHN11 was inoculated into the leaves of thesilencing and control plants, and the water-stained lesion area on the inoculation leaves of thegene-silencing plants was found to be significantly larger than that of the control plants. We analyzed the reproduction of the pathogenHN11 at 0 d, 3 d and 6 d after infection, the number of pathogens in the inoculated leaves ofsilencing plants 3 d and 6 d after infection was significantly higher than that of the control plants. The above results show that inhibiting the expression ofreduces the resistance of cassava bacterial blight.

cassava; VIGS;gene; bacterial blight

S435.33

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.003

2022-03-17；

2022-04-07

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（No. 2018YFD1000500）；國家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（No. CARS-11-HNCYH）。

張子奇（1996—），女，碩士研究生，研究方向：作物分子育種。*通信作者（Corresponding author）：耿夢婷（GENG Mengting），E-mail：mengtinggeng8908@163.com。