4個(gè)糖酵解途徑基因的siRNA干擾及其在肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中的沉默效應(yīng)

劉永峰，李 衡，付尚辰，肖 宇

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

動(dòng)物宰后肌肉在一定時(shí)間內(nèi)仍具有生命活動(dòng)，在經(jīng)歷一系列生化變化后形成可食用的肉[1]。由于宰后肌肉細(xì)胞很快進(jìn)入缺氧狀態(tài)，糖酵解成為畜禽宰后肉品質(zhì)成熟過程中肌肉能量代謝的主要類型，對(duì)肉品質(zhì)形成起到重要作用[2-4]。

糖酵解途徑作為宰后重要代謝途徑，其影響因素很多，其中蛋白磷酸化修飾可通過調(diào)節(jié)糖酵解過程中的酶活性而影響糖酵解速率。已有研究主要涉及儲(chǔ)存時(shí)間、溫度等外界條件變化對(duì)宰后肌肉中蛋白磷酸化的影響。張艷等研究了冰溫貯藏過程中羊肉蛋白磷酸化水平的變化[5]；任馳通過對(duì)宰后羊肉不同儲(chǔ)存條件的研究，發(fā)現(xiàn)糖酵解相關(guān)酶和肌肉收縮相關(guān)蛋白是2大類主要的磷酸化蛋白質(zhì)[6]；劉滿順通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與糖酵解途徑密切相關(guān)的磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFKM)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM)和果糖二磷酸醛縮酶A(fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA)的磷酸化水平在高品質(zhì)和低品質(zhì)羊肉中存在極顯著差異[7]。PFKM、PKM、PGK1和ALDOA都是糖酵解途徑中的重要酶，其中，PFKM可催化果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-二磷酸這一不可逆反應(yīng)，是糖酵解途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶和葡萄糖代謝途徑的限速酶[8-9]；PKM催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP；PGK1催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸；ALDOA催化糖酵解途徑中果糖1,6-二磷酸、磷酸二羥丙酮、甘油醛-3-磷酸之間的轉(zhuǎn)變。蛋白磷酸化修飾屬于蛋白質(zhì)在翻譯后水平上的調(diào)控，而細(xì)胞內(nèi)部對(duì)這些酶編碼基因的表達(dá)調(diào)控(轉(zhuǎn)錄水平)及相關(guān)機(jī)制尚不明確。

近年來對(duì)肉品質(zhì)相關(guān)功能基因的研究很多，但已報(bào)道的相關(guān)研究多針對(duì)某個(gè)或少數(shù)肉品質(zhì)相關(guān)基因。參與脂肪酸攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding proteins, FABPs)I-FABP、L-FABP、H-FABP等在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[10]。鈣蛋白酶(calpain，CAPN)是一類需要鈣離子調(diào)節(jié)的內(nèi)源性蛋白水解酶，參與機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育及降解等過程，在宰后肉嫩化過程中發(fā)揮重要作用，與肉的嫩度、色澤等品質(zhì)形成密切相關(guān)[11-14]。阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)是能量平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用的一種大分子蛋白激素前體物[15]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-actived receptor,PPAR)PPARA、PPARG是影響甘油三酯合成和脂肪酸沉積、在脂肪組織中調(diào)控脂肪酸代謝的核心轉(zhuǎn)錄因子[16]。二?；视王；D(zhuǎn)移酶1(diacylglycerol-O-acyltransferase1, DGAT1)在能量調(diào)節(jié)和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用，與脂肪吸收及儲(chǔ)存過程中甘油三酯的合成和代謝密切相關(guān)，能夠促進(jìn)肌內(nèi)脂肪沉積進(jìn)而改變?nèi)馄焚|(zhì)[17]。肉品質(zhì)性狀受到機(jī)體內(nèi)、外諸多因素的影響，在體內(nèi)是許多基因參與表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜過程，而宰后成熟過程是肉品質(zhì)性狀形成的重要階段。糖酵解途徑作為宰后重要的代謝途徑，對(duì)肉品質(zhì)形成非常關(guān)鍵，解析糖酵解關(guān)鍵基因與上述肉品質(zhì)相關(guān)功能基因在轉(zhuǎn)錄水平上的相互作用，有助于深入了解肉品質(zhì)形成過程中的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制。

