秋水仙素對豬屎豆的誘變及同源四倍體種質(zhì)創(chuàng)制的研究

倪成鳳，冷青云，虞道耿，張 瑜，劉國道*，楊虎彪*

秋水仙素對豬屎豆的誘變及同源四倍體種質(zhì)創(chuàng)制的研究

倪成鳳1,2，冷青云2，虞道耿2，張 瑜2，劉國道2*，楊虎彪2*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101

豬屎豆是重要的農(nóng)業(yè)植物資源，在綠肥、飼用和藥用等方面都有重要的開發(fā)潛力，然而目前關(guān)于豬屎豆的品種培育還處于空白，生產(chǎn)上缺乏優(yōu)良品種導(dǎo)致生產(chǎn)性能參差不齊的問題突出，開展多倍體育種研究可為今后豬屎豆種質(zhì)資源創(chuàng)新利用和培育新品種奠定材料基礎(chǔ)。本研究以二倍體豬屎豆為實驗材料，通過不同質(zhì)量濃度秋水仙素和不同處理時間對豬屎豆露白種子進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，探討秋水仙素對二倍體豬屎豆的誘變效果，并利用流式細(xì)胞倍性檢測和根尖染色體核型分析對誘變后代的倍性進(jìn)行檢測，進(jìn)一步比較分析二倍體和同源四倍體的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞大小以及葉片和種子形態(tài)等特征變化。結(jié)果表明：與對照相比，秋水仙素處理抑制了豬屎豆種子胚根的生長和下胚軸的伸長，使種子胚軸發(fā)生誘變而縮短變粗。研究發(fā)現(xiàn)以100 mg/L的秋水仙素濃度浸泡12 h時豬屎豆種子四倍體誘導(dǎo)率最高，為13.33%，總體效果最佳。與二倍體相比，同源四倍體植株葉片下表皮的氣孔長度和寬度、保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度顯著增加而氣孔密度顯著降低；同源四倍體植株的葉片寬度和葉柄寬度顯著增加，而葉片長度和葉柄長度顯著縮短；同源四倍體植株的葉形指數(shù)顯著減小。此外，同源四倍體植株所獲種子較二倍體顯著增大，種子百粒重較二倍體顯著增加。綜上所述，本研究掌握了秋水仙素誘導(dǎo)加倍豬屎豆的方法，并成功獲得了同源四倍體豬屎豆新種質(zhì)，為豬屎豆遺傳育種及相關(guān)基礎(chǔ)研究奠定了種質(zhì)基礎(chǔ)。

豬屎豆；秋水仙素；誘導(dǎo)；同源四倍體

豬屎豆（，2n=2x=16）為豆科豬屎豆屬植物。該物種不僅具有藥用價值還是優(yōu)質(zhì)的綠肥作物，在飼用方面也具有潛力，創(chuàng)新利用的前景較廣[1]。目前，對于豬屎豆的研究多集中在化學(xué)成分、藥理活性、綠肥和園林綠化等方面[2-6]，對于農(nóng)藝性狀和高效栽培方面的研究較少。此外，關(guān)于豬屎豆資源評價及創(chuàng)新利用的研究十分薄弱，對于豬屎豆種質(zhì)創(chuàng)制及新品種培育方面的研究處于空白。

