嗜熱菌ToPif1解旋酶與G四鏈體的互作活性位點預(yù)測及鑒定

張玲玲，戴陽雪，奚緒光

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

富含鳥苷酸的DNA序列可以折疊成G四鏈體(G4)，它們是通過Hoogsteen鍵連接在一起并通過單價陽離子進(jìn)一步穩(wěn)定的核酸二級結(jié)構(gòu)[1]。生物信息學(xué)研究表明，人類基因組高度富含潛在的G4形成序列[2]，這些序列存在于DNA啟動子、復(fù)制起點、減數(shù)分裂雙鏈斷裂熱點、核糖體DNA和端粒區(qū)域[3]。G4形成可以調(diào)節(jié)重要細(xì)胞過程，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯[4]；但穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)會作為物理屏障阻礙復(fù)制叉的運動，并導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。細(xì)胞中進(jìn)化有專門的解旋酶特異性調(diào)控并解旋G4二級結(jié)構(gòu)，揭示解旋酶解旋G4的分子機(jī)制至關(guān)重要。

在細(xì)胞中，G4結(jié)構(gòu)在折疊和展開狀態(tài)之間動態(tài)波動[5]，而G4的展開主要由G4解旋酶調(diào)控。目前，已報道的G4解旋酶包括RecQ家族[6]、DExH/D家族RNA解旋酶[7]以及本文研究對象Pif1家族DNA解旋酶[8]。根據(jù)解旋酶的基序及易位方向，Pif1被歸類為超家族1B解旋酶。遺傳和生化研究表明，Pif1廣泛參與細(xì)胞代謝過程，包括維持線粒體DNA[9]、負(fù)調(diào)控端粒酶[10]、參與岡崎片段處理[11]以及在斷裂誘導(dǎo)復(fù)制過程中結(jié)合聚合酶Polδ并修復(fù)相關(guān)的DNA合成[12]。Pif1還可以通過有效解旋G4而抑制由G4基序引發(fā)的基因組不穩(wěn)定，防止細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)制叉損傷、異常表觀遺傳沉默、總?cè)旧w重排等現(xiàn)象[13]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，Pif1解旋酶在哺乳動物細(xì)胞的斷裂誘導(dǎo)復(fù)制(BIR)中具有關(guān)鍵作用，Pif1依賴性BIR對腫瘤抑制很重要，推測Pif1可以作為抗癌靶點[14]。

相比于單鏈DNA、雙鏈DNA和帶有部分單鏈的雙鏈DNA底物，Pif1解旋酶優(yōu)先結(jié)合G4 DNA，表明其具有G4作用特異性[15]。Pif1與G4互作的相關(guān)研究表明，當(dāng)Pif1蛋白濃度較高時，釀酒酵母Pif1先以單體形式解開G4結(jié)構(gòu)，再在ss/dsDNA連接處發(fā)生二聚化，以二聚體形式解開下游的dsDNA[16]；當(dāng)Pif1濃度較低時，它以單體形式解開G4結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)出重復(fù)展開、重折疊的解旋機(jī)制[17-18]。Hou等利用單分子技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Pif1以反復(fù)連續(xù)形式解開G4結(jié)構(gòu)，并有G三鏈體中間態(tài)出現(xiàn)[19]。目前還沒有在原子水平上研究Pif1解旋G4活性氨基酸位點的相關(guān)報道，而這才是藥物靶點設(shè)計的重要依據(jù)。

考慮到解旋酶的熱穩(wěn)定性影響其在體內(nèi)較高溫度下與G4的互作，本研究選用嗜熱細(xì)菌ThemusoshimaiPif1(ToPif1)為研究對象，在確定ToPif1在體外具有耐熱性以及在高溫條件下還保持有效解旋活力的前提下，重點探討ToPif1參與G4 DNA結(jié)合與解旋的關(guān)鍵氨基酸位點，為Pif1家族解旋酶相關(guān)抗癌藥物的靶點設(shè)計提供重要實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET15b-Sumo-ToPif1質(zhì)粒、pET15b-Sumo載體、E.coli2984克隆菌株及E.coliC2566H表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞均由課題組前期制備保存；蛋白質(zhì)SusPif1、BsPif1、Sumo蛋白酶由課題組前期純化并保存；PrimeSTAR HS DNA聚合酶及EcoRⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA親和層析柱、Heparin純化柱購自GE公司；其他試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 DNA底物制備

