4CL基因在海巴戟葉片莨菪亭累積過程中的功能研究

宮樹森，楊 霏，王青芬，楊自云，吳 田

基因在海巴戟葉片莨菪亭累積過程中的功能研究

宮樹森，楊 霏，王青芬，楊自云，吳 田*

西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，云南昆明 650224

為明確海巴戟葉片中莨菪亭累積規(guī)律，探究基因在其累積過程中起到的作用。利用高效液相色譜儀對離體的海巴戟成熟葉0～48 h內(nèi)莨菪亭含量進行測定，并測定經(jīng)不同濃度的阿魏酸處理后莨菪亭含量的變化。以阿魏酸為底物，利用紫外分光光度計進行酶活反應(yīng)的4CL總酶活性測定。對RNA-seq結(jié)果中7個基因進行qPCR，篩選出一個表達趨勢與莨菪亭含量及酶活變化趨勢一致的基因作為關(guān)鍵候選基因，進行全長克隆以及生物信息學(xué)分析，最后用qRT-PCR研究其表達特性。海巴戟葉片在采摘后48 h內(nèi)，莨菪亭含量在12 h時最高，達0.35 mg/g，48 h最低，為0.18 mg/g。4CL總酶活性變化與莨菪亭含量趨勢相近。阿魏酸處理后的葉片中4CL總酶活增加。通過qRT-PCR篩選到（DN15707）基因，克隆、測序后發(fā)現(xiàn)其長度為1632 bp，具備完整開放閱讀框，在NCBI進行序列比對及系統(tǒng)進化樹分析，確定該基因為基因家族中的基因，命名為?；蚩赡苁禽馆型だ鄯e過程中的關(guān)鍵基因，它能啟動4CL酶活，充分利用阿魏酸底物進而導(dǎo)致莨菪亭累積。

海巴戟；莨菪亭；總酶活；4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）；阿魏酸

海巴戟（L.）又稱諾麗（noni），是一種茜草科巴戟天屬的常綠植物，常為小喬木或灌木[1-2]，是一種新興熱帶果樹[3]。海巴戟中富含莨菪亭，可以抑制骨關(guān)節(jié)炎，防止關(guān)節(jié)軟骨退化和炎癥的發(fā)生[4]。莨菪亭也是一種天然的抗癌成分[5]，通過直接殺死癌細胞，防止新的癌細胞發(fā)展[6]，可以用來治療白血病。此外，海巴戟中的莨菪亭可以通過改善糖原儲存和脂質(zhì)、碳水化合物代謝來緩解疲勞[7]，在保護肝臟、抗真菌、解熱和降壓方面也有重要的作用[8]。由于莨菪亭是海巴戟體內(nèi)最為主要的活性成分之一，有學(xué)者將莨菪亭推薦作為海巴戟的鑒定認證參數(shù)、產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效評價參數(shù)和藥代動力學(xué)研究的標記成分[9-10]。

莨菪亭是通過苯丙烷代謝途徑而合成的。4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate-Co A ligase, 4CL），是苯丙氨酸類化合物合成過程中不可缺少的酶[11]，作用于苯丙烷類代謝途徑的第3個步驟，是該途徑的關(guān)鍵調(diào)控位點[12]，催化肉桂酸及其衍生物（香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羥基阿魏酸和芥子酸）生成相應(yīng)的CoA[13]，從而進入苯丙烷途徑下游的不同分支，最終生成木質(zhì)素、香豆素、黃酮、類黃酮、單寧等物質(zhì)[14]。4CL可能是莨菪亭合成過程中的關(guān)鍵酶，目前在海巴戟中鮮有報道，其在海巴戟莨菪亭累積過程中的具體功能尚未明確。因此，本研究在探究海巴戟莨菪亭累積規(guī)律的基礎(chǔ)上，分析4CL酶活與莨菪亭累積的相關(guān)性。由于研究海巴戟葉片的最終目的為其次生代謝物的提取和利用，且次生代謝物是評價海巴戟品質(zhì)的重要標準，根據(jù)目前的研究，如袁婷婷等[15]觀察阿魏酸對蠶豆（）根系細胞組織結(jié)構(gòu)變化、金晶等[16]探究阿魏酸對馬纓杜鵑（）和露珠杜鵑（）種子萌發(fā)時的化感作用等使用活體進行阿魏酸處理，而品質(zhì)類的研究更適合離體處理[17]，故本研究選擇基于離體條件下進行阿魏酸處理。在此基礎(chǔ)上篩選出表達量與酶活及莨菪亭變化趨勢一致的關(guān)鍵基因，為后續(xù)深入研究該基因功能及解析海巴戟莨菪亭累積機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海巴戟葉片樣品于2019年8月采自云南省玉溪市元江縣海巴戟栽培基地，隨機摘取不同植株中間層、向陽面成熟葉片，于冰盒中暫存，立即送往實驗室待用。