多倍體誘導(dǎo)對種質(zhì)資源利用和新種質(zhì)的形成具有重要意義，在種質(zhì)資源創(chuàng)新方面發(fā)揮著重要作用。一般而言，多倍體植物大多表現(xiàn)出與其二倍體不同或更優(yōu)良的表型特征[7]，如莖較粗壯、葉片大而肥厚、花朵和果實變大等，細(xì)胞體積亦隨著染色體數(shù)目的增加而增大[8]。通過染色體加倍可使基因組直接復(fù)制而基因型保持不變，但遺傳物質(zhì)倍增，從而達(dá)到植株生長健壯、非生物脅迫耐受性增強、各種營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物含量增多的目的[9-11]，多倍體誘導(dǎo)還可應(yīng)用于克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙[12]，因此多倍體誘導(dǎo)在植物育種中占據(jù)著重要地位，廣泛應(yīng)用于各類植物的育種計劃中。其中，利用抗有絲分裂劑秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體是目前常用的方法。早在1937年，秋水仙素就被應(yīng)用于提高植物的倍性水平，且成功地誘導(dǎo)出四倍體曼陀羅[13]。目前，秋水仙素誘導(dǎo)加倍技術(shù)已在蔬菜[14]、花卉[15]以及藥用植物[16]種質(zhì)創(chuàng)制中得到廣泛應(yīng)用，在扁蓿豆[17]、紫花苜蓿[18]、柱花草[19]等豆科牧草育種中也有應(yīng)用。秋水仙素的誘變效應(yīng)與植物種類、秋水仙素濃度、處理時間等多種因素有關(guān)聯(lián)[20]，不同植物種類最佳誘導(dǎo)效果所需的處理組合是不同的，如劉美妍等[14]誘導(dǎo)黃瓜萌動種子最佳組合為0.40%秋水仙素處理4 h，四倍體誘導(dǎo)率為18.00%；陸建農(nóng)等[21]誘導(dǎo)葛屬種子最佳處理組合為0.15 g/L秋水仙素處理48 h，四倍體誘導(dǎo)率為18.75%；徐鵬飛等[22]誘導(dǎo)毛竹吸脹種子最佳組合為0.5 g/L秋水仙素處理72 h和1 g/L秋水仙素處理24 h，誘導(dǎo)率均可達(dá)5.00%。不同作物的耐受性有顯著差異，掌握最佳的秋水仙素濃度和處理時間是提高誘導(dǎo)效率的關(guān)鍵。

豬屎豆是重要的農(nóng)業(yè)植物資源，由于缺乏優(yōu)異的栽培品種，導(dǎo)致多種生產(chǎn)弊端逐漸顯露，例如產(chǎn)量不一、生長期不一致、抗病性不一等問題。本研究擬通過秋水仙素誘導(dǎo)加倍的方法，創(chuàng)制四倍體種質(zhì)，一方面是達(dá)到提升豬屎豆生產(chǎn)性能的目的；另一方面可利用加倍后的四倍體種質(zhì)與同屬近緣四倍體種質(zhì)開展種間雜交，改良豬屎豆品質(zhì)性狀，為培育健康飼料資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為二倍體豬屎豆種子，由國家熱帶牧草種質(zhì)資源中期（備份）庫提供。選顆粒大小相似且飽滿的二倍體豬屎豆種子，置于有濕潤濾紙的培養(yǎng)盒中，在25℃恒溫箱中黑暗條件下進(jìn)行處理并直至種子露白。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素誘導(dǎo)處理 經(jīng)預(yù)處理的豬屎豆露白種子，采用不同秋水仙素溶液濃度和不同處理時間的雙因素處理試驗，質(zhì)量濃度分別為0（CK）、50、100、200 mg/L，并每個處理加入2%二甲基亞砜，處理時間設(shè)為12、24、48 h。將種子置于25℃、150 r/min的搖床中避光震蕩處理。按上述試驗方法布置2組試驗，每個處理組25粒種子，3次重復(fù)。處理結(jié)束后，用蒸餾水沖洗3～5遍后播種于盆缽中。播種6 d后選取其中一組觀察并統(tǒng)計不同秋水仙素濃度和時間處理組合下胚根長度、胚軸長度和胚軸直徑的變化情況，另一組繼續(xù)常規(guī)水肥管理。

1.2.2 出苗率、形態(tài)變異率的觀測 自播種后第4天起，每隔2 d統(tǒng)計一次種子出苗及存活情況。種子播種6 d后統(tǒng)計出苗率；待幼苗生長14 d后，根據(jù)植株外部形態(tài)變化：下胚軸膨大，整個胚軸增粗、植株矮小等確定為形態(tài)變異苗，計算形態(tài)變異率；將對照和形態(tài)變異幼苗繼續(xù)培養(yǎng)，并統(tǒng)計其存活株數(shù)。