核酸底物由生工生物工程(上海)有限公司合成，底物序列如表1所示。采用退火緩沖液(pH為7.5的25 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl)將底物稀釋至2 μmol/L，95 ℃水浴加熱5 min后緩慢降至室溫，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 核酸底物序列Tab.1 Nucleic acid substrate sequences

1.3 ToPif1的嗜熱特性檢測

利用圓二色譜(circular dichroism，CD)技術(shù)檢測ToPif1、嗜熱菌Sulfurihydrogenibiumsp.YO3AOP1 Pif1(SusPif1)及常溫擬桿菌Pif1(BsPif1)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的耐熱性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)CD峰譜的典型特征峰發(fā)生變化時，所對應(yīng)的溫度即為蛋白質(zhì)變性溫度，該溫度越高表明蛋白質(zhì)的耐熱性越強(qiáng)。

采用快速停留熒光共振能量轉(zhuǎn)移(stopped-flow FRET)技術(shù)測定ToPif1、SusPif1在37 ℃和50 ℃條件下的解旋活性，分析ToPif1在高溫下的解旋活力。

1.4 ToPif1-G4互作預(yù)測、突變體載體構(gòu)建及原核表達(dá)純化

根據(jù)ToPif1晶體結(jié)構(gòu)[20]，利用AlphaFold2模擬ToPif1解旋酶與G4結(jié)構(gòu)的位點特異性互作，確定空間位置上可能與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的堿性氨基酸位點。將ToPif1的潛在互作位點分別突變?yōu)椴粠щ姾傻谋彼?，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化，得到8個單點突變體蛋白。

以pET15b-Sumo-ToPif1質(zhì)粒為模板，采用PCR方法構(gòu)建8個單點突變體表達(dá)載體，進(jìn)行菌落PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ酶切鑒定并測序。將構(gòu)建正確的8個突變體重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.ColiC2566H感受態(tài)中，于18 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。使用裂解緩沖液(pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、5%甘油、5 mmol/L咪唑)重懸菌體，利用低溫高壓和超聲波裂解細(xì)胞。裂解液經(jīng)12 000 r/min高速離心后，使用Ni-NTA親和層析柱初步純化，利用Sumo蛋白酶切除Sumo-His6標(biāo)簽。酶切后的蛋白溶液進(jìn)行低鹽緩沖液(pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5%甘油、2 mmol/L EDTA)透析，并采用Heparin柱進(jìn)一步純化，使用AKTA-purifier系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。利用10% SDS-PAGE檢測突變體蛋白質(zhì)的純度，30 kDa超濾管濃縮蛋白，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ToPif1突變體的ATP水解活性測定

利用ATPase/GTPase Activity Assay Kit(Sigma-Aldrich，美國)測定ToPif1及其突變體的ATP水解活性，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并在同一波長下檢測ToPif1及其突變體的吸光度。反應(yīng)體系包括400 mmol/L ATP、1 mmol/L S18H12底物、100 nmol/L蛋白質(zhì)，反應(yīng)時間為30 min，空白對照中僅包含相同濃度的ATP和DNA底物S18H12。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算突變體通過水解ATP產(chǎn)生的磷酸量，以單位時間內(nèi)產(chǎn)生的磷酸量表示蛋白質(zhì)的ATP水解速率，即ATP水解活性。測定重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示。

