ICP-MS 測定補腎填精口服液中30 種無機元素的分析及風(fēng)險評估

湯遜尤，孫輝，丁野，葉惠瑄，黃勝，方磊

1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南 長沙 410001；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410021

補腎填精口服液是由人參、鹿茸（酥）、牛鞭（酥）、狗鞭（酥）、黃芪、當(dāng)歸、肉蓯蓉、陽起石（煅）、枸杞子、杜仲、黑順片、菟絲子、熟地黃、淫羊藿、韭菜子等15 味藥材組成的中藥制劑。臨床上用于腎陽虧虛，腰膝痿軟或冷痛，手足不溫，陽事不舉，精冷，精神萎靡或乏力等。

補腎填精口服液的處方中含有礦物藥——陽起石，陽起石是深色玉石的成分之一。質(zhì)地細膩的陽起石可以作為觀賞石。纖維狀的可用作工業(yè)石棉。而塊狀、致密的陽起石被中醫(yī)認(rèn)為性溫咸，有溫腎壯陽的功效，用來治療陽痿、遺精、早泄等癥狀。這也是其中文名字的由來。陽起石首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種溫補無毒的藥材，其主要用于治療寒熱，腹痛，無子，陽痿不起等癥［1］。其主要成分為含水硅酸鎂鈣［Ca2Mg5(Si4O11)2(OH)2］，是一種硅酸鹽類的閃石族透閃石［2］。補腎填精口服液中使用的是煅陽起石，在其炮制方法中較為常用［3］，經(jīng)此處理后其溫腎補陽的作用能夠得到加強［4-5］。

雖然在歷代主流的本草文獻中認(rèn)為陽起石無毒，但古人對于礦物類藥材持謹(jǐn)慎態(tài)度，因為礦物藥主要是由多種無機元素組成，其獨特的形成過程，容易受到有毒有害元素的污染［6-7］，導(dǎo)致有學(xué)者認(rèn)為其不宜入藥［8-9］，因此建立含礦物藥中成藥的多元素分析是很有必要的。目前對于無機元素的測定方法有許多，如原子吸收光譜法［10］、原子熒光光譜法［11］、X 射線衍射法［2,12］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法［13］和電感耦合等離子體質(zhì)譜法［14-15］。其中電感耦合等離子體質(zhì)譜法因具有檢測限低，線性范圍寬，準(zhǔn)確快速等特點，已被廣泛用于多種中藥的無機元素分析中［14-18］。本試驗采用微波消解作為前處理方法，建立ICP-MS 對補腎填精口服液中30 種無機元素的測定方法，并且采用聚類分析法和主成分分析法（PCA）對無機元素進行分析，從無機元素層面對該中成藥的質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性進行評估。

1 材料

1.1 儀器

MARS6 微波消解儀（美國CEM 有限公司）；AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；VB24UP 型恒溫加熱器（天津天大天發(fā)有限公司），iCAP-Q 型ICP-MS 分析儀（美國賽默飛有限公司）；GenPure UV-TOC/UF 型超純水（美國賽默飛科技有限公司）。

1.2 試藥

砷（As）、鋇（Ba）、鈹（Be）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銫（Cs）、銅（Cu）、鋰（Li）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鉛（Pb）、銣（Rb）、鍶（Sr）、鉈（Tl）、釩（V）、鑭（La）、鈰（Ce）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、銪（Eu）、釓（Gd）、鋱（Tb）、鏑（Dy）、鈥（Ho）、鉺（Er）、鐿（Yb）、釔（Y）等混標(biāo)濃度為100 μg/mL；汞（Hg）、銠（Rh）、錸（Re）等單標(biāo)濃度為1 mg/mL；所有元素均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。MOS 級硝酸購于北京化學(xué)試劑所有限責(zé)任公司；補腎填精口服液均由九芝堂股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS 儀工作參數(shù)

