春季油樟可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性及產(chǎn)黃酮功能初篩

周萬海，劉雯雯，魏 琴，胡連清，馮瑞章*，趙善梅，任玉嫣

春季油樟可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性及產(chǎn)黃酮功能初篩

周萬海1,2，劉雯雯1,2，魏 琴1,2，胡連清1,2，馮瑞章1,2*，趙善梅1,2，任玉嫣2

1. 宜賓學院四川省油樟工程技術研究中心，四川宜賓 644007；2. 宜賓學院農(nóng)林與食品工程學部，四川宜賓 644007

為開發(fā)油樟內(nèi)生菌資源并發(fā)現(xiàn)潛在活性成分，本研究以春季油樟健康植株的根、莖、葉為材料，采用組織培養(yǎng)法分離純化可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，結合ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株多樣性，篩選具有產(chǎn)黃酮功能菌株，設計單因素和正交試驗優(yōu)化產(chǎn)黃酮效果最佳菌株的發(fā)酵條件。結果表明：從油樟中共分離到62株可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，劃分為3門、7綱、14目、22科、28屬、54種。其中優(yōu)勢門為子囊菌門（Ascomycota，RF為88.71%），優(yōu)勢綱為座囊菌綱（Dothideomycetes，RF為45.16%），優(yōu)勢目為格孢腔菌目（Pleosporales，RF為37.10%），優(yōu)勢科為格孢菌科（Pleosporineae，RF為14.52%）、亞隔孢殼科（Didymellaceae，RF為12.90%），優(yōu)勢屬為鏈格孢屬（，RF為12.90%）、附球菌屬（，RF為11.29%）。以綱為類群單位，根組織分離的16屬20種21株真菌的系統(tǒng)發(fā)育可分為7個類群，莖分離的13屬24種30株真菌則分為2個類群，葉的8屬10種11株真菌則分為3個類群。多樣性指數(shù)和均勻度系數(shù)結果表明，油樟根部內(nèi)生真菌種群多樣性相對較豐富，群落分布相對均勻。10株內(nèi)生真菌具有產(chǎn)黃酮功能，5株來自根部，5株來自于莖部，隸屬2門3綱5目8科9屬，其中YZ-29菌株產(chǎn)黃酮能力相對較強。YZ-29菌株最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH 7、時間7 d、溫度30℃、轉(zhuǎn)速175 r/min、裝液量80 mL/150 mL。綜上結果顯示，內(nèi)生真菌在油樟不同組織數(shù)量、種群及組成上存在差異，分離得到的功能性菌株值得深入挖掘和開發(fā)利用，為開展內(nèi)生真菌在油樟抗氧化成分的生物合成機制方面的研究奠定基礎。

油樟；內(nèi)生真菌；多樣性分析；黃酮；發(fā)酵條件

植物內(nèi)生真菌是指長期或生活史中某一個階段共生或寄生于健康植物組織而不引起植物組織明顯病理癥狀的一類絲狀微生物[1]。幾乎所有植物體內(nèi)都有內(nèi)生真菌的存在，且微生物種類隨植物種類、地域、季節(jié)或組織部位等不同而不同。植物內(nèi)生真菌和宿主已形成互利共生關系，內(nèi)生真菌能促進宿主植物生長、抵抗外界不良環(huán)境、促使活性物質(zhì)的產(chǎn)生[2]，同時自身能代謝分泌種類多樣、活性強且結構新穎的天然物質(zhì)，包括生物堿、萜類化合物、黃酮類化合物、環(huán)肽類等藥用成分[3]。因此，植物內(nèi)生真菌被認為是挖掘具有應用價值的天然產(chǎn)物的重要潛在資源和熱點研究領域[4-5]。