1.6 G4構(gòu)型檢測及ToPif1突變體對G4的結(jié)合活性測定

利用MOS450/AF-CD光學(xué)系統(tǒng)(Bio-Logic，法國)檢測G4CEB及G4Tel的構(gòu)型，在緩沖液(pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl)中檢測濃度為2 μmol/L的G4底物，記錄220～320 nm之間的光譜信號。利用Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀測定ToPif1及其突變體對FAM熒光標(biāo)記G4CEB、G4Tel的結(jié)合活性。反應(yīng)緩沖液為pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2，反應(yīng)體系包含5 nmol/L FAM熒光標(biāo)記的DNA底物、0.2 mmol/L ADP·AlF4和不同濃度的ToPif1突變體蛋白。反應(yīng)體系在37 ℃條件下孵育2 min，測定各向異性值，測定重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示。利用如下公式計算得到平衡解離常數(shù)Kd：

Δr=Δrmax×P/(Kd+P)。

式中：Δr表示各向異性值；Δrmax表示各向異性值的最大差值；P表示蛋白質(zhì)濃度。Kd值越小，表示蛋白質(zhì)和底物的親和力越高。

1.7 ToPif1突變體的解旋活性測定

利用stopped-flow FRET技術(shù)檢測ToPif1及其突變體對雙鏈DNA(S26D17)和G4底物(S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12)的解旋活性(底物序列見表1)。反應(yīng)緩沖液為pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2，反應(yīng)體系包含4 nmol/L底物、100 nmol/L蛋白質(zhì)和1 mmol/L ATP。檢測解旋動力學(xué)時采用雙注射器模式，蛋白質(zhì)和底物混合后在37 ℃條件下孵育5 min并注射到S3通道，ATP單獨孵育5 min并注射到S4通道，反應(yīng)通過二者快速瞬時結(jié)合由ATP激發(fā)蛋白解旋活性。通過監(jiān)測熒光信號得到解旋反應(yīng)曲線，計算解旋速率和幅度以表征蛋白質(zhì)的解旋活性。每個反應(yīng)測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 ToPif1解旋酶的嗜熱性質(zhì)

根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的峰譜檢測結(jié)果(圖1)，對比ToPif1、SusPif1、BsPif1結(jié)構(gòu)的耐熱性。結(jié)果顯示，源于嗜熱菌的ToPif1和SusPif1的二級結(jié)構(gòu)在溫度高于80 ℃以上時才發(fā)生變性，而常溫菌BsPif1在48 ℃時就已經(jīng)發(fā)生變性，表明ToPif1和SusPif1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在體外條件下具有很強(qiáng)耐熱性，該結(jié)果與李丹等的研究結(jié)果一致[21]。對比嗜熱菌ToPif1、SusPif1在37 ℃和50 ℃條件下的解旋活性(圖2)，發(fā)現(xiàn)SusPif1在50 ℃條件下完全喪失解旋活力，而ToPif1仍保持有一定的解旋活力，說明ToPif1解旋酶具有獨特的嗜熱性質(zhì)，可以以ToPif1為研究對象分析嗜熱細(xì)菌Pif1解旋酶結(jié)合、解旋G4結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸位點。

圖1 ToPif1、SusPif1和BsPif1的變溫CD結(jié)果Fig.1 Variable temperature CD results of ToPif1, SusPif1 and BsPif1注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

圖2 ToPif1、SusPif1在37 ℃和50 ℃條件下的解旋曲線(a)與解旋速率及幅度(b)Fig.2 Unwinding curves (a) and unwinding rates and amplitudes (b) of ToPif1 and SusPif1 at 37 ℃ and 50 ℃注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

2.2ToPif1與G4 DNA的互作位點預(yù)測

根據(jù)ToPif1晶體結(jié)構(gòu)[20]，采用AlphaFold2對ToPif1解旋酶和G4結(jié)構(gòu)的互作位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。在空間位置上可能會與G4結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用的堿性氨基酸位點有8個，分別為R135、R139、R150、R159、K329、R355、R392、R419。圖3a中的各結(jié)構(gòu)域顏色與圖3b一致。

圖3 ToPif1與G4結(jié)構(gòu)位點特異性互作的預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction results of site-specific interaction between ToPif1 and G4 structure注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