出苗率=播種6 d后每處理出苗數(shù)/每處理種子總數(shù)×100%

形態(tài)變異率=播種14 d后變異苗數(shù)/14 d后存活苗數(shù)×100%

1.2.3 誘導(dǎo)植株的倍性鑒定 參考冷青云等[23]的倍性鑒定方法，以二倍體豬屎豆為對照，取對照植株和存活的形態(tài)變異植株嫩葉0.1 g，加入1 mL WPB細(xì)胞裂解液的器皿中切碎過濾，再加入50 μL DAPI染色劑，等待5 min后上機(jī)檢測。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果統(tǒng)計誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=（純合或混倍）株數(shù)/處理種子總數(shù)×100%

參考冷青云等[24]的染色體制片方法，以二倍體豬屎豆為對照，取對照和經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的四倍體植株進(jìn)行根尖體細(xì)胞染色體制片，選擇制片較好的染色體在Leica DM 2500生物顯微鏡下觀察并保存圖片。

1.2.4 豬屎豆同源四倍體和二倍體表型特征比較 選取對照和四倍體豬屎豆植株相同部位的葉片，將指甲油涂抹于待測葉片下表皮，晾干成膜后用透明膠帶將表皮輕輕撕下，然后將膠帶固定于載玻片上，在Leica DM2500生物顯微鏡下觀察并拍照測量。每種倍性選5株，每株取1片葉片，每片葉片保存5個視野，統(tǒng)計單位面積下的氣孔數(shù)并計算氣孔密度，且每片葉片隨機(jī)選取20個保衛(wèi)細(xì)胞和氣孔，測量長度、寬度，并進(jìn)行比較分析。

氣孔密度（個/mm2）＝各視野中氣孔個數(shù)/視野真實面積（mm2）。

選取對照和四倍體豬屎豆植株近似部位的葉片，每個倍性選5株，每株取3片葉片，測量其葉長、葉寬、葉柄長和葉柄寬等形態(tài)指標(biāo)，并計算葉形指數(shù)（葉形指數(shù)=葉長/葉寬）。利用Videometer Lab4種子表型成像分析系統(tǒng)對經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)所獲二倍體和四倍體豬屎豆種子表型性狀進(jìn)行比較和分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同秋水仙素濃度和處理時間對豬屎豆種子出苗率和胚根胚軸的影響

對處理后種子進(jìn)行定期觀察并統(tǒng)計其出苗情況，發(fā)現(xiàn)對照種子播種2 d后全部出苗，出苗速度一致，而在不同秋水仙素濃度和不同時間處理時出苗較緩慢且不整齊，隨著生長進(jìn)程的推進(jìn)出苗數(shù)不規(guī)律增加，約6 d后達(dá)到穩(wěn)定，隨后幼苗逐漸出現(xiàn)不同程度死亡。因此，對播種6 d的種子出苗率進(jìn)行統(tǒng)計分析。如圖1所示，經(jīng)秋水仙素處理后，豬屎豆露白種子出苗率隨秋水仙素濃度和處理時間的增加呈不同程度地下降。處理時間為12 h時，秋水仙素各處理濃度下出苗率均在96%以上且與對照之間差異均不顯著，對豬屎豆露白種子出苗率影響較??；處理時間為24 h時，秋水仙素各處理濃度下出苗率在85%～87%之間，與對照差異顯著；而以更長時間48 h處理時，出苗明顯受到阻礙，其中以濃度為100 mg/L秋水仙素溶液處理時最低，出苗率僅為29.33%，而以濃度為200 mg/L秋水仙素溶液處理時，出苗率比在其余2個濃度下高，可能是因為前期秋水仙素對此處理下豬屎豆露白種子抑制作用還未表現(xiàn)，為此重點觀測了后期幼苗生長和存活情況。以低濃度50 mg/L處理時，2個處理時間12、24 h與48 h之間的出苗率差異顯著，而以更高濃度100 mg/L和200 mg/L處理時，出苗率隨著處理時間的增加而減小，不同處理時間之間的出苗率差異顯著。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