油樟[(Gamble) N. Chao]屬樟科、樟屬，是我國特有的香料林業(yè)資源，從油樟根、莖、葉組織提取的油樟油是國防、醫(yī)藥、日化、食品等行業(yè)不可缺少的重要原料[6]。油樟富含黃酮成分且具有較強的抗氧化能力，杜永華等[7]以油樟葉為材料提取總黃酮量42.09 mg/g；梁寒峭等[8]利用大孔樹脂純化從脫油油樟葉渣中獲得總黃酮質(zhì)量分數(shù)72.4%±0.5%；程賢等[9]研究證明春秋兩季油樟葉精油總抗氧化能力達到維生素C（Vitamin C, Vc）的40%?；诠采碚揫10]，油樟內(nèi)生真菌可能會代謝產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)。關于油樟內(nèi)生菌的多樣性和功能性研究已有一些報道，如嚴寬等[11]發(fā)現(xiàn)2J1和3J1內(nèi)生真菌孢子懸浮液分別噴灑在油樟葉片上均能顯著提高葉片揮發(fā)油的含量；馮瑞章等[12]從油樟中篩選得到的YG43、YG60和YG25內(nèi)生溶磷細菌，在促進植物生長、提高抗性和生物防治方面具有應用潛力；黃金風[13]通過紫外線誘變油樟葉分離的內(nèi)生細菌，篩選出高產(chǎn)α-松油醇菌株；周萬海等[14]研究表明不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生細菌的種群數(shù)量、均勻度、優(yōu)勢度均存在差異。大部分研究集中于內(nèi)生細菌，針對油樟內(nèi)生真菌根、莖、葉不同組織的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性及產(chǎn)黃酮功能篩選少見報道。

四川省宜賓市是全國最大且最集中的油樟產(chǎn)地，占全國油樟總資源的75%以上，其生長的油樟存在與其他地區(qū)、其他物種完全不同的潛在的內(nèi)生真菌資源[15-17]。本研究以四川省宜賓市春季油樟為材料，研究根、莖、葉不同組織可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性和分布情況，篩選具有產(chǎn)黃酮功能菌株，為油樟內(nèi)生真菌資源多樣性及提供可應用的功能菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料采集于四川省宜賓市高縣月江森林經(jīng)營所油樟母本園（28°47'772N，104°59'762E）的春季40齡健康油樟根、莖、葉，裝入無菌袋中24 h內(nèi)分離培養(yǎng)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar, PDA）用于內(nèi)生真菌的分離和純化，馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth, PDB）用于內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 油樟可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的分離純化 用自來水沖洗油樟根、莖、葉組織表面，無菌濾紙吸干表面水分后，轉(zhuǎn)入到滅菌瓶中進行表面滅菌。無菌水沖洗2次后，95%乙醇漂洗1 min，無菌水沖洗1次，4%次氯酸鈉漂洗5 min，95%乙醇漂洗1 min，無菌水沖洗4～6次。為驗證消毒是否徹底，將最后一次沖洗過的無菌水涂布在分離培養(yǎng)基上作空白對照，28℃培養(yǎng)并觀察，未見任何菌長出才說明表面消毒徹底。將消毒后的組織放在無菌濾紙上吸干水分，利用無菌剪刀將根斜剪成1 cm小段，莖段斜剪切成小圓片，葉片剪成約0.5 cm′0.5 cm小葉塊，分別接種到3個固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取不同形態(tài)菌落至新的平板上，連續(xù)傳代培養(yǎng)至菌落形態(tài)單一[18]。

1.2.2 內(nèi)生真菌ITS rRNA序列分析 采用真菌通用引物擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列（ITS1：5￠-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3￠，ITS4：5￠-TC-C-T--CC-G-CTTATTGATATGC-3￠）?？侾CR反應體系為總體積50 μL：ddH2O 21 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ITS1和ITS4引物各1 μL，模板DNA 2 μL。反應條件為94℃預變性10 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸10 min。擴增目標產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序在線進行序列的同源性比對，MEGA X軟件聚類分析，采用鄰接法（neighbor joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中bootstrap檢驗值≥50%，重復1000次[19]。

1.2.3 多樣性分析 物種豐富度（species richness, S）、香農(nóng)-維納指數(shù)Shannon-Weiner多樣性指數(shù)（H￠）、辛普森指數(shù)（simpson index, D）、均勻度指數(shù)（Evenness index, E）計算公式[20]：

式中，i為屬相對頻率（PF），指樣本中分離到的某屬內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分比。

1.2.4 內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮功能菌株篩選 因考慮到試劑安全性和試驗簡便性，參考王歡等[21]的研究選擇氯化鋁溶液、氫氧化鈉溶液和氯化鐵溶液進行顯色反應篩選黃酮菌株，利用紫外分光光度法測定黃酮含有量。