1.2 方法

1.2.1 海巴戟葉片中莨菪亭含量檢測 將海巴戟成熟葉片于室溫（25℃）下進行取樣。使用1、3、5、7、10、15 mmol/L阿魏酸（coolaber，北京）均勻噴施離體海巴戟成熟葉片表面，將葉片放置于玻璃容器中并用薄膜覆蓋密封，室溫保存，并設(shè)置噴水的葉片為空白對照，2 h后進行取樣。所有樣品取樣后均切碎，于60℃烘干箱烘干至恒重，并研磨至粉末后同硅膠干燥劑一起放置于室溫避光保存待用。莨菪亭檢測參照沈宋利等[18]的方法略有改動：稱取樣品1 g，按照液料比（g∶mL）1∶32加入53%的乙醇，以頻率為45 kHz，溫度為50℃進行超聲提取33 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜后進樣分析。每個樣品設(shè)3個重復(fù)并且平行測定3次。以乙腈∶水（∶，20∶80）作為流動相進行等度淋洗，以1.0 mL/min的流速，25℃的柱溫，20 μL的進樣量，檢測波長348 nm。莨菪亭標準品（Sigma，美國，HPLC≥99%）的峰保留時間為5 min左右。

1.2.2 線性關(guān)系及標準曲線 將配制好的莨菪亭對照品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，將得到的峰面積與對照品溶液濃度數(shù)據(jù)進行整理并繪制標準曲線，得到線性方程=77.043+6.3003（2=0.9998），表明在0.5～20 μg/mL濃度范圍的莨菪亭與其色譜峰峰面積線性關(guān)系良好。

1.2.3 4CL酶活測定 參照岳凱等[19]和WEI等[20]的方法進行4CL酶活測定，稱取樣品0.5 g，加入液氮迅速磨成粉末，加入預(yù)冷的0.2 mol/L（pH 7.8）的Tris-HCl緩沖液5 mL（含10%的甘油和15 mol/L的巰基乙醇），充分混合，在4℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液用于酶活性測定。反應(yīng)體系3 mL包括：0.5 mL粗酶液，0.2 mmol/L 阿魏酸，5 mmol/L ATP，0.33 mmol/L輔酶A，500 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8）和25 mmol/L MgCl2。反應(yīng)液混合后，于40℃水浴鍋反應(yīng)10 min后加入0.5 mL 6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，將0.5 mL粗酶液換成0.5 mL蒸餾水作為空白對照，反應(yīng)前和反應(yīng)后迅速分別測定345 nm處的吸光值，以每克鮮重每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位，并按以下公式計算酶活性：

式中，Δ345為反應(yīng)液在反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的差值；為稀釋倍數(shù)，即所提取的總粗酶液與反應(yīng)酶液的倍數(shù)；為反應(yīng)時間，單位為min；為樣品鮮重，單位為g。

1.2.4 基因克隆 實驗使用RNA提取試劑盒（Magen，廣州）進行海巴戟葉片RNA的提取。將提取得到的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，參考TransGene逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。采用NCBI中的Primer-Blast設(shè)計基因擴增全長引物4CL（DN15707）-F/R（表1），PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，52 ℃退火20 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，切膠回收，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行篩選培養(yǎng)，將檢測呈陽性的菌液送至生工生物科技（上海）有限公司進行測序。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 熒光定量 以海巴戟葉片cDNA為模板，基因[21]為內(nèi)參基因，采用NCBI中的Primer-Blast設(shè)計4CL基因特異性引物（表1），根據(jù)本課題組基于采后0 h及48 h的條件下所測海巴戟轉(zhuǎn)錄組[22]，在RNA-seq數(shù)據(jù)中以“4CL”、“4-coumarate-CoA ligase”及“4-hydroxycin-na-m--oyl-CoA ligase”作為關(guān)鍵詞搜索并剔除表達量極低的（表達量為1以下）情況后獲得7個基因，選中4個表達量較高且差異較大的基因進行相對定量分析，并使用2???CT公式計算其相對表達量。篩選出和莨菪亭含量及酶活變化趨勢一致的基因再進行克隆并且進行熒光定量分析。

1.2.6 海巴戟基因的生物信息學(xué)分析 將得到的海巴戟（DN15707）序列使用NCBI數(shù)據(jù)庫、ExPASy（https://prosite.expasy.org/）和DNAMAN軟件進行序列分析和保守功能結(jié)構(gòu)域分析，利用MEGA-X軟件進行基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 海巴戟葉片莨菪亭累積規(guī)律

