龍腦樟法呢基焦磷酸合酶基因克隆及表達(dá)模式分析

楊 琳，張杭穎，楊 帆，朱澤榕，李秋妹，張君誠*

龍腦樟法呢基焦磷酸合酶基因克隆及表達(dá)模式分析

楊 琳1，張杭穎1，楊 帆2，朱澤榕1，李秋妹1，張君誠1*

1. 三明學(xué)院藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建三明 365004；2. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350000

法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthetase，F(xiàn)PS）是萜類及其衍生物合成的關(guān)鍵限速酶。本研究以龍腦樟為材料，基于轉(zhuǎn)錄組測序，克隆基因，利用生物信息學(xué)軟件分析該基因編碼的氨基酸序列特征，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測基因的表達(dá)，分析龍腦樟根、莖、葉中該基因的表達(dá)與總萜含量的關(guān)系。結(jié)果表明：基因的開放閱讀框?yàn)?053 bp，編碼350個(gè)氨基酸，分子量為40.4 kDa，等電點(diǎn)pI為5.25，親水性平均值（GRAVY）為-0.299。氨基酸同源性與沉水樟最高（98.86%），含有7個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)富含天冬氨酸的基序[DDXX(XX)D]。二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的比例分別為61.14%、6.57%、2.86%和29.43%，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與沉水樟極其相似。系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）結(jié)果顯示，CcFPS蛋白與同為樟科的沉水樟、山蒼子的FPS處于同一個(gè)分支上?；蛟邶埬X樟的根、莖、葉中均有表達(dá)，且表達(dá)具有組織特異性，在葉中的相對表達(dá)量最高，根中次之，莖中最低。在CcFPS蛋白調(diào)控的萜類物質(zhì)代謝通路中，莖中的總萜含量最高，根中次之，葉中最低。龍腦樟基因表達(dá)與總萜含量具有相關(guān)性，為進(jìn)一步解析基因在龍腦樟萜類化合物合成過程中的作用提供參考。

龍腦樟；法呢基焦磷酸合酶（FPS）；基因表達(dá)；總萜

龍腦樟（）是鮮葉精油中富含右旋龍腦（天然冰片）、葎草烯、齊墩果酸、龍腦香醇酮等萜類及其衍生物的樟樹，素有植物黃金的美譽(yù)[1]。其作為食品、醫(yī)藥、香料等重要原料，有止痛、抗菌、消炎等作用，常應(yīng)用于治療心血管疾病、冠心痛等[2]。近年來，已有研究表明，龍腦樟提取物在抗炎、抗氧化及抗癌方面也有十分顯著的效果[3-4]。

龍腦樟的鮮葉精油主要含有萜類化合物（類異戊二烯）[5]。類異戊二烯是維持植物生長發(fā)育必需的有機(jī)物質(zhì)，通過甲羥戊酸途徑（mevalonic acid pathway，MVA pathway）及5-磷酸脫氧木酮糖/2C-甲基4-磷酸-4D-赤蘚糖醇途徑途徑（1-dexoy-D-xylulose 5-phosphate/2C-methy 1-E- erythritol 4-phosphate pathway，DOXP/MEP pathway）途徑合成[6-7]，均以異戊烯基焦磷酸為前體合成萜類化合物，如圖1所示[8]。FPS是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，是異戊烯基焦磷酸和二甲基烯內(nèi)焦磷酸縮合反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶[9]，催化甾醇、法呢基化蛋白和多萜等異戊烯衍生物合成[10]。目前，已從擬南芥和金線蓮等植物體中克隆基因，該基因在植物中表達(dá)具有組織特異性，同時(shí)還影響類異戊二烯衍生物的含量[11-12]。但在樟科植物中，僅香樟中克隆了基因，未見基因表達(dá)調(diào)控下游產(chǎn)物富集的報(bào)道[13]。本研究通過克隆基因，探究基因表達(dá)對龍腦樟萜類物質(zhì)的合成代謝的影響，為龍腦樟天然資源的綜合開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍腦樟取自江西吉安移栽至福建三明，經(jīng)三明學(xué)院張君誠教授鑒定。取移栽龍腦樟當(dāng)年生、半木質(zhì)化、無病蟲害的枝條，剪成具有4～6個(gè)腋芽的莖段作為外植體，將其經(jīng)過表面消毒后組織培養(yǎng)8個(gè)月。將龍腦樟組培苗移栽至花盆中（營養(yǎng)土∶蛭石為3∶1），放置在25℃（晝）/20℃（夜）、相對濕度60%～70%、光照300 μmol/(m2·s)（14 h）/黑暗（10 h）的光照培養(yǎng)室培養(yǎng)6個(gè)月。