2.3 ToPif1突變體的蛋白純化

將預(yù)測的8個潛在互作位點分別突變?yōu)楸彼?，并?gòu)建到pET15b-Sumo載體中重組表達(dá)。圖4為各突變體的純度檢測結(jié)果，所有蛋白質(zhì)的純度都高于95%，且可溶性良好、性質(zhì)穩(wěn)定，表明這些位置的單點突變對蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化沒有影響，可用于后續(xù)實驗。

圖4 ToPif1突變體的蛋白純化結(jié)果Fig.4 The protein purification results of ToPif1 mutants

2.4 ToPif1突變體的ATP水解活性

為驗證突變體設(shè)計對ToPif1解旋酶活性的影響，對ToPif1野生型及其突變體的ATP水解速率進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示。與野生型相比，8個單點突變體蛋白的ATP水解速率均沒有發(fā)生較大變化，表明這些位點的單點突變不會破壞ToPif1解旋酶的基本ATP水解活性。

圖5 ToPif1及其突變體的ATP水解活性Fig.5 ATP hydrolysis activities of ToPif1 and its mutants

2.5 ToPif1突變體對不同構(gòu)型G4 DNA的結(jié)合活性

采用圓二色譜技術(shù)檢測G4CEB和G4Tel的構(gòu)型，結(jié)果如圖6所示，G4CEB是平行構(gòu)型，G4Tel是反平行構(gòu)型。對ToPif1及其突變體與G4CEB和G4Tel的結(jié)合活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7所示。由蛋白質(zhì)與G4 DNA底物結(jié)合的Kd值可以看出：對于平行構(gòu)型的G4CEB底物， 突變體R139A、R355A的Kd值遠(yuǎn)大于ToPif1野生型，表明R139、R355位點是ToPif1結(jié)合G4CEB的重要氨基酸位點；而R135、R150、R159、R355是ToPif1結(jié)合反平行構(gòu)型G4Tel底物的關(guān)鍵氨基酸位點。以上結(jié)果說明ToPif1結(jié)合不同構(gòu)型G4所涉及的氨基酸位點不同。對比分析發(fā)現(xiàn)，R355位點對G4CEB和G4Tel的識別均至關(guān)重要，表明R355具有識別平行和反平行G4的雙重功能。

圖6 G4CEB和G4Tel的CD譜圖Fig.6 CD spectrogram of G4CEB and G4Tel

圖7 ToPif1及其突變體與G4的結(jié)合活性Fig.7 Binding activities of ToPif1 and its mutants with G4注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

2.6 ToPif1突變體的解旋活性

Pif1解旋酶發(fā)揮解旋功能需要ssDNA作為加載鏈，因此設(shè)計G4底物的5′端帶有一段ssDNA，3′端帶有一段較短的dsDNA，以模擬G4結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的復(fù)制叉停滯狀態(tài)。本研究中共設(shè)計了2種帶有不同構(gòu)型G4的解旋底物，分別為S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12。通過對比ToPif1野生型和突變體的解旋活性差異，確定ToPif1上影響不同構(gòu)型G4底物解旋的特異性氨基酸位點。同時，為明確突變體對上述底物解旋活性減弱的途徑(通過影響G4結(jié)構(gòu)還是其下游的dsDNA)，進(jìn)一步測定了突變體對S26D17的解旋活性，結(jié)果如表2所示。圖8展示了對S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12底物解旋均具有較大影響的突變體R135A、R139A和R355A的解旋活性。由表2可以看出，與ToPif1野生型相比，上述3個突變體對S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12的解旋速率都明顯降低。值得注意的是，突變體R139A對S26D17的解旋活性大大減弱，而其余突變體則與野生型相差不大。這表明R139是影響dsDNA解旋的氨基酸位點，而R135和R355是影響平行構(gòu)型G4CEB和反平行構(gòu)型G4Tel解旋的重要氨基酸位點，2個位點在ToPif1解旋不同構(gòu)型G4 DNA時都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，R150位點僅對S12-G4CEB-D12解旋具有顯著影響(圖9)，表明該位點只參與平行構(gòu)型G4的解旋。

