miR-101-3p靶向E2F2調控黑色素瘤細胞增殖的分子機制探討

李吻吻，朱智鑫，韓利民，焦艷林，翁宗琴，趙海龍

黑色素瘤是一種進展快、預后差、病死率高的皮膚惡性腫瘤。目前黑色素瘤的治療方式主要包括傳統(tǒng)的手術、放化療及近年來新興的靶向和免疫治療。放化療對患者具有較大的不良反應且腫瘤容易復發(fā)［1］。手術切除適用于早期的黑色素瘤且預后較好，但黑色素瘤患者早期癥狀不明顯，臨床上易被誤診、漏診。研究表明，多種腫瘤均具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）高度依賴性特點，而NAD+合成的關鍵限速酶煙酰胺磷 酸核糖基轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）相關抑制劑也被認為對黑色素瘤具有潛在治療作用［2］。但有研究發(fā)現，NAMPT抑制劑在臨床試驗中具有潛在的視網膜毒性，同時影響患者的生活質量［3］。因此探索NAMPT下游相關蛋白對黑色素瘤的治療具有重要意義。E2F轉錄因子家族與腫瘤細胞周期進程、凋亡、增殖、分化以及DNA損傷和修復均密切相關，是目前腫瘤治療靶點研究的重點［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長20～22個核苷酸的微小非編碼RNA，能通過與靶基因的3'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結合，引發(fā)mRNA降解或翻譯抑制，最終負性調控靶基因的表達［5］。本研究擬探究轉錄因子E2F2和miRNA在調控黑色素瘤細胞增殖過程中的作用及相關潛在調控分子機制，進一步明確調控E2F2能否成為藥物治療黑色素瘤的特異性靶點，旨在為黑色素瘤的治療提供更多策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系及動物 人黑色素瘤細胞系MV3購自廈門逸漠生物科技有限公司，來源于淋巴結轉移性黑色素瘤患者。6只SPF級雌性裸鼠（4～5周齡，體質量16～17 g）購自中國北京斯貝福生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，動物使用許可證號：SYXK（黔）2021-0003。

1.1.2 試劑 高效RIPA裂解液、MTT噻唑藍粉末（250 mg）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU）、牛血清白 蛋 白（BSA）購 自 中 國Solarbio公 司；Trizol購 自 美 國Invitrogen公司；總RNA逆轉錄和熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自日本Takara公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素購自中國源培公司；胎牛血清（FBS）購自美國GEMINI公司；0.25%Trypsin-EDTA購自美國Gibco公司；miR-101-3p mimics（5'-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'）、NC mimics（5'-GGAAGUCAUCCAAUGUGCAUU-3'）、shRNA質粒pLKO.1購自上海GenePharma有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；大鼠抗人BrdU抗體、兔抗人GAPDH、E2F2、p21、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、細胞周期蛋白E（CyclinE）、LC3B抗體購自英國Abcam公司；兔抗人AKT抗體、Phospho-AKT（Ser473）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自美國Invitrogen公司。

1.2 抑制E2F2表達對黑色素瘤細胞增殖及相關惡性生物學行為的影響

1.2.1 生物信息學分析 采用GEPIA（http://gepia.canc erpku.cn/detail.php/）以及OSskcm（http://bioinfo.henu.edu.cn/Melanoma/MelanomaList.jsp/）在線生存分析工具鑒定E2F2在黑色素瘤中的表達及對預后的影響。通過癌癥相關的單細胞數據庫CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）分析E2F2在黑色素瘤中參與的主要細胞功能。