2.1.1 不同濃度的阿魏酸處理海巴戟葉片后莨菪亭含量的變化 海巴戟葉片經(jīng)不同濃度的阿魏酸處理后除15 mmol/L阿魏酸處理的葉片莨菪亭含量與對照無顯著差異外，其他濃度均可刺激葉片的莨菪亭含量增加，其中經(jīng)5 mmol/L阿魏酸處理后的果實莨菪亭含量顯著高于其他濃度條件處理葉片，高達2.5 mg/g，其莨菪亭含量的數(shù)值是對照的5倍（圖1A）。此實驗確定5 mmol/L阿魏酸是誘導(dǎo)海巴戟莨菪亭大量累積的最佳濃度，使用5 mmol/L阿魏酸對海巴戟葉片處理進行下一步篩選處理最佳時間條件的實驗。

2.1.2 5 mmol/L阿魏酸處理海巴戟葉片48 h內(nèi)莨菪亭含量的變化 使用5 mmol/L阿魏酸處理海巴戟葉片測定其0～48 h期間莨菪亭的含量變化，結(jié)果如圖1B，經(jīng)過最佳濃度的阿魏酸處理葉片后，隨著時間的增加其莨菪亭含量有一定的變化規(guī)律，期間莨菪亭含量先升高后下降。處理葉片后2 h便有明顯的反應(yīng)，其莨菪亭含量開始顯著增加，到8 h為最高峰，含量增加到最大值0.78 mg/g，隨后其莨菪亭含量逐漸減少，葉片中的莨菪亭含量到48 h降低至最低值0.36 mg/g，并且顯著比對照值低。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.2 不同濃度的阿魏酸處理海巴戟后4CL總酶活性變化

不同濃度的阿魏酸處理海巴戟葉片后，5 mmol/L和10 mmol/L阿魏酸處理顯著高于對照，其中5 mmol/L阿魏酸處理使葉片中4CL總酶活性為最大值305 U/g×h，顯著高于對照的酶活值193 U/g·h，而15 mmol/L阿魏酸處理的葉片中4CL總酶活性與對照相比顯著降低（圖2）。

2.3 4CL基因在葉片中48 h內(nèi)的表達分析

在海巴戟葉片采后0～48 h過程中，基因的表達情況各異（圖3）。（DN21615）、（DN13813）、（DN17012）、（DN15707）、（DN21304）的表達量為上調(diào)，并且（DN21615）和（DN17012）的表達量在前期迅速反應(yīng)與0 h相比顯著上升；其中（DN21615）在2 h和12 h的表達量是0 h的表達量的2.5倍左右，而且（DN17012）表達量在后熟過程中并未比0 h表達量顯著下降。（DN13221）表達量為下調(diào)，雖12 h和24 h表達量有所上升，但是上升幅度不大，基本與0 h沒有太大的差異，并且最終在48 h表達量又顯著下降了。（DN13813）和（DN19928）的表達量與0 h相比始終沒有大幅度上調(diào)的顯著差異，所以選擇（DN21615）、（DN17012）、（DN15707）、（DN21304）進行后續(xù)最佳濃度阿魏酸處理不同時間葉片的熒光定量表達實驗。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.4 4CL基因在最佳濃度阿魏酸處理葉片48 h內(nèi)的表達分析

在最佳濃度5 mmol/L阿魏酸的處理下，海巴戟葉片中基因在48 h內(nèi)的表達情況見圖4。（DN21615）的表達量在前期并沒有迅速上升，反而相對空白對照其表達量顯著下降，僅僅在12 h和24 h顯著上升，其中24 h的表達量顯著增加了1倍，但是最終其表達量在48 h又顯著下降并且顯著低于對照。（DN17012）僅僅在4 h表達量顯著上升了，但是其余時間點如2、8、12 h其表達量與對照相比是下降的，后期表達量又恢復(fù)平穩(wěn)與對照無顯著差異。（DN15707）自前期開始其表達量是漸漸上升的，在8 h表達量顯著增加，是對照表達量約3倍，而后表達量下降，自12 h開始逐漸降低，該基因的表達量變化趨勢與其對應(yīng)莨菪亭含量變化趨勢較為一致。（DN21304）除了在2 h與對照保持平穩(wěn)的表達量以外，從4 h開始表達量顯著增加，而后逐漸降低后又稍有升高，但是總體自4 h到最終的48 h其表達量始終顯著高于對照。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.5 海巴戟4CL（DN15707）全長克隆結(jié)果