使用調(diào)諧液對ICP-MS 的各項參數(shù)進行調(diào)諧，其中射頻功率為1.45 kW，蠕動泵轉(zhuǎn)速為45.0 r/min，冷卻氣體流速為12 L/min，輔助氣體流速為0.8 L/min，霧化氣流速為0.75 L/min，霧化室溫度為2.7 ℃，各元素的積分時間為0.2 s，采集模式為動能歧視模式，采集次數(shù)為3 次。測試時采用內(nèi)標(biāo)法進行，其中7Li、9Be、51V、52Cr、55Mn、59Co、60Ni、63Cu、75As、85Rb、88Sr、89Y、114Cd 以103Rh 作為內(nèi)標(biāo)，133Cs、137Ba、202Hg、205Tl、208Pb、139La、140Ce、141Pr、146Nd、147Sm、153Eu、157Gd、159Tb、163Dy、165Ho、166Er、172Yb 以186Re 為內(nèi)標(biāo)。

2.2 微波消解條件

采用程序升溫進行消解，具體參數(shù)如表1 所示。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備各精密量取一定量體積的29 種元素混標(biāo)溶液和Hg 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%HNO3制成濃度為1 000 ng/mL 的29 種元素和100 ng/mL 的Hg 元素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按需求進行逐級稀釋。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密吸取一定體積的Rh 和Re 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成濃度為200 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備精密量取樣品溶液1 mL，置于聚四氟乙烯的密閉消解罐中，再加入6 mL硝酸，混勻，預(yù)消解放置過夜，放入微波消解儀中按照“2.2”項下的程序進行消解。消解完成后，冷卻至室溫，再緩慢擰開消解罐蓋子，將消解罐置于110 ℃的消解罐中，使得硝酸揮干至約1 mL 后轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中，將消解罐用純化水洗滌3 次，洗滌液合并至量瓶中，然后用純化水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。同法制成試劑空白。

2.4 線性關(guān)系考察

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲備液，用2% HNO3進行稀釋，配置成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項下條件進行測定，檢測結(jié)果以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，以待測元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將空白溶液連續(xù)進樣11 次，根據(jù)測定結(jié)果產(chǎn)生的響應(yīng)值的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為對應(yīng)元素的檢出限，其相關(guān)結(jié)果見表2。

表2 30種無機元素線性關(guān)系及檢出限

2.5 精密度試驗

取同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項下條件連續(xù)測定6 次，記錄測得值，通過計算得到各元素的RSD 為0.21%～3.42%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

精密量取樣品1 mL，按照“2.3.3”項下的方法進行樣品制備，再按“2.1”項下條件進行檢測，記錄試驗值，計算得到各元素的RSD 為1.24%～3.11%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密量取同一批次樣品1 mL，共6 份，按照“2.3.3”項下的方法進行樣品制備，將樣品置于室溫下，每隔1 小時按“2.1”項下條件進行檢測，共檢測6 h，計算得到各元素的RSD 為0.54%～2.41%，表明供試品溶液，在室溫條件下6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗

精密量取同一批次樣品0.5 mL，精密加入0.5 mL濃度為2 μg/mL（其中汞濃度為0.2 μg/mL）的混標(biāo)溶液，按照“2.3.3”項下的方法進行樣品制備，再按“2.1”項下條件進行檢測，記錄結(jié)果，計算得到各元素的平均回收率為89.22%～108.51%，RSD為1.32%～3.09%。

2.9 樣品的測定

將廠家提供的11 批次樣品，按照“2.3.3”項下的方法進行樣品制備，再按“2.1”項下條件進行檢測，檢測結(jié)果見表3。

從表3 中的數(shù)據(jù)可知，11 批次補腎填精口服液中30 種無機元素的含量差異很大，其中Mn、Rb、Sr 和Ba 這四種元素含量較高，約占30 種元素總量的85%以上。而《中國藥典》2020 年版對中藥材中重金屬及有害元素的限量標(biāo)準(zhǔn)為［19］：砷不得過2 mg/kg、鉛不得過5 mg/kg、汞不得過0.2 mg/kg、鎘不得過1 mg/kg、銅不得過20 mg/kg。本次實驗結(jié)果可知11 批次補腎填精口服液樣品中重金屬及有害元素的含量均在安全限度范圍內(nèi)。