1.2.2 MV3細胞培養(yǎng) 采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MV3細胞，將其置于5%CO2、37℃恒溫環(huán)境中。

1.2.3 質粒與慢病毒轉染 將293T細胞進行常規(guī)鋪板、消化和收集（1×106個），按照Lipofectamine 2000試劑說明書制備質粒DNA-脂質體復合物。接著將質粒DNA-脂質體復合物加入到293T細胞中，于48 h收集含有病毒的上清液，3 000 r/min離心20 min后取上清液備用。將MV3細胞按1×105個/孔均勻鋪在6孔板中，次日在細胞覆蓋率達70%～80%時去除原有培養(yǎng)基，加入含4 g/L聚凝胺的新鮮培養(yǎng)基和適量的病毒懸液，24 h后將含病毒的培養(yǎng)基更換為新的完全培養(yǎng)基。轉染48 h后用顯微鏡觀察細胞內熒光信號以確定轉染效率，并在72 h加入4 g/L的嘌呤霉素進行篩選，最后收集抗藥細胞并進行擴張和鑒定。設計以慢病毒為載體短發(fā)夾RNA（shRNA）針對不同蛋白的靶序列，E2F2 shRNA：5'-GCCTATGTGACTTACCAGGAT-3'，GFP shRNA：5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3'。

1.2.4 流式細胞術測定細胞周期 分別用shGFP和shE2F2慢病毒載體感染MV3得到所需的細胞系。收集細胞并進行計數，以每孔1×106個細胞接種在6孔板中，以shGFP組為對照組。72 h時取出6孔板，用PBS洗滌2次后，胰酶消化1 min，離心收集細胞，重懸細胞至1×106個/mL。取1 mL細胞懸液進行離心，使用體積分數為70%的預冷乙醇固定過夜。次日取出細胞后PBS再次使用洗滌1次，在避光條件下加100μL RNase A溶液重懸細胞，37℃水浴30 min。接著加入400μL PI染色液，4℃避光孵育30 min后使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖能力shGFP或shE2F2處理MV3細胞，在MV3細胞生長狀態(tài)良好時，將細胞稀釋至2.5×105個/mL，取200 μL細胞懸液接種到96孔板，放入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)過夜。最終以0.1%的DMSO為對照組，根據不同時間點取出96孔板，并向每孔中添加20 μL的MTT溶液（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移液器去除培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO溶液，室溫下?lián)u床上搖晃10 min至藍紫色結晶甲臢完全溶解。最后采用全波長酶標儀讀取490 nm處的光密度（OD）值。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測E2F2、CyclinE、CDK2、AKT、p-AKT、p21蛋白相對表達水平 收集各組細胞提取蛋白，4℃離心收取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE凝膠，每孔以30 μg蛋白進行上樣，電泳后轉至PVDF膜，5% BSA封閉2 h。接著加入兔源一抗E2F2、CyclinE、CDK2、AKT、p-AKT、p21（均為1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），置于4℃冰箱過夜。次日首先取出孵育盒室溫復蘇30 min，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG（1∶10 000），室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，完畢后采用化學發(fā)光儀進行顯影。

1.2.7 免疫熒光法檢測LC3B的表達水平 將各組細胞按1×105個/孔鋪入含有載玻片的12孔板中。72 h取出12孔板，依次進行4%多聚甲醛固定10 min、0.3% TritonX-100通透5 min、5%BSA封閉2 h。接著加入一抗LC3B（1∶200），4℃過夜處理。次日，PBS清洗后加入山羊抗兔IgG（1∶1 000）。在室溫下孵育2 h后用DAPI進行細胞核染色15 min。采用PBS漂洗干凈后在顯微鏡下觀察，最后封片后采用熒光顯微鏡進行拍照。

1.2.8 體內成瘤實驗 裸鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，室溫控制在（22±2）℃，晝夜各半循環(huán)照明，自由攝食和飲水。根據實驗要求分別對MV3進行shGFP或shE2F2轉染成功后得到所需的細胞系。適應1周后隨機抽取6只裸鼠分為shGFP組和shE2F2組，分別皮下注射轉染shGFP或shE2F2的MV3細胞。取對數生長期的各組細胞，加入2 mL PBS后重懸，細胞調整為5×106個/mL，采用1 mL注射器分別取200μL細胞懸液冰上待用。選擇裸鼠右側腋中線向后0.5 cm處皮下注射，每5 d評估1次腫瘤生長變化。注射4周后通過頸椎脫位處死所有小鼠，取出腫瘤并進行拍照和稱質量。