小分子干擾RNA(siRNA)通過將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞特異性降解mRNA，減弱或抑制目的基因的表達(dá)[18]，該技術(shù)在基因功能研究中應(yīng)用廣泛。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源基因?qū)爰?xì)胞的分子生物學(xué)技術(shù)，主要有電穿孔、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法[19]。其中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是一種以脂質(zhì)雙分子層作為載體，包裹外源基因，并通過融合方式導(dǎo)入細(xì)胞的方法，因具有操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞毒性低、對(duì)細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)而常被使用。

基于此，本研究以山羊腿部肌肉為原材料分離純化衛(wèi)星細(xì)胞，利用siRNA干擾糖酵解途徑關(guān)鍵基因PKM、PFKM、PGK1、ALDOA在肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步探究上述基因與其他15個(gè)肉品質(zhì)相關(guān)功能基因之間的表達(dá)調(diào)控互作機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料取自凍存于-80 ℃冰箱的新生山羊腿部肌肉組織；LipofectaminTM 3000轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen公司；siRNA由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成；Opti-MEM減血清培養(yǎng)基、DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)購于Gibco公司；RNA提取試劑(Trizol)、反轉(zhuǎn)錄試劑(Prime Script RT Reagent Kit)和定量試劑(SYBR Green Real-Time PCR Master Mix)購于Takara公司；中性蛋白酶、膠原蛋白酶Ⅱ、HBSS緩沖液和HEPES緩沖液購于Sigma公司；雙抗購于Hyclone公司；MgCl2、PBS緩沖液、氯仿和異丙醇均為分析純，購于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司。

中性蛋白酶溶液：0.056 g中性蛋白酶溶于10 mL HEPES緩沖液(20 mmol/L)；膠原蛋白酶Ⅱ溶液：0.04 g膠原蛋白酶Ⅱ溶于10 mL HBSS(1×)緩沖液；雙酶酶解液：中性蛋白酶和膠原蛋白酶Ⅱ的混合液；HEPES緩沖液(20 mmol/L)：0.2 mL的HEPES(1 mol/L)中加入10 mL ddH2O混合均勻；MgCl2儲(chǔ)存液(1 mol/L)：2.033 g MgCl2·6H2O中加入10 mL ddH2O充分溶解；MgCl2工作液(5 mmol/L)：100 μL MgCl2儲(chǔ)存液(1 mol/L)中加入上述雙酶酶解液；PBS沖洗緩沖液：PBS緩沖液中加入8%雙抗；完全培養(yǎng)基：由DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20% FBS和1%雙抗組成；分化培養(yǎng)基：由DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2% HS和1%雙抗組成。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，新加坡ESCO公司；IX71熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；微量紫外分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；反轉(zhuǎn)錄儀，美國Bio-Rad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，美國梅潔公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；低溫冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中查詢山羊PKM、PFKM、PGK1、ALDOA基因的mRNA序列，根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)目的基因的siRNA序列和陰性對(duì)照(negative control, NC)序列，如表1所示。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.2 山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取新生山羊腿部肌肉組織2 g，充分剪碎后用PBS緩沖液沖洗，然后使用雙酶酶解液在37 ℃搖床上消化30 min，4 ℃、50 g條件下低速離心，100 μm過濾器過濾消化液。取濾液在4 ℃、300 g條件下離心，收集底層細(xì)胞重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。山羊肌肉細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第2代，傳至2代再次傳代后接種于6孔板中。將培養(yǎng)皿放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)達(dá)到約80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與誘導(dǎo)分化

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA4個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組，每個(gè)轉(zhuǎn)染組同時(shí)設(shè)置1個(gè)平行陰性對(duì)照組(NC)，即NC1、NC2、NC3、NC4。每個(gè)轉(zhuǎn)染組及其對(duì)照組各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別配置轉(zhuǎn)染試劑，將配置好的轉(zhuǎn)染試劑混合后孵育15 min，然后在每孔細(xì)胞培養(yǎng)液中各加入200 μL，輕搖混勻后置于培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染5 h后，將培養(yǎng)基更換為2% HS低血清含量的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，并分別于誘導(dǎo)分化0、2、3、4、5 d后，采用400×倒置顯微鏡觀察肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3.4 細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成