1.2.5 最佳菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 選取培養(yǎng)時間（d）、培養(yǎng)溫度（℃）、轉(zhuǎn)速（r/min）、裝液量（mL/150 mL）和培養(yǎng)基起始pH共5種單因素水平進行單因素試驗，如表1所示。設置基本發(fā)酵條件為起始pH，將目的菌株接入裝液量50 mL/150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，以此為基礎，調(diào)整各因素水平。選取4因素3水平進行L9(34)正交試驗，確定最適發(fā)酵條件。

表1 單因素試驗的因素和水平

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

從油樟根、莖、葉組織分離的菌株經(jīng)過分離純化共獲得62株內(nèi)生真菌，不同器官分離獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量存在差異，其中根部21株、莖部30株、葉部11株（表2）。對其完成分子鑒定并進行分子系統(tǒng)學分析，62株菌株歸屬于3門、7綱、14目、22科、28屬、54種（表3）。相對頻率（RF）顯示樣本真菌群落中某類真菌的優(yōu)勢度[22]，所有分離菌株中，優(yōu)勢門為子囊菌門（Ascomycota，RF為88.71%），優(yōu)勢綱為座囊菌綱（Dothideomycetes，RF為45.16%），優(yōu)勢目為格孢腔菌目（Pleosporales，RF為37.10%），優(yōu)勢科為格孢菌科（Pleosporineae，RF為14.52%）、亞隔孢殼科（Didymellaceae，RF為12.90%），優(yōu)勢屬為鏈格孢屬（，RF為12.90%）、附球菌屬（，RF為11.29%）。62株內(nèi)生真菌劃分的28屬所占比例見圖1，其中，和占比最多，其次是。按照油樟不同部位菌株分布顯示，根的21株菌鑒定為7綱11目13科16屬，分別是，優(yōu)勢屬為；莖的30株菌鑒定為2綱6目11科13屬，分別是，優(yōu)勢屬為；葉的11株菌鑒定為3綱7目8科8屬，分別是，其中各種屬所占比例差別較小，無優(yōu)勢菌屬。果實和莖的共有屬為，根和葉的共有屬為，莖和葉共有屬為，莖、葉和花未見共有屬（圖2）。

2.2 不同組織內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

將菌株ITS序列測定后在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析，選用已發(fā)表文章的序列或權威機構的序列與本研究中62株代表菌株的ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，以鄰接法構建油樟根（圖3A）、莖（圖3B）和葉（圖3C）組織分離的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。以綱為類群單位，系統(tǒng)發(fā)育樹將根組織中分離的16個屬分為7個不同的類群，將莖組織中分離的13個屬分為2個不同的類群，將葉組織中分離的8個屬分為3個不同的類群，說明油樟不同組織分離的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育存在多樣性。

表2 油樟不同組織內(nèi)生真菌分布及ITS序列BLAST比對結果

續(xù)表2 油樟不同組織內(nèi)生真菌分布及ITS序列BLAST比對結果

表3 油樟內(nèi)生真菌的種類組成

圖1 油樟內(nèi)生真菌各屬比例圖

圖2 油樟內(nèi)生真菌菌株分布Venn圖

2.3 內(nèi)生真菌的多樣性

Shannon-Weiner多樣性指數(shù)（H'）與物種豐富度的關系最密切，但辛普森指數(shù)（D）與物種豐富度（S）關系較遠。均勻度指數(shù)（E）敏感性高于Shannon-Weiner多樣性指數(shù)，分析內(nèi)生真菌群落分布的均勻程度（表4）。綜合來看，油樟根、莖、葉3個部位中，根部內(nèi)生真菌種群多樣性相對較豐富，群落分布相對均勻。

2.4 油樟內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮功能篩選

62株內(nèi)生真菌中10株具有產(chǎn)黃酮功能，5株分離自根、5株分離自莖，共歸類于2門3綱5目8科9屬，分別是。菌株產(chǎn)黃酮強弱依次為YZ-29、YZ-31、YZ-15、YZ-3、YZ-41、YZ-30、YZ-28、YZ-33、YZ-36、YZ-38，其中YZ-29顯色反應最明顯且產(chǎn)黃酮量相對最高，為2.48 mg/g。