1.3 過表達miR-101-3p對黑色素瘤細胞惡性生物學行為的影響

1.3.1 細胞轉染 將MV3細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，分別轉染miR-101-3p mimics（10 nmol/L），NC mimics（10 nmol/L）。細胞在轉染48 h后用于后續(xù)實驗，采用qPCR檢測其轉染效率。

1.3.2 qPCR檢測miR-101-3p和E2F2的表達水平 將NC mimics組或miR-101-3p mimics組MV3細胞按5×105個/孔均勻鋪在6孔板中，收集細胞后檢測MV3細胞中miR-101-3p表達水平和E2F2的mRNA表達水平。RNA試劑盒提取各組細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將提取的RNA（miR-101-3p用加尾法）反轉錄成cDNA，其中miR-101-3p的反轉錄引物為5'-GGAGTAGATGATGGTTAGCGTCGGCAATTCAGTTGAGTTCAGTTA-3'，U6的反轉錄引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。之后使用qPCR儀進行熒光定量PCR反應，反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。檢測結果miR-101-3p以U6作為內參基因，E2F2以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計及合成，序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.3 BrdU檢測細胞的增殖能力 收集各組細胞，進行細胞計數，按每孔1×104個細胞加入鋪有載玻片的24孔板中，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。根據實驗要求時間點取出24孔板，并加入10 mg/L的BrdU使其終濃度為30 μg/L。孵育30 min后依次進行PBS清洗，4%多聚甲醛（PFA）固定15 min，0.3%Triton X-100通透5 min，1 mol/L HCl處理10 min，10%山羊血清封閉1 h。最后用一抗BrdU（大鼠單克隆抗體，1∶300）孵育1 h，山羊抗大鼠IgG（H+L，1∶100）室溫避光下孵育1 h。細胞核用DAPI染色液進行染色，最后用顯微鏡進行拍攝。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有實驗數據使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，采用均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 E2F2在黑色素瘤中的表達及與預后的關系GEPIA及OSskcm在線生存分析結果均證實E2F2表達水平升高的黑色素瘤患者預后更差（P＜0.01），見圖1。

2.2 抑制E2F2表達對黑色素瘤細胞增殖及相關惡性生物學行為的影響CancerSEA數據庫分析結果表明，E2F2主要與DNA修復和細胞周期等功能顯著相關，見圖2。流式細胞術檢測結果顯示，與shGFP組相比，shE2F2組中處于G0/G1期的細胞比例顯著增多（P＜0.01），見圖3。MTT結果表明，與shGFP組相比，shE2F2組MV3細胞活力明顯減弱（P＜0.05），見圖4。Western blot結果表明，shE2F2組相較于shGFP對照組E2F2蛋白表達水平顯著下調（0.56±0.06vs.0.86±0.09，t=3.941，P＜0.05），并同時出現CyclinE（0.36±0.02vs.0.66±0.11，t=3.908，P＜0.05）和CDK2（0.28±0.04vs.0.54±0.12，t=2.841，P＜0.05）表達水平顯著降低，與之前流式細胞結果顯示的細胞周期阻滯情況相符，見圖5。此外，與shGFP對照組相比，shE2F2組中E2F2靶蛋白AKT磷酸化水平出現顯著下降（0.19±0.04vs.0.11±0.02，t=2.984，P＜0.05），同時下游細胞周期阻滯相關蛋白p21表達上調（0.59±0.04vs.0.81±0.08，t=3.734，P＜0.05），說明E2F2通過靶向AKT進而抑制p21表達，見圖6。免疫熒光結果顯示，與shGFP組（33.00%±10.15%）相比，shE2F2組（4.00%±1.73%）細胞中自噬相關蛋白LC3B熒光信號細胞占比明顯降低（n=3，t=4.879，P＜0.05），見圖7。shE2F2組裸鼠體內黑色素瘤的質量顯著低于shGFP組［（0.55±0.11）gvs.（1.33±0.07）g，n=3，t=10.400，P＜0.01］，見圖8。

Fig.1 Survival curves of melanoma patients with different expression levels of E2F2圖1 E2F2不同表達水平的黑色素瘤患者生存曲線

Fig.2 CancerSEA database analyzes the functional diagram of E2F2 in melanoma圖2 CancerSEA數據庫分析黑色素瘤中E2F2的功能圖