表3 不同批次樣品中無機元素的測定結(jié)果 mg/L

2.10 數(shù)據(jù)評價分析

2.10.1 單因子污染指數(shù)分析目前，《中國藥典》2020 年版僅對中藥材中砷、鉛、汞、鎘、銅等5 種金屬及有害元素進行限量，因此，采用單因子污染指數(shù)法對補腎填精口服液中重金屬污染情況進行評價，計算公式如下。

式中：PI為各元素的污染指數(shù)；Ci為5 種重金屬的實測濃度，mg/kg；Si為5 種重金屬的限量值，mg/kg。參照《中國藥典》2020 年版中的要求，單因子污染指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)分別為：正常值PI＜0.2，輕微污染0.2≤PI＜0.6，中度污染 0.6≤PI＜1.0，重污染PI≥1.0，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，11 批次樣品中僅批號為20200701 的樣品中Hg 受到輕微污染，其他元素及樣品批次污染風(fēng)險低。

表4 重金屬單因子污染指數(shù)

2.10.2 聚類分析采用SPSS22.0 對補腎填精口服液中30 種無機元素的含量進行聚類分析。以平方歐式距離為標(biāo)準(zhǔn)，組間連接為連接方式，分析結(jié)果見圖1，當(dāng)類間距為20 時，可分為2 類，第一類為批號20200701、20200702，剩下的為一類；當(dāng)類間距為15 時，可分為3 類，第一類為批號20200701、20200702，第二類為批號20200904、20200905，剩余的為另一類；當(dāng)類間距為10 時，可分為4 類，第一類為批號20200701、20200702，第二類為批號20200904、20200905，第三類為批號20201002、20201203、20 201004；第四類為批號20210201、20210401、20210501、20210502。由此可知，聚類結(jié)果與補腎填精口服液的生產(chǎn)批次有一定相關(guān)性。這種結(jié)果的產(chǎn)生是因為在鄰近生產(chǎn)日期，原材料的投料可能為同一批次，說明原材料具有一定的批間差異。

圖1 不同批號補腎填精口服液無機元素含量的聚類分析（使用平均連結(jié)的樹狀圖）

3 討論

本研究采用微波消解作為前處理方式，建立了ICP-MS 法同時測定補腎填精口服液中30 種無機元素的方法。本樣品雖為液體制劑，但顏色較深，且偶見久置后瓶底有少許沉淀，因此不能將樣品直接稀釋后進行測定，需將樣品先在室溫下預(yù)消解過夜，再采用微波消解進行消解，防止發(fā)生“爆罐”的情況，避免設(shè)備的損壞。對所建立的測定方法進行了方法學(xué)的驗證，線性方程相關(guān)性良好，靈敏度高，干擾小。

補腎填精口服液中無機元素含量可以將不同生產(chǎn)批號的樣品進行區(qū)分，這在某種程度上也能很好地說明樣品間的穩(wěn)定性。此外，補腎填精口服液中無機元素水平含量較高的是Mn、Rb、Sr 和Ba 這四種元素，而對于《中國藥典》2020 年版中有規(guī)定的5 種重金屬及有害元素——砷、鉛、汞、鎘、銅，樣品中含量均遠低于限量值，其安全性還是較高的。

綜上所述，本實驗建立了補腎填精口服液中30種無機元素的ICP-MS 測定方法。通過單因子污染指數(shù)和聚類分析對生產(chǎn)批次間的安全性和穩(wěn)定性進行了研究，為中藥中無機元素的含量與生產(chǎn)穩(wěn)定性的評估提供了一種思路，同時為該藥的質(zhì)量控制提供了一定參考。