表2 ToPif1及其突變體對dsDNA和G4底物的解旋速率及幅度Tab.2 Unwinding rates and amplitudes of ToPif1 and its mutants on dsDNA and G4 substrates

圖8 ToPif1及其突變體對S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12的解旋活性Fig.8 Unwinding activities of ToPif1 and its mutants on S12-G4CEB-D12 and S26-G4Tel-D12注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

圖9 R150A對S12-G4CEB-D12的解旋活性Fig.9 Unwinding activities of R150A to S12-G4CEB-D12注:網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

3討論

本研究首先通過熱變溫CD技術(shù)檢測了嗜熱菌ToPif1、SusPif1及常溫擬桿菌BsPif1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的耐熱性，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌ToPif1、SusPif1的二級結(jié)構(gòu)在溫度高于80 ℃時才發(fā)生變性，這與李丹等報道的嗜熱性黃石熱脫硫弧菌Pif1(TyPif1)解旋酶的二級結(jié)構(gòu)具有耐高溫特性類似[21]。此外，通過stopped-flow FRET技術(shù)測定ToPif1、SusPif1解旋酶在37 ℃及50 ℃條件下的解旋活性，發(fā)現(xiàn)50 ℃時SusPif1徹底喪失解旋活性，而ToPif1可以保持一定的解旋活性，表明ToPif1解旋酶具有獨特的嗜熱性質(zhì)。

ToPif1是目前唯一解析出結(jié)構(gòu)的嗜熱細(xì)菌Pif1解旋酶，將ToPif1與目前已知結(jié)構(gòu)的所有非嗜熱Pif1(BsPif1[22]、ScPif1[23]、Human Pif1[24])進(jìn)行比對(圖10a)，發(fā)現(xiàn)2B結(jié)構(gòu)域的角度存在顯著差異。其中，ToPif1與Human Pif1呈現(xiàn)較為閉合的狀態(tài)，而ScPif1和BsPif1呈現(xiàn)向上打開的狀態(tài)，閉合狀態(tài)會使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)更加致密，這可能是ToPif1結(jié)構(gòu)具有嗜熱性的原因之一。此外，2B結(jié)構(gòu)域是解旋的關(guān)鍵區(qū)域[20]，該結(jié)構(gòu)域的閉合狀態(tài)可能與解旋的動力學(xué)機(jī)制存在關(guān)聯(lián)。結(jié)合ToPif1高溫環(huán)境下的解旋活性，有理由認(rèn)為ToPif1的嗜熱特性與2B結(jié)構(gòu)域的閉合狀態(tài)相關(guān)。進(jìn)一步比對上述4個Pif1的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)ToPif1與其他非嗜熱Pif1差異較大的區(qū)域為150～155和289～294區(qū)域。分析2個區(qū)域的結(jié)構(gòu)可以看出，150～155區(qū)域在人類和酵母中呈現(xiàn)α螺旋，而在細(xì)菌中則為無規(guī)則卷曲，說明ToPif1在該區(qū)域與細(xì)菌的Pif1結(jié)構(gòu)較為類似(圖10b)，這與ToPif1來源于嗜熱菌的物種類型相符；ToPif1在289～294區(qū)域為α螺旋結(jié)構(gòu)，而其他非嗜熱Pif1在該區(qū)域均為無規(guī)則卷曲(圖10c)，由于該位置處于較為保守的2A結(jié)構(gòu)域內(nèi)，推測該區(qū)域的差異可能與ToPif1的嗜熱特性相關(guān)。

圖10 ToPif1與非嗜熱性Pif1的整體結(jié)構(gòu)(a)、150～155區(qū)域(b)及289～294區(qū)域(c)對比Fig.10 Comparison of the overall structures (a), regions 150～155 (b) and regions 289～294 (c) of ToPif1 and non-thermophilic Pif1注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