圖3 油樟根（A）、莖（B）、葉（C）組織內(nèi)生真菌群進化樹

表4 不同組織內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

2.5 菌株YZ-29發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

由圖4可知，YZ-29黃酮產(chǎn)量在發(fā)酵7 d前逐漸增加，隨后呈下降的趨勢，其原因可能是菌種代謝和黃酮產(chǎn)量呈正相關，但隨著菌株老化，營養(yǎng)物質(zhì)的減少，菌株代謝活動減弱而黃酮產(chǎn)量降低，因此，正交試驗選擇發(fā)酵時間為5、7、9 d。當溫度較低時，菌株YZ-29生長受到限制，當溫度升高產(chǎn)黃酮量也增多，但超過28℃后黃酮產(chǎn)量緩慢下降，基于此，正交試驗選擇發(fā)酵溫度為26、28、30℃。在100～150 r/min搖床轉(zhuǎn)速間，菌株黃酮產(chǎn)量增加，可能是轉(zhuǎn)速較低時，氧氣量少而阻礙菌株代謝活動。當轉(zhuǎn)速超過150 r/min時黃酮產(chǎn)量顯著降低，可能因速度過大形成剪切力，破壞菌絲體結構導致黃酮產(chǎn)量略下降。因此搖床轉(zhuǎn)速以125、150、175 r/min進行正交試驗較為合適。裝液量在70 mL/150 mL時黃酮產(chǎn)量最多，裝液量為60、70、80 mL（150 mL錐形瓶）作為正交試驗較為合適。當pH從酸性逐漸變?yōu)橹行裕S酮產(chǎn)量逐漸增加，中性時黃酮產(chǎn)量最多，而pH為堿性時，黃酮產(chǎn)量下降明顯。正交試驗確定培養(yǎng)基起始pH為7較為合適。

圖4 YZ-29菌株發(fā)酵條件的單因素試驗結果

2.6 內(nèi)生真菌YZ-29發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化

由表5可知，4個因素對YZ-29菌絲黃酮產(chǎn)量的主次影響為發(fā)酵時間>裝液量>轉(zhuǎn)速>發(fā)酵溫度。以菌絲體黃酮含有量為指標，YZ-29最適發(fā)酵條件為A2B3C3D3：初始pH 7、時間7 d、溫度30℃、轉(zhuǎn)速175 r/min、裝液量80 mL/150 mL；利用最佳組合進行驗證，YZ-29產(chǎn)黃酮量為3.73 mg/g。

表5 菌株YZ-29的正交試驗結果

3 討論

內(nèi)生真菌是影響宿主植物生存、代謝、抗逆境等方面的重要因素，是極具研究價值且尚待開發(fā)的微生物群落。為獲得內(nèi)生真菌作進一步分析，本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法首次在春季對宜賓的油樟根、莖、葉不同組織內(nèi)生真菌進行分離、純化及鑒定，共分離到62株分屬于28屬、54種的內(nèi)生真菌，其中根部菌株鑒定為7綱11目13科16屬，莖部菌株鑒定為2綱6目11科13屬，葉部菌株鑒定為3綱7目8科8屬，多樣性指數(shù)和均勻度系數(shù)結果表明，油樟根部內(nèi)生真菌種群多樣性相對較豐富，群落分布相對均勻，與大多數(shù)研究根部豐富度高相似，可能由于根部與土壤接觸，是抵御重金屬威脅、參與修復調(diào)控、保護病害侵入等的重要部位，所以根部菌株豐度較高[23]。