同時觀察發(fā)現(xiàn)，通過不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液和不同時間處理結(jié)束6 d后，對照豬屎豆露白種子正常生長，而用秋水仙素處理后其生長速度減慢，幼芽整個胚軸明顯縮短且變粗。對每個處理組合豬屎豆胚根和胚軸變化進(jìn)行測量分析，如表1所示，當(dāng)處理時間相同時，除濃度50 mg/L秋水仙素溶液處理12 h外，其余所有秋水仙素濃度處理的豬屎豆種子胚根長度均顯著低于對照；當(dāng)秋水仙素濃度相同時，隨著處理時間的增加，豬屎豆的胚根長度也呈縮短趨勢，且3個處理時間之間差異顯著，其中以200 mg/L秋水仙素溶液處理24 h和48 h后，其胚根長度最短僅8 mm左右。與對照相比，以不同秋水仙素濃度和時間組合處理豬屎豆露白種子，對其胚軸的生長具有明顯的抑制效應(yīng)，總體表現(xiàn)為胚軸長度顯著（<0.05）降低，而胚軸直徑顯著增加。上述結(jié)果表明，與其余處理組合相比，以低濃度50 mg/L的秋水仙素溶液處理12 h、24 h和48 h時，豬屎豆種子的下胚軸發(fā)生誘變而縮短變粗，而此時的胚根生長受到的影響較小。

表1 不同秋水仙素濃度和處理時間對誘變種子胚根和胚軸的影響

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (<0.05).

2.2 秋水仙素處理后豬屎豆幼苗形態(tài)變化

待播種14 d后，誘導(dǎo)植株在形態(tài)上發(fā)生明顯變異。如圖2所示，對照二倍體豬屎豆幼苗正常生長（圖2C），經(jīng)秋水仙素處理后，豬屎豆幼苗的根系和胚軸發(fā)生較大變化。根據(jù)不同的形態(tài)變異特征分為2種類型。類型1（圖2A）：株高與對照相比無明顯差異且都有真葉，而形態(tài)變異幼苗下胚軸膨大，胚根較短，根系較少。類型2（圖2B）：形態(tài)變異幼苗生長明顯受到抑制，整個胚軸縮短增粗，生長緩慢無真葉冒出，胚根明顯縮短，根系縮短。根據(jù)統(tǒng)計，當(dāng)以濃度為50 mg/L和100 mg/L秋水仙素處理豬屎豆露白種子12 h和24 h時，變異苗形態(tài)特征均含有類型1和類型2；當(dāng)以濃度為50 mg/L和100 mg/L秋水仙素處理豬屎豆露白種子48 h時，變異苗形態(tài)特征為類型2；當(dāng)以濃度200 mg/L秋水仙素處理12、24、48 h時，變異苗形態(tài)特征均為類型2。

對生長14 d的幼苗的存活及變異情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。如表2所示，在不同秋水仙素濃度和時間處理下，豬屎豆幼苗存活株數(shù)不同程度的減少，而同時豬屎豆幼苗形態(tài)基本都發(fā)生不同類型的變異。其中，以濃度為100 mg/L和200 mg/L處理時，形態(tài)變異率高達(dá)100%。處理時間為48 h時，但存活株數(shù)顯著降低。

圖2 秋水仙素處理幼苗變異特征

表2 不同秋水仙素濃度和處理時間幼苗形態(tài)變異率統(tǒng)計

2.3 誘導(dǎo)植株的倍性鑒定

待幼苗長至4～5片真葉時，用流式細(xì)胞儀檢測誘變植株的倍性。檢測結(jié)果從葉片細(xì)胞DNA含量分布圖可以看出，對照材料二倍體的熒光強度在6300處出現(xiàn)單峰值（圖3A）；12 600處出現(xiàn)單峰值初步確定為四倍體（圖3B）；同時在6300和12 600處出現(xiàn)峰值為混倍體（圖3C）。