將誘導(dǎo)分化5 d的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，PBS緩沖液沖洗2～3遍。每孔加入1 mL Trizol裂解液，參照陳雪梅等[20]的方法，分別提取4個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組及相應(yīng)NC組的總RNA。測(cè)定RNA的濃度和純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用于后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 目的基因與監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)量測(cè)定

引物合成：篩選15個(gè)肉品質(zhì)相關(guān)功能基因作為監(jiān)測(cè)基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找4個(gè)目的基因和15個(gè)監(jiān)測(cè)基因的CDS序列，采用Primer 3.0分別設(shè)計(jì)qPCR引物，并在Primer-BLAST上檢測(cè)引物特異性。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 目的基因和監(jiān)測(cè)基因的qPCR引物序列Tab.2 The qPCR primer sequences of target genes and monitoring genes

相對(duì)表達(dá)量測(cè)定：以山羊GAPDH為內(nèi)參基因(124 bp)，其上游引物為5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物為5′-ACCACATACTCAGCACCAGCA-3′。采用SYBR Green Ⅰ染料法進(jìn)行目的基因和監(jiān)測(cè)基因的qPCR測(cè)定，反應(yīng)體系10 μL，包含2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸3 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算4個(gè)目的基因和15個(gè)監(jiān)測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 24.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做進(jìn)一步分析，組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后的誘導(dǎo)分化結(jié)果

經(jīng)過6 h培養(yǎng)后,分離、純化得到的山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞如圖1所示?？梢钥闯?，細(xì)胞呈短梭形或多角形，已經(jīng)開始貼壁的細(xì)胞延伸呈典型的細(xì)長(zhǎng)梭形，折光性較強(qiáng)。上述結(jié)果證實(shí)，通過分離、培養(yǎng)得到了山羊原代肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。

圖1 山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞Fig.1 Goat muscle satellite cells注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0、2、3、4、5 d的4個(gè)轉(zhuǎn)染組和4個(gè)NC組細(xì)胞表型如圖2所示。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0 d時(shí)，轉(zhuǎn)染組和NC組的山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞形狀均較圓潤，呈多角形或短梭形，在培養(yǎng)基中分散分布；相較于NC組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)明顯濃厚且折光性更強(qiáng)。從誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 d開始，轉(zhuǎn)染組和NC組的細(xì)胞數(shù)目均增多，排列也更為密集，大部分細(xì)胞開始逐漸恢復(fù)貼壁細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞延長(zhǎng)呈細(xì)長(zhǎng)梭形或紡錘形，四周逐漸伸出凸起，呈星形；轉(zhuǎn)染組與NC組細(xì)胞之間無明顯差異。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3～5 d時(shí)，轉(zhuǎn)染組和NC組的細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)增多，呈一定規(guī)律緊密平行排列，少數(shù)細(xì)胞逐漸由單核進(jìn)入合體細(xì)胞階段，有長(zhǎng)竹狀肌管(亮斑處為肌管)形成，肌管數(shù)量有增多趨勢(shì)。

NC1、NC2、NC3、NC4分別代表si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA轉(zhuǎn)染組的陰性對(duì)照組。

綜上，轉(zhuǎn)染組和NC組細(xì)胞均能進(jìn)行正常生長(zhǎng)分化，呈現(xiàn)出山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞特有的增殖分化特點(diǎn)。除誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0 d時(shí)轉(zhuǎn)染組比NC組細(xì)胞質(zhì)濃厚且折光性強(qiáng)外，之后轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的表型和生長(zhǎng)特點(diǎn)與NC組之間無明顯差異。轉(zhuǎn)染組在誘導(dǎo)分化0 d時(shí)細(xì)胞質(zhì)濃厚、折光性強(qiáng)，可能是由于轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000具有一定毒性，但隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，RNA干擾沒有對(duì)細(xì)胞表型及正常增殖造成影響，可以進(jìn)行下一步的細(xì)胞沉默效應(yīng)檢測(cè)及定量表達(dá)分析。

2.2 RNA提取與鑒定

采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，每組RNA的3條帶無降解。同時(shí)，利用核酸分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，發(fā)現(xiàn)吸光度A260/A280比值均在1.7～2.0之間。以上結(jié)果說明提取的RNA質(zhì)量良好，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