已有研究表明，植物體可培養(yǎng)內(nèi)生真菌受多種因素影響，植物類型是關鍵因素之一[24]，如龔斌等[15]從柳樹桑寄生中純化出27株內(nèi)生真菌，主要類群為sp.和sp.。趙文星等[16]從披針葉黃華分離獲得29種內(nèi)生真菌，主要隸屬于和等。宋海燕等[17]從4個地區(qū)棉花樣本中分離獲得79株可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，其隸屬于16個屬，優(yōu)勢屬為和等。本研究篩選得到的62株油樟可培養(yǎng)內(nèi)生真菌主要隸屬于和，與前人研究具有較大差異。此外，本實驗室前期利用高通量測序技術對秋季油樟根、莖和葉內(nèi)生真菌類群進行分析，發(fā)現(xiàn)油樟不同器官內(nèi)生真菌絕大多數(shù)為Unclassified科屬，其中根、莖和葉中的優(yōu)勢種屬分別為Unclassified Chaetosphaeriales（91.66%）、（57.17%）和unclassified Ascomycota（58.79%），其他一些普通種屬在莖中主要為unclassified Ascomycota（12.13%）、（10.38%）和（5.43%），葉部為（11.43%）和（8.58%）[25]；而本研究采用平板法對相同油樟材料可培養(yǎng)內(nèi)生真菌進行分離，發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)菌株主要隸屬于Ascomycota和Sphaeriales，而均未被分離鑒定到，這可能與培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度的局限性和偏向性有關，亦可能與取材季節(jié)宿主獨特生理特征及組織化學成分有關，但更重要的是，油樟不同器官蘊含豐富多樣的內(nèi)生真菌，后續(xù)還需進一步研究。此外，本研究中油樟可培養(yǎng)內(nèi)生真菌中優(yōu)勢菌群Ascomycota被看作是植物內(nèi)生菌群最易于在植物內(nèi)部定殖的門[26]，也廣泛存在于植物、土壤中，如農(nóng)作物、牧草花卉[27]。分離的sp.和sp.內(nèi)生真菌在莖部的種類和數(shù)量上都占絕對優(yōu)勢，且主要寄生于莖部，提示兩屬可能與油樟運輸營養(yǎng)或次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化具有重要意義。

關于不同植物內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的研究已有報道，趙曉璐等[19]從荷葉中篩選產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，鑒定為棘孢曲霉（），菌絲體總黃酮含有量為8.2 mg/g。周寧[28]從甘蔗葉中分離到2株產(chǎn)黃酮功能內(nèi)生真菌（1.21 mg/g）和（4.03 mg/g）。何福林等[29]分離到1株產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)生真菌，其黃酮產(chǎn)量為0.7 mg/g。本研究分離的10株油樟產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮量為0.73～2.48 mg/g，菌株YZ-29發(fā)酵條件優(yōu)化后黃酮提高至3.73 mg/g，說明油樟內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮能力中等，后續(xù)將深入進行菌株的發(fā)酵產(chǎn)物分析。首次篩選油樟內(nèi)生真菌的產(chǎn)黃酮功能菌株，為開展內(nèi)生真菌在油樟抗氧化成分的生物合成機制方面奠定基礎。

本研究從油樟根、莖、葉分離到62株內(nèi)生真菌，并對產(chǎn)黃酮功能菌株完成篩選，為全面挖掘油樟內(nèi)生真菌代謝物研究提供了菌株資源。但從目前來看，內(nèi)生真菌的研究集中在分離鑒定、抗氧化、促生長、抑菌等生理生化和生物活性研究等相對表面層次，其產(chǎn)生天然活性成分的機理及遺傳特征仍有待研究。同時，現(xiàn)有內(nèi)生真菌研究的分離重點定位于藥用植物和區(qū)域經(jīng)濟作物研究上，所以內(nèi)生真菌種質(zhì)資源庫還有很大擴充空間。另外，對于內(nèi)生真菌產(chǎn)天然活性物質(zhì)的實驗現(xiàn)處于實驗室階段，距離大規(guī)模開發(fā)利用有一定距離。如何保證油樟產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌在連續(xù)培養(yǎng)傳代后不會出現(xiàn)菌種退回和特征改變等現(xiàn)象，均是后期待探究的。

[1] QIN S, XING K, JIANG J H, XU L H, LI W J. Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2011, 89(3): 457-473.

[2] 魏艷妮, 楊冰月, 羅 露, 雷瑞祥, 姬海月, 顏永剛, 張 崗, 胡本祥, 彭 亮. 遠志內(nèi)生真菌分離與鑒定研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2021, 23(5):35-40.

WEI Y N, YANG B Y, LUO L, LEI R X, JI H Y, YAN Y G, ZHANG G, HU B Y, PENG L. Isolation and identification of endophytic fungi from[J]. Journal of Liaoning University of Traditional, 2021, 23(5): 35-40. (in Chinese)

[3] 李秀琦. 煙草內(nèi)生真菌sp.次級代謝產(chǎn)物分離鑒定與活性評價[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2021: 1-69.

LI X Q. Identification and activity evaluation of the secondary metabolites isolated from tobacco endophytic fungussp.[D]. Beijing, 2021: 1-69. (in Chinese)

[4] 郭順星. 藥用植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J]. 菌物學報, 2018, 37(1): 1-13.