為進(jìn)一步驗證流式細(xì)胞儀檢測的誘導(dǎo)植株的倍性，經(jīng)核型分析，最終證實對照豬屎豆二倍體植株根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=2×=16（圖4A），誘導(dǎo)植株根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n= 4×=32，屬于誘導(dǎo)加倍的四倍體種質(zhì)（圖4B）。

圖3 不同倍性豬屎豆植株的葉片DNA相對含量

圖4 豬屎豆二倍體和四倍體植株染色體數(shù)目比較

統(tǒng)計對照和形態(tài)變異幼苗的存活情況，并對檢測結(jié)果統(tǒng)計分析，如表3所示，以濃度為100 mg/L秋水仙素溶液處理種子12 h，四倍體誘導(dǎo)率為13.33%；以濃度為50 mg/L秋水仙素溶液處理種子24 h，四倍體誘導(dǎo)率為8%。經(jīng)以上2個秋水仙素濃度和時間組合處理豬屎豆露白種子可以獲得較高的誘導(dǎo)率，總體以100 mg/L秋水仙素溶液處理種子12 h的誘導(dǎo)率最高，效果最佳。此外，與全部存活的對照植株相比，形態(tài)變異幼苗存活株數(shù)隨著秋水仙素濃度和時間的增加而減少，因此可在處理時適當(dāng)增加種子的數(shù)量以此獲得較多的四倍體植株。

2.4 豬屎豆四倍體種質(zhì)和二倍體種質(zhì)的表型特征比較

多倍體植株區(qū)別于正常植株的一個顯著特征是氣孔大，氣孔密度變小。如圖5所示，四倍體和對照豬屎豆植株在植物葉片下表皮的保衛(wèi)細(xì)胞長和寬、氣孔長和寬以及氣孔密度上會有所差異，經(jīng)測量比較（表4），四倍體豬屎豆葉片下表皮的保衛(wèi)細(xì)胞平均長度和寬度分別是對照二倍體的1.57倍和1.50倍；四倍體豬屎豆葉片下表皮的氣孔長度和寬度分別是對照二倍體的1.70倍和1.61倍，而四倍體豬屎豆葉片下表皮的氣孔密度較對照二倍體降低了51.66%。由此可見，隨著倍性的增加，豬屎豆植物葉片下表皮的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞顯著增大而氣孔密度顯著降低，體現(xiàn)了多倍體的巨大性。

表3 不同秋水仙素濃度和處理時間對豬屎豆種子的誘導(dǎo)效果

圖5 豬屎豆二倍體（A）和四倍體（B）植株氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞

表4 豬屎豆二倍體和四倍體植株氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

豬屎豆四倍體種質(zhì)與二倍體種質(zhì)的葉片表型發(fā)生變化，與二倍體相比（圖6A），四倍體植株的葉片葉緣不平、葉面褶皺、葉質(zhì)肥厚（圖6B）。進(jìn)一步對四倍體種質(zhì)和二倍體種質(zhì)的中央小葉葉長、葉寬、葉形指數(shù)（葉長/葉寬）以及三出復(fù)葉葉柄長和葉柄寬進(jìn)行測量比較，結(jié)果顯示，四倍體種質(zhì)的中央小葉長度、寬度、長寬比以及三出復(fù)葉葉柄長、葉柄寬分別是二倍體的0.90倍、1.25倍、0.72倍、0.76倍和1.29倍（表5）。由此可見，四倍體豬屎豆植株的葉片寬度和葉柄寬度較二倍體顯著增加，而葉片長度、葉柄長度以及葉形指數(shù)較二倍體顯著降低。