近年來，隨著G4結(jié)構(gòu)與人類疾病的密切關(guān)聯(lián)性被逐漸揭示，G4特異性解旋酶也被廣泛研究。目前，研究最為成熟的G4解旋酶之一是超家族Ⅱ(SF Ⅱ)的DHX36，它對平行構(gòu)型的G4結(jié)構(gòu)具有偏好性[25]。另有研究報道嗜熱厭氧桿菌Ana.Pif1解旋酶的核心結(jié)構(gòu)域蛋白對G4底物具有很高的親和力[26]。本研究通過測定ToPif1解旋酶對平行構(gòu)型G4CEB和反平行構(gòu)型G4Tel的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)ToPif1對平行及反平行構(gòu)型的G4 DNA都具有很高的親和力，表明該蛋白結(jié)合G4時對其構(gòu)型不具有偏好性。然而，在ToPif1解旋S12-G4CEB-D12和S26-G4Tel-D12底物時，ToPif1對G4Tel的解旋速率遠(yuǎn)大于G4CEB，表明Pif1解旋酶可能偏好于解開反平行構(gòu)型的G4 DNA。由此可見，ToPif1對G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合及解旋性質(zhì)與DHX36存在較大差異，SF Ⅰ和SF Ⅱ的G4解旋酶可能具有不同的G4識別與解旋機(jī)制。

先前研究揭示了DHX36結(jié)合及解旋G4結(jié)構(gòu)的機(jī)理[27]，DHX36通過N末端的18個氨基酸結(jié)構(gòu)域(RSM基序)識別平行G4結(jié)構(gòu)，而RSM基序通過覆蓋外部G-四分體并利用3個帶正電荷的氨基酸與帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)的靜電作用夾住G4[28]。本研究成功預(yù)測并驗證了ToPif1結(jié)合與解旋G4 DNA的關(guān)鍵氨基酸位點，為揭示Pif1蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)的機(jī)理提供了參考。通過測定ToPif1野生型及其突變體與G4CEB、G4Tel的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)參與不同構(gòu)型G4結(jié)合的關(guān)鍵位點存在差異，但R355位點對平行和反平行構(gòu)型G4的結(jié)合均至關(guān)重要。 通過ToPif1野生型與突變體之間的G4解旋活性差異，證明了R135和R355是ToPif1解旋G4CEB和G4Tel的關(guān)鍵氨基酸位點，R355位點在ToPif1解旋酶結(jié)合、解旋平行和反平行構(gòu)型G4 DNA的過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對比不同物種Pif1解旋酶的氨基酸序列(圖11)可以看出，R135不具有保守性，但R355在多個細(xì)菌甚至酵母和人類中都高度保守，推測該位點是Pif1蛋白家族解旋G4 DNA的保守性氨基酸位點。

圖11 細(xì)菌、酵母和人類的Pif1序列比對Fig.11 Sequence alignment results of Pif1 in bacteria, yeast and human注：ESPript網(wǎng)站預(yù)測。網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

4 結(jié)論

本研究首次證明了嗜熱菌ToPif1在體外高溫條件下仍可保留蛋白構(gòu)象及活力的嗜熱特性，為后續(xù)在體內(nèi)進(jìn)行G4-Pif1的互作研究提供了熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的研究材料。利用AlphaFold2預(yù)測出8個ToPif1與G4 DNA互作的特異性位點，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)純化得到8個ToPif1的單點突變體蛋白，8個位點的單點突變均未顯著影響ToPif1的ATP水解活力。各向異性實驗及ToPif1解旋活力測定表明，R355位點在ToPif1與G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合中具有重要功能，而R135和R355位點顯著影響G4CEB和G4Tel的解旋，這不僅為Pif1解旋酶與G4結(jié)構(gòu)的互作研究提供了思路，也為揭示嗜熱細(xì)菌Pif1解旋G4結(jié)構(gòu)的機(jī)理提供了參考。