GUO S X. The recent progress and prospects of research on endophytic fungi in medicinal plants[J]. Mycosystema, 2018, 37(1): 1-13. (in Chinese)

[5] GUPTA S, CHATURVEDI P, KULKARNI M G. A critical review on exploiting the pharmaceutical potential of plant endophytic fungi[J]. Biotechnology Advance, 2020, 39: 107462.

[6] 周成強, 練東明. 宜賓油樟產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J]. 農(nóng)業(yè)與技術, 2020, 40(16): 65-68.

ZHOU C Q, LIAN D M. Development status and countermeasures ofin Yinbin[J]. Agriculture Technology, 2020, 40(16): 65-68. (in Chinese)

[7] 杜永華, 敖光輝, 魏 琴, 廖小龍, 余小霞. 油樟葉總黃酮含量測定及其抗油脂氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2015, 43(8): 308-311.

DU Y H, AO G H, WEI Q, LIAO X L, YU X X. Determination of total flavonoids inleaves and antioxidant activity[J]. Jiangsu Agriculture Science, 2015, 43(8): 308-311. (in Chinese)

[8] 梁寒峭, 趙宇焓, 朱子冬, 陳 穎, 代晹鑫, 尹禮國, 魏 琴. 大孔樹脂純化脫油油樟葉渣中總黃酮工藝研究[J].離子交換與吸附, 2021, 37(3): 272-280.

LIANG H Q, ZHAO Y H, ZHU Z D, CHEN Y, DAI X X, YIN L G, WEI Q. Purification of total flavonoids fromdeoiled camphor leaf residue by microporous resin[J]. Ion Exchange Adsorption, 2021, 37(3): 272-280. (in Chinese)

[9] 程 賢, 畢良武, 李勝男, 陳玉湘, 趙振東, 莫開林. 春秋兩季油樟葉的油細胞形態(tài)、精油成分及其抗氧化活性研究[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè), 2021, 41(1): 38-44.

CHEGN X, BI L W, LI S N, CHEN Y X, ZHAO Z D, MO K L. Oil cell morphology, essential oil constituents and antioxidant activity ofleaves harvested in spring and autumn[J]. Chemistry and Industry for Productions, 2021, 41(1): 38-44. (in Chinese)

[10] PAPIK J, FOLKMANOVE M, SUMAN J. The invisible life inside plants: deciphering the riddles of endophytic bacterial diversity[J]. Biotechnology Advance, 2020, 44: 107614.

[11] 嚴 寬, 陳 放, 魏 琴, 馮瑞章, 周萬海, 周 敏. 內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累及生理生化特性的影響[J]. 生物技術通報, 2017, 33(3): 138-143.

YAN K, CHEN F, WEI Q, FENG R Z, ZHOU W H, ZHOU M. Effects of endophytic fungi on volatile oil accumulation and physiological and biochemical characteristics of[J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(3): 138-143. (in Chinese)

[12] 馮瑞章, 周誥均, 魏 琴, 周萬海, 范軼玲, 秦 歡. 油樟內(nèi)生溶磷菌的篩選及其生物學特性[J]. 廣西植物, 2016, 36(11): 1396-1402.

FENG R Z, ZHOU G J, WEI Q, ZHOU W H, FAN Y L, QIN H. Screening of endogenous phosphate solubilizing bacteria inand biological characteristics[J]. Guihaia, 2016, 36(11): 1396-1402. (in Chinese)

[13] 黃金鳳. 油樟同分異構松油醇抑菌活性及高產(chǎn)途徑研究[D]. 成都: 西華大學, 2020.

HUANG J F. Antibacterial activity and high yield method of isomeric terpineol from[D]. Chengdu: Xihua University, 2020. (in Chinese)

[14] 周萬海, 楊立艷, 李 苗. 天然香料植物油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌群落結構與多樣性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2019, 45(20): 43-51.

ZHOU W H, YANG L Y, LI M. Community structure and diversity of cultivated endophytic bacteria in natural spice plant oilleaves[J]. Food Ferment and Industry, 2019, 45(20): 43-51. (in Chinese)

[15] 龔 斌, 巫 鑫, 韋 婷, 廖日權, 蘇本偉, 宋靜靜, 江國煥, 朱開昕. 廣西柳樹桑寄生內(nèi)生真菌的分離鑒定與抗腫瘤活性菌株篩選[J]. 廣西植物, 2017, 37(5): 634-641.