圖1 植物萜類化合物的生物合成途徑

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 取長勢一致移栽6個(gè)月的龍腦樟苗木的根、莖、葉，液氮速凍并于–70℃保存，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別參照全能型植物RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)，北京）和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書提取獲得龍腦樟根、莖、葉的cDNA備用。

1.2.2基因開放閱讀框的克隆 基于龍腦樟RNA-seq結(jié)果，采用以Primer 5.0 設(shè)計(jì)基因開放閱讀框引物5-ATGGCTGCGGCGCC AAATGG-3/5-CTACTTTTGCCTCTTGTAGATCTTGCCCAAG-3，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以龍腦樟根、莖、葉的cDNA混合液為模板，使用高保真酶Prime STAR HS DNA polymerase（TaKaRa，大連）擴(kuò)增，擴(kuò)增總體系為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5 min；94℃變性30 s，60.7℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，以1.5%瓊脂糖凝膠，110 V電壓，電泳30 min。采用Gel Extraction Kit（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）回收目的基因的DNA片段，連接PMD19-T（TaKaRa，大連）載體，轉(zhuǎn)化、涂板后挑取單克隆，菌液檢測陽性后送上海美吉生物公司進(jìn)行測序。

1.2.3 CcFPS蛋白的生物信息學(xué)分析 使用生物信息學(xué)軟件分析CcFPS蛋白的理化特性（https:// web.expasy.org/protparam）、氨基酸疏水性（http:// web.expays.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa.automat.pl?Page=npsa_sopma.html）、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（https://swissmo del.expasy.org/）等。下載已知植物的FPS氨基酸序列，使用DNAman構(gòu)建CcFPS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4基因的表達(dá)分析 分別取龍腦樟根、莖、葉的cDNA為模板，將龍腦樟根、莖、葉的cDNA樣品稀釋至濃度一致，每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以持家基因作內(nèi)參[14]，利用NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST設(shè)計(jì)和基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物（表1）。采用SYBR Green法通過qPCR檢測基因在根、莖和葉中的表達(dá)量，反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，延伸結(jié)束收集熒光，46個(gè)循環(huán)，之后從50℃開始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每個(gè)溫度保持5 s。最后用2–△△CT法計(jì)算各樣品中基因的相對表達(dá)量，并進(jìn)行顯著性分析。

表1 CcFPS基因的qPCR引物序列

1.2.5 龍腦樟總萜的提取 用無菌蒸餾水洗凈移栽6個(gè)月長勢一致的龍腦樟的根、莖、葉，烘干研磨成粉末狀。將過60目篩精密稱量2 g的龍腦樟根、莖、葉粉末放置于錐形瓶中。按液料比10∶1（mL/g）加入95%乙醇，在額定功率300 W的超聲波清洗器中45℃水浴40 min。將超聲處理后的粗提液至于大型離心管中，4℃ 8000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確吸取樣品液50 μL，用95%乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到龍腦樟不同組織器官萜類化合物提取液。

1.2.6 龍腦樟總萜的含量檢測 用電子天平稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，將其溶于95%乙醇中，并定容至10 mL容量瓶中，獲得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品液。按照梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，依次得到濃度為0.2、0.04、0.008、0.0016、0.000 32 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品液。使用紫外分光光度計(jì)，在210 nm測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15-16]。取龍腦樟不同組織器官萜類化合物提取液，于210 nm處檢測吸光值，計(jì)算樣品總萜含量。

1.2.7 龍腦樟萜類化合物與基因相關(guān)性分析 使用SPSS v.18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對基因表達(dá)和萜類化合物含量進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcFPS基因的ORF序列

以龍腦樟的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，在1000～2000 bp之間有單一亮帶。經(jīng)測序，該擴(kuò)增片段長1053 bp，編碼350個(gè)氨基酸（圖3）。

M: DL2000 DNA marker.