圖6 豬屎豆二倍體（A）和四倍體（B）植株葉片形態(tài)特征

表5 豬屎豆二倍體和四倍體葉片形態(tài)特征比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

與二倍體豬屎豆種子相比，四倍體豬屎豆的種子明顯發(fā)生變化（圖7）。經(jīng)測量比較（表6），四倍體種子面積、粒長、粒寬、粒寬/粒長和百粒重之間均有顯著差異。四倍體面積、粒長、粒寬、粒寬/粒長分別是二倍體的1.27倍、1.13倍、1.11倍、0.98倍。四倍體百粒重為1.372 g，比二倍體種子增加了0.429 g。由此可見，與二倍體相比，四倍體豬屎豆植株所獲種子顯著增大，種子百粒重顯著增加。

3 討論

秋水仙素是作物倍性育種中常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，主要用于干擾細(xì)胞正常分裂，阻礙紡錘體的形成，使染色體數(shù)目增加，然后獲得同源多倍體[25]。但是秋水仙素毒性較大，種子在處理過程發(fā)生失活，或者對后期種子的萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生影響。例如徐佳琦等[26]用秋水仙素處理洋紫荊種子，其成苗率隨著秋水仙素濃度的增加逐漸降低，且種子胚根生長受損而緩慢或者不繼續(xù)生長。張錫慶等[27]用秋水仙素對有斑百合進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)研究顯示，萌發(fā)種子胚根生長受阻而變慢，而下胚軸膨大變粗。程志號等[28]以浸泡法處理火龍果露白種子，受秋水仙素毒害作用使后期幼苗相繼死亡。本研究利用秋水仙素處理豬屎豆露白種子，與對照相比，主要變化表現(xiàn)為露白種子生長較緩慢，胚根長度變短，甚至在較高秋水仙素濃度和較長時間處理之后，胚根因受到毒害幾乎停止生長。秋水仙素處理時間越長，出苗率就越低，當(dāng)處理時間為48 h時，出苗率急劇下降，而以短時間處理出苗率雖較高，但仍受毒性影響，部分幼苗后期依舊不能正常長出真葉而死亡。研究發(fā)現(xiàn)，誘變處理后形態(tài)變異苗后期存活株數(shù)隨著秋水仙素濃度和處理時間的增加而逐漸減少，當(dāng)秋水仙素濃度達(dá)200 mg/L時，幼苗受秋水仙素的影響而生長受阻，存活數(shù)最高僅10株。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)僅在100 mg/L+12 h和50 mg/L+24 h兩種處理組合下有較高的四倍體誘導(dǎo)率，分別為13.33%和8.00%，其余各處理組合下四倍體誘導(dǎo)率很低或者檢測結(jié)果大多是生長不穩(wěn)定的混倍體植株。因此，就秋水仙素濃度和處理時間影響的各因素綜合考慮，以100 mg/L的秋水仙素濃度浸泡豬屎豆露白種子12 h，四倍體誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)效果最佳。

圖7 豬屎豆二倍體（A）和四倍體（B）種子形態(tài)特征

表6 豬屎豆二倍體和四倍體種子表型特征比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

在植物倍性育種中，隨著倍性的變化，植株細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的含量也會相應(yīng)的出現(xiàn)變化。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行植物倍性鑒定不僅可以較短時間分析和測量大量細(xì)胞，而且DNA含量的變化可直接在分布圖上顯示[29]，且不受取材部位和時間的影響。流式細(xì)胞儀檢測倍性操作不會受限于取材部位和時間，取材量小可大量鑒定，彌補了染色體計數(shù)法取材苛刻，操作復(fù)雜的缺陷。本研究利用流式細(xì)胞儀對秋水仙素誘導(dǎo)的豬屎豆進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)對照二倍體的熒光強度在6300處出現(xiàn)單峰值，疑似誘導(dǎo)加倍四倍體的熒光強度在12 600處出現(xiàn)單峰值。進(jìn)一步開展的核型分析確定了對照材料二倍體的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=2x=16，而誘導(dǎo)加倍材料的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=4x=32，確定為誘導(dǎo)成功加倍的四倍體新種質(zhì)。由此認(rèn)為，在豬屎豆倍性育種中，對誘導(dǎo)材料的倍性檢測可用快速便捷的流式細(xì)胞儀檢測。