將（DN15707）的測序結(jié)果經(jīng)過NCBI序列比對分析得知該序列與目標基因相符，（DN15707）長度為1632 bp，具有1632 bp完整開放閱讀框，編碼543個氨基酸。在NCBI進行序列比對，發(fā)現(xiàn)海巴戟（DN15707）與咖啡（）、茶樹（）、橡膠樹（）和麻瘋樹（）等植物的基因具有較高的相似性和一致性，初步確定該基因為4CL基因家族中的基因。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示（圖5），海巴戟（DN15707）與咖啡聚為一支，說明該基因與同為茜草科的咖啡基因親緣關(guān)系較近，可能與咖啡基因具有相似的功能和結(jié)構(gòu)。根據(jù)進化樹進一步確定該基因為基因，將其命名為。將序列提交至GenBank，登錄號為MZ676989。

圖5 Mc4CL2系統(tǒng)進化樹分析

Mc4CL2分別在186～197、386～392氨基酸處具有4CL的特征序列LPYSSGTTGLPK（保守特征）和GEICIRG（催化功能特征），并且其保守功能結(jié)構(gòu)域包括CaiC、AMP-binding、PLN02246、4CL以及pimA結(jié)構(gòu)域。其中PLN02246和4CL是典型的4香豆酸輔酶A連接酶蛋白的標簽；CaiC是?；o酶A合成酶，主要進行脂質(zhì)運輸與代謝、次級代謝產(chǎn)物生物合成、運輸與分解代謝等作用；PimA是二羧酸輔酶A連接酶，屬于?；o酶A連接酶大家族的成員之一；AMP-binding是AMP結(jié)合酶，主要通過依賴ATP的AMP與底物的共價結(jié)合而發(fā)揮作用，這些預(yù)測的結(jié)構(gòu)功能與4CL參與次級代謝催化反應(yīng)中需要結(jié)合AMP最終生成?；o酶A酯的特點相符，另外，Mc4CL2具有組成保守特征的活性位點、CoA結(jié)合位點、AMP結(jié)合位點以及對于ATP和AMP的結(jié)合是絕對必要的?；せ蠲福ˋAE）共識基序，以上充分說明該基因?qū)儆?CL基因家族，具有其催化合成?；o酶A酯反應(yīng)功能的特征。

3 討論

阿魏酸通過影響不同酶的活性從而導(dǎo)致植物的生長發(fā)生變化，由此可以利用此特性來促進海巴戟合成莨菪亭，更重要的是，阿魏酸是合成莨菪亭代謝途中的重要中間物質(zhì)，這樣的外源中間體的添加可以有效地促進次生代謝終端產(chǎn)物的合成[23]，所以將阿魏酸作為前體物質(zhì)進行前體飼喂，是一種促進海巴戟合成莨菪亭的有效手段。隨著處理時間的增加阿魏酸的刺激作用也會有變化，海巴戟葉片隨著阿魏酸處理時間的增加，其莨菪亭合成量增加的效果逐漸明顯，但是超過8 h后其效果會逐漸降低，說明阿魏酸誘導(dǎo)海巴戟增加莨菪亭含量的效果可能具有時效性。阿魏酸處理葉片48 h其莨菪亭含量比對照值低，該時間點可能是阿魏酸對莨菪亭誘導(dǎo)作用的失效節(jié)點。然而，只是單一的莨菪亭含量變化的現(xiàn)象無法充分證明是因為阿魏酸的作用效果變化導(dǎo)致的，可能有離體材料自身的代謝活動或者其他原因?qū)е碌?，阿魏酸對海巴戟合成莨菪亭的誘導(dǎo)作用機制需要聯(lián)系酶活性、基因表達、代謝反應(yīng)等相關(guān)方面做深入的研究。