2.2 CcFPS蛋白的氨基酸序列特征

CcFPS蛋白的開放閱讀框編碼350個(gè)氨基酸，分子量為40.4 kDa，等電點(diǎn)pI為5.25，親水性平均值（GRAVY）為–0.299。該氨基酸序列與沉水樟（，RWR95015.1）、山蒼子（，ART33314.1）、臘梅（，ACJ38671.1），野大豆（，XP_0282 04967.1）和樂昌含笑（，ACS74708.1）的FPS氨基酸序列同源性均超過75%，與沉水樟的FPS蛋白具有很高的同源性（98.86%），含有7個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)富含天冬氨酸的基序[DDXX(XX)D]（圖3）。通過軟件Signalp 4.1和TMHMM預(yù)測為非信號肽序列，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的比例分別為61.14%、6.57%、2.86%和29.43%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖4所示。系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）分析結(jié)果顯示，CcFPS蛋白與同為樟科的沉水樟、山蒼子的FPS處于同一個(gè)分支上，其中與沉水樟的親緣關(guān)系較近（圖5）。

相似度用黑色（100%）、灰色（33.34%～83.34%）和白色（0%～33.33%）背景表示。線段表示FPS的保守結(jié)構(gòu)域，編號從1到7。2個(gè)方框內(nèi)為富含天冬氨酸的高度保守區(qū)。

2.3 CcFPS基因的表達(dá)特征

通過qPCR檢測龍腦樟不同器官中基因的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，基因在龍腦樟的根、莖、葉中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，是根的1.69倍，是莖的2.56倍，二者差異均達(dá)極顯著；莖的表達(dá)量最低，僅是根的0.66倍，葉的0.39倍，二者差異顯著（圖6）。

圖4 龍腦樟和沉水樟FPS蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.4 總萜含量變化

以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，所得的回歸方程為=0.0689+0.0638，2=0.9925，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。測得龍腦樟根、莖和葉中的總萜含量如圖7所示。根、莖、葉中均含有萜類物質(zhì)，其中根和莖中的含量高于葉中的，分別為67.60 mg/g和70.23 mg/g，二者差異不顯著；葉中含量最低，僅為50.84 mg/g，與根差異顯著，與莖差異極顯著。

圖5 龍腦樟與其他植物的FPS蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

2.5 相關(guān)性分析

通過對龍腦樟不同器官中總萜含量與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析（圖6和圖7），結(jié)果表明，龍腦樟總萜含量與基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)性為=0.979，=0.131。

3 討論

不同的提取方式影響植物萜類化合物的含量。本研究采用超聲波法提取龍腦樟中的總萜成分，其根、莖、葉中的含量分別為67.60、70.23、50.84 mg/g。已有研究人員比較了水蒸氣蒸餾、同時(shí)蒸餾萃取、溶劑浸提、超聲輔助提取、微波輔助提取和超聲-微波協(xié)同萃取作為預(yù)處理方法提取艾納香葉中左旋龍腦、異龍腦和樟腦等萜類化合物等的效率，不同預(yù)處理方法聯(lián)合GC測定的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均滿足要求，回收率存在差異[17-18]。楊長水等[15]使用超聲輔助法提取黃花三寶木中總萜成分，得率為1.27%。在檢測龍腦樟中龍腦、乙酸龍腦酯、異龍腦等一種或幾種萜類化合物含量時(shí)，多使用水蒸汽蒸餾法提取，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離和檢測[19-20]。結(jié)果顯示，龍腦樟鮮葉中提取純化后的天然冰片中右旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98.45%以上，樟腦及乙酸龍腦酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，不含異龍腦[19]。龍腦樟植物不同部位右旋龍腦的含量，結(jié)果顯示陰干后葉較高為63.97%[20]。

本研究檢測總萜含量在莖部最多，其次是根部，葉片中最少。龍腦樟萜類化合物種類在不同器官中不同，葉中的萜類化合物種類最豐富，有36種，根和莖中分別有26種和27種[21]。陰干后葉中右旋龍腦的含量（63.97%）較龍腦樟植物的鮮花、鮮枝、鮮皮、鮮葉、干枝、干葉、落葉等部位高[20]。總萜種類和部分萜類化合物含量差異還與植物自身所累積的次生代謝物的產(chǎn)物含量具有組織或器官特異性有關(guān)[22]，且伴隨著植物生長發(fā)育其含量往往也會有所變化[22-23]。江西省不同產(chǎn)地的樟樹根、莖、枝、果、葉中龍腦樟揮發(fā)油含量及物理性質(zhì)方面存在顯著差異[24-25]；不同化學(xué)型、不同干燥方式均會影響龍腦樟不同組織器官揮發(fā)油的含量[25-28]。