GONG B, WU X, WEI T, LIAO R Q, SU B W, SONG J J, JIANG G H, ZHU K X. Isolation, identification and antitumor activity of endophytic fungi infromin Guangxi[J]. Guihaia, 2017, 37(5): 634-641. (in Chinese)

[16] 趙文星, 吳可欣, 郭梓豫. 披針葉黃華內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2021, 52(10): 2986-2994.

ZHAO W X, WU K X, GUO Z Y. Isolation and identification of endophytic fungi in[J]. Acta Vet Zootech Sin, 2021, 52(10): 2986-2994. (in Chinese)

[17] 宋海燕, 李麗莉, 李 超, 秦華偉, 宋瑩瑩, 盧增斌, 于 毅, 門興元. 棉花不同部位內(nèi)生真菌群落結構及多樣性分析[J]. 中國棉花, 2019, 46(1): 20-25.

SONG H Y, LI L L, LI C, QIN H W, SONG Y Y, LU Z B, YU W, MEN X Y. Analysis of community structure and diversity of endophytic fungi in different parts of cotton[J]. China Cotton, 2019, 46(1): 20-25. (in Chinese)

[18] MALHADAS C, MALHEIRO R, PEREIRA J A, DE PINHO PG, BAPTISTA P. Antimicrobial activity of endophytic fungi from olive tree leaves[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 33(3): 46.

[19] 趙曉璐, 周 寧, 謝慶武. 產(chǎn)黃酮荷葉內(nèi)生真菌的篩選與鑒定[J]. 中成藥, 2016, 38(11): 2512-2515.

ZHAO X L, ZHOU N, XIE Q W. Screening and identification of endophytic fungi producing flavonoids in lotus leaf[J]. Chinese Tradition Pat Medicine, 2016, 38(11): 2512-2515. (in Chinese)

[20] 陳艷露, 謝 玲, 劉 斌, 曾鳳花, 廖仕同, 張 艷. 廣西香蕉根系內(nèi)生真菌的群落組成與多樣性[J]. 熱帶作物學報, 2022, 43(2): 385-398.

CHEN Y L, XIE L, LIU B, CENG F H, LIAO S T, ZHAGN Y. Community composition and diversity of endophytic fungi in banana root in Guangxi[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2022, 43(2): 385-398. (in Chinese)

[21] 王 歡, 路 浩, 郭亞洲, 馮 柯, 耿朋帥, 趙寶玉. 瑞香狼毒內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2016, 47(8): 1696-1703.

WANG H, LU H, GUO Y Z, FENG K, GENG P S, ZHAO B Y. Isolation and identification of endophytic fungi from[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(8): 1696-1703. (in Chinese)

[22] 柴新義, 鐘媛媛. 青檀果內(nèi)生真菌菌群的組成及多樣性[J]. 應用生態(tài)學報, 2017, 28(2): 636-642.

CAI X Y, ZHONG Y Y. Community composition and diversity of endophytic fungi from the fuits of[J]. Chinese Journal Application. Ecology, 2017, 28(2): 636-642. (in Chinese)

[23] 李秋樺, 夏體淵, 任 禛, 裴 妍, 尹 敏, 陳澤斌, 唐佐芯, 字學慶. 基于高通量測序技術解析三七不同部位內(nèi)生細菌多樣性[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2021, 34(10): 2182-2190.

LI Q H, XIA T Y, REN Z, PEI Y, YIN M, CHEN Z B, TANG Z X, ZI X Q. Analysis of endophytic bacterial diversity in different parts ofg based on high throughput sequencing[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2021, 34(10): 2182-2190. (in Chinese)

[24] DU W, YAO Z, LI J, SUN C, XIA J, WANG B, SHI D, REN L. Diversity and antimicrobial activity of endophytic fungi isolated fromin the Yellow River Delta[J]. PLoS One. 2020, 15(3): e0229589.

[25] ZHOU W H, WEI Q, FENG R Z, LIU Y, LIANG H, LI J, YAN K. Diversity and spatial distribution of endophytic fungi inof Yibin, China[J]. Arch Microbiology. 2021, 203(6): 3361-3372.