M代表DNA Marker 2 000；1—8分別代表誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5 d時(shí)4個(gè)NC組(NC1、NC2、NC3、NC4)和4個(gè)轉(zhuǎn)染組(si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA)的細(xì)胞RNA。

2.3 目的基因的mRNA表達(dá)

siRNA轉(zhuǎn)染組及NC組中目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)情況如圖4所示。干擾處理后，4個(gè)目的基因的mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染組中PKM、PFKM、PGK1、ALDOA的相對(duì)表達(dá)量分別比NC組降低33.50%±0.94%、93.80%±0.49%、91.03%±7.80%、66.12%±4.02%。轉(zhuǎn)染組中PKM、PFKM、ALDOA的mRNA表達(dá)水平均與對(duì)應(yīng)NC組間差異極顯著(P<0.01)，PGK1的mRNA表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)NC組間差異顯著(P<0.05)。PFKM和PGK1的相對(duì)表達(dá)量降低較多，說明二者沉默效果較好。

2.4 糖酵解基因干擾對(duì)肉品質(zhì)功能基因表達(dá)的影響

15個(gè)肉品質(zhì)功能基因的mRNA相對(duì)表達(dá)情況如圖5所示。在si-PKM轉(zhuǎn)染組中，隨著PKM表達(dá)量的降低，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、H-FABP和CAPN1基因的表達(dá)水平下調(diào)，且除MYPN和NR1H3下調(diào)水平不顯著外，其余基因與NC組間的表達(dá)差異均達(dá)到顯著水平或極顯著水平；上調(diào)基因中，POMC基因的表達(dá)水平顯著高于NC組，L-FABP、I-FABP、CAPN3和DGAT1基因的表達(dá)水平極顯著高于NC組。在si-PFKM轉(zhuǎn)染組中，隨著PFKM表達(dá)量的下降，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、L-FABP、H-FABP、CAPN1和CAPN3等12個(gè)基因的表達(dá)水平下調(diào)，且均顯著或極顯著低于NC組；而POMC和I-FABP基因的相對(duì)表達(dá)量分別顯著和極顯著高于NC組。在si-PGK1轉(zhuǎn)染組中，隨著PGK1表達(dá)量的下降，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、L-FABP、H-FABP、CAPN1和CAPN3基因的表達(dá)下調(diào)，除H-FABP表達(dá)量顯著低于NC組外，其他基因的表達(dá)量均極顯著低于NC組；而POMC、I-FABP和DGAT1基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，且均極顯著高于NC組。在si-ALDOA轉(zhuǎn)染組中，隨著ALDOA表達(dá)量的下調(diào)，MYPN、ACOX1、POMC、PNPLA、LDHA、H-FABP、CAPN1和DGAT1基因的表達(dá)量顯著或極顯著低于NC組；I-FABP基因的表達(dá)量極顯著高于NC組。

綜上，在4個(gè)目的基因的干擾下，LDHA、MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1基因的相對(duì)表達(dá)水平均下降，除si-PKM轉(zhuǎn)染組中的MYPN基因外，上述轉(zhuǎn)染組基因的表達(dá)水平均與NC組間差異顯著或極顯著。DGAT1和POMC基因的表達(dá)水平在 si-PKM、si-PFKM和si-PGK1轉(zhuǎn)染組中上調(diào)。值得注意的是，I-FABP基因的相對(duì)表達(dá)量在4個(gè)轉(zhuǎn)染組中均極顯著高于NC組，說明4個(gè)糖酵解途徑目的基因的干擾對(duì)I-FABP基因的表達(dá)都產(chǎn)生了重要影響。

3 討論

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具有成肌和成脂分化能力，是研究肉品質(zhì)形成機(jī)制的良好模型[21]。本研究采用雙酶酶解法分離純化得到山羊肌肉細(xì)胞，并通過培養(yǎng)成功得到能夠穩(wěn)定增殖分化的原代山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，所得山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的表型特征與烏日罕和吳海青研究中的羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞表型一致[22-23]。對(duì)4個(gè)糖酵解途徑關(guān)鍵基因干擾后，通過表型觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞僅在轉(zhuǎn)染開始時(shí)存在一定差異，這可能是由轉(zhuǎn)染試劑的毒性造成的[24]；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞在增殖特點(diǎn)和表型上沒有明顯差異。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是研究細(xì)胞內(nèi)部基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的重要手段，但原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染較為困難，且不同轉(zhuǎn)染組間的沉默效率也存在一定差異。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)干擾目的基因(PKM、PFKM、PGK1和ALDOA)的表達(dá)抑制程度具有差異，4個(gè)目的基因的表達(dá)量降低33.5%～93.8%。同時(shí)，在4個(gè)轉(zhuǎn)染組中，相同肉品質(zhì)監(jiān)測(cè)基因的mRNA表達(dá)量有一定差異，這可能也與4個(gè)目的基因的表達(dá)抑制程度不同有關(guān)。