qPCR結(jié)果顯示，基因在葉中的表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量較低，葉與莖、葉與根的差異性均為極顯著，根和莖的表達(dá)性為顯著?；蛟诮蔀a（）、刺五加（）、金線蓮（）的不同組織器官中也均有表達(dá)[12, 29-30]，葉中的表達(dá)量高于莖和根[29-30]。CUNILLERA等[31]分析了擬南芥的和基因，結(jié)果表明這2個(gè)基因在根、莖、葉、幼苗及花中均有表達(dá)，其中基因在根和花中表達(dá)量較高，而基因在根和花中表達(dá)量較低，在花序中優(yōu)先累積。由此可知，基因?yàn)榧易寤颍煌幕蛟诮M織器官的表達(dá)量具有組織表達(dá)特異性。基因的表達(dá)還會影響萜類化合物的合成[32-33]。研究表明，千里光（）中的基因在大腸桿菌中表達(dá)，可提高倍半萜含量[32]；轉(zhuǎn)基因珠子參（）細(xì)胞系中基因的相對表達(dá)量、FPS酶活及皂苷含量相比于野生型均有不同程度的提高[33]。然而，在植物體中，除了基因表達(dá)外，蛋白翻譯、酶活力、下游物質(zhì)代謝等因素都會影響萜類化合物的富集[34]。本研究結(jié)果表明，龍腦樟不同組織器官基因表達(dá)和萜類化合物含量為負(fù)相關(guān)，可能與龍腦樟萜類化合物次生代謝途徑的多樣性有關(guān)。DMPP與2個(gè)IPP分子頭尾縮合生成牻牛兒基焦磷酸鹽（GPP）后，F(xiàn)PS催化GPP生成法尼基焦磷酸鹽（FPP）。FPP是倍半萜、三萜和甾體的生物合成前體，是植物中萜類生物合成的分支點(diǎn)酶，調(diào)節(jié)植物甾醇的生物合成[12]。萜類化合物代謝途徑的復(fù)雜性也是影響不同器官FPS基因表達(dá)和總萜含量的重要因素。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)錄組測序擴(kuò)增的開放閱讀框序列是基因序列?；蛟邶埬X樟的根、莖、葉中均有表達(dá)，且表達(dá)具有組織特異性；基因表達(dá)與龍腦樟總萜含量呈負(fù)相關(guān)。該研究為進(jìn)一步解析通過調(diào)控基因表達(dá)，提高龍腦樟右旋龍腦（天然冰片）、葎草烯、齊墩果酸、龍腦香醇酮等萜類化合物成分富集提供參考。

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Molecular Cloning and Expression of Farnesyl Pyrophosphate Synthetase in

YANG Lin1, ZHANG Hangying1, YANG Fan2, ZHU Zerong1, LI Qiumei1, ZHANG Juncheng1*

1. Fujian Provincial Medical Plant Exploitation and Utilization Engineering Research Center, Sanming University, Sanming, Fujian 365004, China; 2. School of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350000, China

Farnesyl pyrophosphate synthase (FPS) catalyzes the key step of isoprenoid biosynthesis. The expression level ofgene influences the composition and content of essential oil in. In this research, based on transcriptomic analysis, the open reading frame (ORF) sequence ofwas cloned from. The characteristics of amino acids of CcFPS protein was analyzed by bioinformatic softwares. The expression pattern ofand total terpene content were detected from leaf, root, and stem by quantitative real-time PCR and ultraviolet spectrophotometry, respectively. The results showed that the ORF ofwas 1053 bp in length, encoding 350 amino acids with molecular weight 40.4 kDa, isoelectric point pI 5.05, and grand average of hydropathicity (GRAVY) -0.299. The secondary structure contained 61.14% α-helice, 6.57% extended strand, 2.86% β-turn and 29.43% random coil. The three-dimensional structural was predicted to be similar with FPS of. The CcFPS protein possessed seven conserved domains and two aspartate-rich motifs [DDXX(XX)D] and showed the highest homology with FPS of(98.86%). Phylogenetic tree analysis showed that the CcFPS protein was clustered into the same group with the FPS proteins fromand. The expression ofshowed tissue specific expression, highest level in leaf and lowest level in stem, although it’s detectable in leaf, root and stem. The total terpenes content was the highest in stem, following in root and the lowest in leaf. The total terpene content was correlated with the expression of. The study would provide insights into understanding the role ofin the terpenoids metabolic in.

; farnesyl pyrophosphate synthetase (FPS); gene expression; total terpene

Q949.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.005

2021-12-16；

2022-03-14

福建省科技廳面上項(xiàng)目（No. 2020J01382）；福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目（No. JAT190703）。

楊 琳（1986—），女，博士，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：張君誠（ZHANG Juncheng），E-mail：19900204@fjsmu.edu.cn。