[26] 郭順星. 藥用植物內(nèi)生真菌生物學[M]. 北京: 科學出版社, 2016.

GUO S X. Endophytic mycology of medicinal plants[M]. Beijing: Science Press, 2016. (in Chinese)

[27] EDWARDS J, JOHNSON C, SANTOS-MENLLIN C. Structure variation and assembly of the root-associated microbiomes of rice[J]. PNAC, 2015, 112(8): 911.

[28] 周 寧. 甘蔗葉產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的篩選與鑒定[D]. 南寧: 廣西大學, 2017.

ZHOU N. Screening and identification of flavonoid-producing endophytic fungi from sugarcane leaves[D]. Nanning: Guangxi University, 2017. (in Chinese)

[29] 何福林, 陳小明, 張 瑞. 產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2017, 29(7): 1141-1147.

HE F L, CHEN X M, ZHANG R. Isolation and identification of two flavonoid-producing endophytic fungi fromLinn.[J]. Natural Product Research and Development, 2017, 29(7): 1141-1147. (in Chinese)

Diversity and Flavonoid-Producing Function of Culturable Endophytic Fungi in Natural Spice(Gamble) N. Chao in Spring

ZHOU Wanhai1,2, LIU Wenwen1,2, WEI Qin1,2, HU Lianqing1,2, FENG Ruizhang1,2*, ZHAO Shanmei1,2,REN Yuyan2

1. Sichuan Oil Camphor Engineering Technology Research Center, Yibin University, Yibin, Sichuan 644007, China; 2. Faculty of Agriculture, Forestry and Food Engineering, Yibin University, Yibin, Sichuan 644007, China

In order to develop the resources ofendophytes and discover its potential active components, this study utilized the roots, stems and leaves of healthyplants as the materials to isolate and purify culturable endophytic fungi by the tissue culture method. Combined with the ITS sequence and system, the developmental tree was used to analyze the diversity of strains, screen strains with flavonoid-producing functions, and design single-factor and orthogonal experiments to optimize the fermentation conditions of strains with the best flavonoid-producing effect. Sixty-two culturable endophytic fungi isolated from, which were divided into three phyla, seven classes, fourteen orders, twenty-two families, twenty-eight genera, and fifty-four species. Among them, the dominant phyla was Ascomycota (88.71%), the dominant class was Dothideomycetes (45.16%), the dominant order was Pleosporales (37.10%), and the dominant family was Pleosporineae (14.52%) and Didymellaceae (12.90%), the dominant genera were(12.90%) and(11.29%). Using the class as a group unit, the phylogeny of the fungi isolated from the root tissues included sixteen genera, twenty species and twelve isolates that could be divided into seven groups. The fungi isolated from the stems contained thirteen genera, twenty-four species, and thirty isolates that could be divided into two groups. The fungi isolated from the leaves contained eight genera, ten species, and eleven isolates and could be divided into three groups. The results of the diversity index and evenness coefficient showed that the endophytic fungi population diversity in the roots ofwas relatively rich, and the communal distribution was relatively even. Ten strains of endophytic fungi had the function of producing flavonoids: five from roots, five from stems, belonging to two phyla, three classes, five orders, eight families and nine genera. Among them, the YZ-29 strain had relatively strong flavonoid production capabilities. The optimal fermentation conditions for the YZ-29 strain to produce flavonoid were to be cultured at initial pH seven for 7 days at 30℃, with rotation speed of 175 r/min and liquid volume 80 mL/150 mL. The results above showed that there were differences in the number, population and composition of endophytic fungi in different tissues of. The functional strains that were screened are worthy of further excavation, development and utilization. The results would lay a foundation for the biosynthesis of antioxidant components from endophytic fungi in.

(Gamble) N. Chao; endophytic fungi; diversity analysis; flavonoids; fermentation conditions

S792.23

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.022

2022-02-15；

2022-04-22

四川省科技廳項目（No. 2019YFSY001）；香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室開放基金項目（No. 2015- XLZ004）；2021年度宜賓市高端創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（No. 2021YGC03）。

周萬海（1979—），男，博士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)資源開發(fā)利用。*通信作者（Corresponding author）：馮瑞章（FENG Ruizhang），E-mail：ruizhangfeng@126.com。