因染色體的加倍效應(yīng)，同源四倍體植株的形態(tài)表型與二倍體植株相比常表現(xiàn)出明顯的差異，通常表現(xiàn)在部分植物器官的巨大性變化，例如漆慧娟[30]在甜葉菊多倍體誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)同源四倍體具有葉片氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞顯著增大而氣孔密度明顯變小的特點，武江等[31]開展萱草多倍體誘導(dǎo)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四倍體葉片比二倍體短而寬、葉形指數(shù)明顯減小，王強[32]比較同源四倍體和二倍體豇豆表型特征顯示，四倍體植株葉片、果莢均變大，而吳繁花[19]在柱花草同源四倍體誘導(dǎo)中同樣發(fā)現(xiàn)四倍體植株氣孔、葉片和種子都顯著大于二倍體。在本研究中，與二倍體豬屎豆相比，同源四倍體植株葉片氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞明顯變大而氣孔密度降低，葉片長度縮短而寬度增加，葉形指數(shù)變小，四倍體種子變大，百粒重增加，植物總體表現(xiàn)為葉片大、莖粗、種子百粒重增大等多個生長勢提升的性狀表現(xiàn)。本研究掌握了秋水仙素誘導(dǎo)加倍豬屎豆的方法，并成功獲得了同源四倍體豬屎豆新種質(zhì)，該種質(zhì)在生長表型性狀上較對照二倍體材料具有明顯優(yōu)勢，該四倍體種質(zhì)為豬屎豆遺傳特性研究及品質(zhì)改良提供了極為重要的材料基礎(chǔ)，此外對于更多同源四倍體的各種特性還需進(jìn)一步開展同源四倍體子代研究。

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Mutagenesis ofby Colchicine and Autotetraploid Germplasm Innovation

NI Chengfeng1,2, LENG Qingyun2, YU Daogeng2, ZHANG Yu2, LIU Guodao2*, YANG Hubiao2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

is an important agricultural plant resource, which has important development potential in green manure, fodder and medicine, but at present, there are no cultivated varieties ofThe production drawbacks caused by germplasm heterozygosity in production are gradually revealed,the exchange of genes related to fine agronomic traits among germplasm is restricted, so the research on polyploid breeding can lay a material foundation for the innovative utilization ofgermplasm resources and the cultivation of new varieties in the future. In this study, in order to investigate the mutagenesis effect of colchicine on, the polyploid induction ofseeds with different concentrations of colchicine and different treatment time were conducted. Then, the ploidy of the progenies was detected by flow cytometry and root tip karyotype analysis. Furthermore, the stomatal and guard cell size, leaf and seed morphology of diploid and autotetraploid were compared. The results showed thatcompared with the control, colchicine treatment inhibited the growth of the radicle and the elongation of the hypocotyl ofseeds, and the hypocotyl was obviously shortened and thickened. Concentration soaking in 100 mg/L for 12 h had the best induction effect, the induction rate was 13.33%. Compared with diploid, the stomatal length, stomatal width, guard cell length and guard cell width of the lower epidermis of the leaves of the autotetraploid plants significantly increased while the stomatal density significantly decreased; the leaf width and petiole width of the autotetraploid plants significantly increased, while the leaf length and petiole length significantly decreased, and the leaf shape index of autotetraploid plants significantly decreased. Compared with the diploid, the seeds obtained from autotetraploid plants significantly increased, and the weight of 100 seeds significantly increased. This study reveals the method of colchicine-induced doubling of, obtained the autotetraploidgermplasm, which would lay the germplasm foundation for the genetic breeding and related basic research of.

; colchicine; mutagenesis; autotetraploid

S551

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.010

2022-03-01；

2022-03-25

國家科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項“中國南方草地牧草資源調(diào)查”（No. 2017FY100600）。

倪成鳳（1996—），女，碩士研究生，研究方向：草種資源保護(hù)。*通信作者（Corresponding author）：劉國道（LIU Guodao），E-mail：liuguodao2008@163.com；楊虎彪（YANG Hubiao），E-mail：yanghubiao@163.com。