Fig.3 The changes of cell cycle detected by PI staining flow cytometry after shGFP or shE2F2 treatment圖3 shGFP或shE2F2處理后PI染色流式細胞術檢測細胞周期的變化

Fig.4 The effect shGFP or shE2F2 on cell viability of MV3 cells detected by MTT圖4 MTT法檢測shGFP或shE2F2處理后對MV3細胞活力的影響

Fig.5 Expression of cycle-related proteins in MV3 cells treated with shGFP or shE2F2圖5 shGFP或shE2F2處理后MV3細胞周期相關蛋白的表達

Fig.6 Expression changes of p-AKT,AKT and p21 in MV3 cells treated with shGFP or shE2F2圖6 shGFP或shE2F2處理后MV3細胞中p-AKT、AKT和p21表達變化

2.3 miR-101-3p靶向調控E2F2表達StarBase數據庫分析發(fā)現miR-101-3p能與E2F2 mRNA的3'-UTR結合，見圖9。與NC mimics組相比，miR-101-3p mimics組miR-101-3p的表達上調（1.23±0.20vs.5.54±1.16，t=6.324，P＜0.01）。miR-101-3p mimics組E2F2的mRNA表達低于NC mimics組（0.29±0.05vs.1.00±0.00，t=24.000，P＜0.01）。同 時，與NC mimics組相比，miR-101-3p mimics組E2F2蛋白水平出現下調（0.58±0.06vs.0.12±0.03，t=9.565，P＜0.01），見圖10。

Fig.7 The changes of LC3B fluorescence signal of MV3 cells after shGFP or shE2F2 treatment圖7 shGFP或shE2F2處理后MV3細胞中LC3B熒光信號變化

Fig.8 The effect of shE2F2 on the growth of melanoma in vivo圖8 shE2F2對黑色素瘤體內生長的影響

Fig.9 The binding sequence diagram between miR-101 and the 3'-UTR sequence of E2F2 predicted by StarBase圖9 StarBase預測miR-101與E2F2的3'-UTR序列之間的結合序列圖

Fig.10 Protein expression levels of E2F2 in MV3 cells treated with NC or miR-101-3p mimics圖10 NC mimics或miR-101-3p mimics處理后MV3細胞中E2F2的蛋白表達水平

2.4 過表達miR-101-3p mimics對黑色素瘤細胞增殖能力的影響MTT結果表明，與NC mimics組相比，miR-101-3p mimics組MV3細胞的活力在5 d時顯著降低（P＜0.01），見表2。BrdU標記試驗結果顯示miR-101-3p mimics組細胞中BrdU陽性信號細胞占 比（23.43%±2.41%）較NC mimics組（45.70%±2.60%）明顯減少（n=3，t=10.880，P＜0.01），見圖11。

Tab.2 Comparison of MV3 cell viability after treatmentwith NC mimics and miR-101-3p mimics between the two groups表2 NC mimics和miR-101-3p mimics處理后2組MV3細胞活力比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of MV3 cell viability after treatmentwith NC mimics and miR-101-3p mimics between the two groups表2 NC mimics和miR-101-3p mimics處理后2組MV3細胞活力比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別NC mimics組miR-101-3p mimics組t 1 d 0.18±0.02 0.19±0.02 0.692 2 d 0.38±0.03 0.36±0.03 0.711 3 d 0.74±0.05 0.68±0.04 1.779 4 d 1.11±0.16 0.87±0.08 2.336 5 d 1.90±0.05 1.26±0.12 8.784＊＊

Fig.11 BrdU positive staining in MV3 cells treated with NC mimics or miR-101-3p mimics圖11 NC mimics或miR-101-3p mimics處理后MV3細胞中BrdU陽性染色圖

3 討論

惡性黑色素瘤致死率高且容易早期轉移，傳統(tǒng)手術治療并不能延長患者生存時間。研究表明靶向和免疫治療能提高患者的生存率，但在臨床上患者對其反應率并不高，這在一定程度上限制了其治療效果［6］。因此，探索更佳的治療策略仍是現階段面臨的難題之一。