4個(gè)糖酵解途徑目的基因受到抑制后，肉品質(zhì)相關(guān)基因LDHA、MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1的相對(duì)表達(dá)量均下降。其中，LDHA可催化丙酮酸與乳酸之間的轉(zhuǎn)變[25]，其表達(dá)下調(diào)可能是糖酵解關(guān)鍵酶基因的表達(dá)下調(diào)使糖酵解速率降低，協(xié)同抑制了LDHA基因的表達(dá)；MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1分別在肌肉組織結(jié)構(gòu)組裝、脂肪酸β氧化調(diào)節(jié)、糖脂代謝調(diào)控(脂肪積累和動(dòng)員)、肌肉纖維生長(zhǎng)和水解等過程中發(fā)揮作用[11, 26-27]，這些基因表達(dá)下調(diào)說明目的基因干擾對(duì)脂肪酸氧化、糖脂代謝及肌肉結(jié)構(gòu)組裝生長(zhǎng)等通路具有重要影響。轉(zhuǎn)染組中POMC、I-FABP和DGAT1基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)，其中I-FABP基因的相對(duì)表達(dá)量在4個(gè)轉(zhuǎn)染組中均極顯著高于對(duì)照組，說明干擾糖酵解途徑基因?qū)-FABP基因具有重要調(diào)節(jié)作用。POMC參與細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝途徑的調(diào)節(jié)[15]，DGAT1在促進(jìn)細(xì)胞脂肪酸吸收和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[17]，I-FABP在脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用[10]。三者表達(dá)量上調(diào)說明在糖酵解目的基因的干擾作用下，細(xì)胞內(nèi)調(diào)動(dòng)了能量和脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑基因的表達(dá)，推測(cè)目的基因干擾降低了糖酵解速率，細(xì)胞為平衡糖酵解途徑能量變化，增加了能量代謝和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

在糖酵解途徑相關(guān)酶的研究中，林珩迅等從代謝角度闡述了冰溫貯藏對(duì)豬肉品質(zhì)劣變的影響，發(fā)現(xiàn)冰溫貯藏可以通過降低糖酵解過程中的關(guān)鍵酶(如已糖激酶、磷酸果糖激酶等)活性來減緩糖酵解速率[28]。而本研究是在體外培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞中采用RNA干擾的方式抑制糖酵解途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，這與低溫貯藏相似，均在一定程度上降低了糖酵解途徑速率。但本研究主要在基因轉(zhuǎn)錄水平上探究干擾糖酵解途徑對(duì)肉品質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，證實(shí)干擾糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)主要影響到細(xì)胞能量代謝、糖脂代謝以及細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)形成通路，其中脂質(zhì)代謝和能量調(diào)節(jié)通路基因在目的基因干擾下受到的影響最大。

4 結(jié)論

本研究以山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞為材料，利用RNA干擾技術(shù)抑制糖酵解代謝途徑中關(guān)鍵基因PKM、PFKM、PGK1和ALDOA的表達(dá)，以探究干擾基因與肉品質(zhì)形成相關(guān)基因的互作關(guān)系。RNA干擾后，山羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞均可進(jìn)行正常增殖分化，4個(gè)糖酵解途徑目的基因的表達(dá)水平下調(diào)33.5%～93.8%，同時(shí)肉品質(zhì)監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)水平也受到目的基因的影響。目的基因干擾后，對(duì)細(xì)胞能量代謝、糖脂代謝和細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)形成通路相關(guān)基因的表達(dá)影響較為明顯，其中對(duì)脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)節(jié)基因I-FABP的影響最為顯著。研究結(jié)果為在基因水平上進(jìn)一步探究肉品質(zhì)形成的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制提供了參考。