阿魏酸處理對不同植物的酶活有不同的影響，宛國偉等[24]使用不同濃度的阿魏酸浸泡丹參（）根部，對苯丙氨酸解氨酶的活性均產(chǎn)生抑制作用但是卻對多酚氧化酶的活性均有促進作用。用阿魏酸處理甘蔗（），對苯丙氨酸解氨酶的活性有促進作用，卻對多酚氧化酶的活性產(chǎn)生抑制作用[25]。同時，不同濃度的阿魏酸刺激植物調(diào)控其體內(nèi)代謝活動的強弱程度是不同的，使用10 mmol/L阿魏酸浸泡番茄（）促進其酶活性提高、抗病性能增強的效果比5 mmol/L阿魏酸的效果好[26]。不同濃度的阿魏酸處理海巴戟葉片后，發(fā)現(xiàn)阿魏酸處理可以提高4CL總酶活，其中5 mmol/L的濃度能最大限度地提高，而15 mmol/L阿魏酸處理葉片會降低其4CL總酶活性。本研究中在一定濃度下阿魏酸對海巴戟中4CL酶活性表現(xiàn)為促進作用，可能主要是因為阿魏酸是4CL的反應(yīng)底物，當?shù)孜镌龆鄷r就會促使4CL轉(zhuǎn)化更多的阿魏酸進行催化反應(yīng)。另外，本研究是以阿魏酸為底物進行4CL總酶活性的測定，由于4CL催化阿魏酸生成阿魏酰輔酶A是4CL催化反應(yīng)中最靠近生成莨菪亭終端步驟的一個轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所以能較準確地反映出4CL總酶活性變化與阿魏酸誘導(dǎo)促進莨菪亭積累之間的作用關(guān)系。根據(jù)本研究中阿魏酸處理能誘導(dǎo)莨菪亭合成量增加、4CL總酶活性增強，并且在5 mmol/L阿魏酸處理條件下誘導(dǎo)二者效果最佳的一致性結(jié)果來看，可說明4CL活性的提高在合成莨菪亭途徑中有著正向的促進作用。

通過阿魏酸外源處理海巴戟葉片，可以誘導(dǎo)基因不同程度的表達變化。其中（DN15707）和（DN21304）的表達量均比對照高，說明阿魏酸可以誘導(dǎo)（DN15707）和（DN21304）高度表達，可能是因為（DN15707）和（DN21304）對阿魏酸作為底物的親和力要高一些，所以受到阿魏酸的刺激其表達量較為突出，但是在12～48 h莨菪亭含量是下降的，而（DN21304）在此期間的表達量始終顯著高于對照，整體來看（DN15707）的表達趨勢與其莨菪亭含量變化趨勢較為一致，因此（DN15707）在合成莨菪亭途徑中的作用較為重要。鑒于4CL在莨菪亭合成途徑中的作用點較多，具體（DN15707）參與合成莨菪亭的哪個環(huán)節(jié)還需要后續(xù)進一步探討。在合成莨菪亭過程中具體的作用底物還需要結(jié)合其純化蛋白利用不同底物的酶活性、超表達或沉默該基因等實驗進一步驗證和研究。

本研究克隆所得的基因可能是莨菪亭累積過程中的關(guān)鍵基因，它能啟動4CL酶活，充分利用阿魏酸底物進而導(dǎo)致莨菪亭累積。

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Function of GeneDuring the Accumulation of Scopoletin inLeaves

GONG Shusen, YANG Fei, WANG Qingfen, YANG Ziyun, WU Tian*

College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University / Southwest Landscape Architecture Engineering Research Center of State Forestry and Grassland Administration / Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization, Kunming, Yunnan 650224, China

In order to clarify the accumulation of the scopoletin inleaves, and to explore the role of genein the accumulation process, the content of scopoletin in the leaves ofwas determined within 0?48 h by high performance liquid chromatography, and the changes of the scopoletin content after treatment with different concentrations of ferulic acid were determined. An AUV spectrophotometer was used to measure the total enzyme activity of 4CL using ferulic acid as a substrate for the enzyme activity reaction. The qPCR of sevengenes was performed based on the RNA-seq results, and onegene was screened out as a key candidate gene because its expression trend was consistent with the change trend of the scopoletin content and enzyme activity. Its full-length was cloned and bioinformatics analysis was performed, and finally its expressive characteristics was studied by qRT-PCR.leaves had the highest content of scopoletin at 12 h, reaching 0.35 mg/g, and the lowest at 48 h with 0.18 mg/g within 48 hours after picking. The change of 4CL total enzyme activity was similar to the trend of the scopoletin content. The total enzyme activity of 4CL in the leaves treated with ferulic acid increased. The(DN15707) gene was screened out by qPCR. The gene was 1632 bp in length, with a complete open reading frame. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis revealed the gene was agene in thegene family, named asgene. Thegene may be a key gene in the accumulation of scopoletin. It can initiate the activity of 4CL enzyme, make full use of ferulic acid substrate and lead to the accumulation of scopoletin.

; scopoletin; total enzyme activity; 4-coumarate-Co A ligase (4CL); ferulic acid

S567.19

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.004

2022-01-02；

2022-03-05

國家林業(yè)和草原局項目（No. [2019]27）；云南省科技廳重點研發(fā)計劃項目（No. 2019IB011）。

宮樹森（1997—），男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：吳 田（WU Tian），E-mail：wutianpotato@swfu.edu.cn。