3.1 E2F2在黑色素瘤中的表達及作用E2F2是一種轉錄因子，屬于E2F家族成員之一。既往研究表明家族中E2F1表達增高的患者更易侵襲且預后更差，能夠促進黑色素瘤的轉移和復發(fā)［7］。本研究團隊在之前研究中發(fā)現，E2F2位于黑色素瘤NAD+依賴性的網絡信號轉錄樞紐中心，受NAMPT調控，參與調控黑色素瘤細胞增殖與凋亡［8］，但其具體機制并不清楚。體內和體外證據表明E2F2與肝癌［9-10］、乳腺癌［11］、宮頸癌［12］、胃癌［13］等惡性腫瘤均密切相關，有望成為腫瘤預后分析的生物標志物和治療靶標。但是E2F2在不同類型腫瘤中的作用并不一致，其可能充當腫瘤抑制因子，也可能充當腫瘤激活因子［4］。目前E2F2與黑色素瘤的研究較少，兩者關系尚不清楚。本研究生物信息學分析結果發(fā)現，E2F2表達升高的黑色素瘤患者總體存活率明顯低于低表達者。利用shRNA敲低E2F2表達后，G0/G1期細胞比例明顯升高，細胞周期蛋白CyclinE、CDK2表達明顯下調，體內實驗結果進一步證實E2F2表達降低后黑色素瘤的生長明顯受抑制。以上研究均提示E2F2是惡性黑色素瘤的潛在診斷標志物及治療靶點。

3.2 shE2F2處理后對黑色素瘤細胞增殖和自噬的影響 自噬是溶酶體對非功能性蛋白進行降解、促進營養(yǎng)物質重新利用的過程，因此其曾被認為是一種自我保護反應［14］。自噬和凋亡均與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，兩者具有緊密的內在聯(lián)系。缺血、缺氧、炎癥等應激引發(fā)的輕度或中度自噬能保護細胞免受損傷，但過度自噬反而會引起細胞發(fā)生凋亡［15］。本研究中，免疫熒光結果顯示shE2F2處理后LC3B的熒光信號明顯減少，說明自噬水平顯著降低，同時細胞增殖和自噬調控相關蛋白p-AKT的表達水平降低，并進而導致細胞周期阻滯蛋白p21表達上調，導致細胞分裂過程停滯，進而影響黑色素瘤細胞增殖水平，以上結果表明E2F2介導AKT的磷酸化水平，進而影響黑色素細胞的增殖和自噬水平。

3.3 miR-101-3p對黑色素瘤細胞增殖的影響 研究表明miR-101與惡性腫瘤的增殖和轉移有關，在肝癌［16］、結腸癌［17］、鼻咽癌［18］、淋巴瘤［19］等多種惡性腫瘤中表達下調，而上調miR-101的表達水平能顯著抑制腫瘤增殖。通過StarBase數據庫分析發(fā)現miR-101-3p能與E2F2 mRNA的3'-UTR特異性 結合，本研究在MV3細胞中過表達miR-101-3p后發(fā)現E2F2的mRNA和蛋白表達均顯著降低，這表明E2F2可能是miR-101-3p的靶基因之一；而MTT實驗和BrdU實驗均表明miR-101-3p可以顯著降低黑色素瘤細胞的活力和增殖水平，提示miR-101-3p靶向E2F2并抑制其表達，進而降低黑色素瘤細胞增殖水平，最終達到抑制腫瘤的結果。同時，Wandler等［20］研究表明與皮膚痣相比，黑色素瘤中miR-101的表達明顯下調，而BRAF突變的轉移性黑色素瘤中miR-101的表達較野生型轉移性黑色素瘤明顯降低，這與本研究結果一致。

綜上所述，miR-101-3p靶向介導黑色素瘤中轉錄因子E2F2表達，而E2F2不僅在黑色素瘤的輔助診斷及預后評估中具有重要作用，而且有可能成為臨床治療黑色素瘤的潛在靶點。今后的研究中筆者將繼續(xù)深入探究E2F2及其相關信號通路在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制，并研發(fā)以miR-101-3p為靶點的小分子藥物等，改善臨床治療效果。