基于深共晶溶劑溶解的蝦青素及其乳液包埋體系制備與調控

方溶熙，周 鵬，謝云霄，雷 嬋，吳逸嵐，李 斌，劉石林

(華中農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

蝦青素(astaxanthin, AXT)是一種萜烯類不飽和化合物，其分子結構中具有共軛雙鍵且兩端均是以異戊二烯為單元的六元環(huán)，因此具有較強的電子效應，能夠有效清除自由基、單線態(tài)氧和羥基自由基[1]。此外，AXT還可以改善皮膚狀況[2]、保護眼睛[3]、維護心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能[4-5]、調節(jié)免疫反應[6]。作為一種功能活性因子，AXT在食品、藥品、化妝品等行業(yè)中具有巨大應用潛力[7]，被廣泛應用于軟凝膠、微膠囊、奶油、能量飲料等領域[8]。然而，AXT分子極性較低，水溶性差，限制了其在水介質食品中的應用；AXT的化學性質也不穩(wěn)定，在加工和貯藏過程中極易發(fā)生氧化降解而喪失生物活性，生物可及性較低[9]。上述問題已經(jīng)成為當前制約AXT行業(yè)發(fā)展的關鍵因素之一。

乳化包埋法是當前保護親脂性營養(yǎng)素的常見方法，能夠實現(xiàn)對AXT的有效保護[10]。乳化包埋法通常先將脂溶性成分溶于油相中，再在一定的外力作用下將油相體系均勻分散于含有乳化劑的水相體系中以形成乳液，油滴周圍由乳化劑分子組成一層界面層。Boonlao等將AXT油樹脂溶于魚肝油中，通過乳化包埋法制備得到AXT乳液，該乳液在低溫下具有較好的儲藏穩(wěn)定性，但AXT油樹脂在魚肝油中的溶解度僅為1%左右，AXT包埋量較低[11]。Dai等將AXT溶于二氯甲烷中，通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備得到AXT微粒，并通過噴霧干燥得到AXT微膠囊；所得AXT微膠囊表面光滑，表面油含量低，流動性好；但此方法采用二氯甲烷溶解AXT，存在一定的安全與健康隱患，且AXT的溶解度也僅為1%左右，包埋量較低[12]?？紤]到AXT在氯仿、丙酮等有機溶劑中的溶解量有限且存在安全隱患，探索可以安全、健康地溶解AXT并提高其溶解度的有效乳液包埋體系是成功制備AXT乳液的關鍵。

深共晶溶劑(deep eutectic solvent，DES)是由2種或2種以上組分以特定摩爾比例混合并通過氫鍵相互作用而形成的共熔物，其中1種組分是氫鍵受體(hydrogen bond acceptor，HBA)，另1種組分是氫鍵供體(hydrogen bond donor，HBD)[13]。DES的熔點低于其所含任何單一組分的熔點，具有化學性質穩(wěn)定、組分簡單、低毒、價格低廉、生物可降解、環(huán)境友好等優(yōu)點，溶解能力強，AXT溶解量高[14]。

基于此，本研究以麝草香酚和月桂酸組成的疏水性DES為油相溶劑，將AXT溶解于DES中形成AXT-DES油相，以明膠和阿拉伯膠為水相乳化劑，通過高速剪切制備得到AXT乳液。在此基礎上，進一步研究所得AXT乳液的形貌、穩(wěn)定性、流變學特性、生物可及性和抗環(huán)境因素影響能力，探索安全、健康、高效的AXT乳液包埋體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AXT購自新和成有限公司；明膠(B型，240 g Bloom)和月桂酸(分析純，98%)購自阿拉丁試劑有限公司；麝草香酚(分析純，98%)購自Macklin生化有限公司；其他分析級試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MICCRA-D9型剪切機，德國Miccra有限公司；EX31型顯微鏡，舜宇集團儀器有限公司；KQ-300DB型水浴超聲清洗器，昆山超聲波儀器有限公司；Discovery DHR-2型流變儀，美國TA儀器有限公司；TURBISCAN TOWER型多重光散射分析儀，法國Formulaction有限公司。

1.3 AXT乳液制備

將麝草香酚和月桂酸以3∶1的摩爾比混合，70 ℃水浴鍋中磁力攪拌至澄清透明，靜置冷卻至室溫，制得DES。將AXT加入DES中(AXT質量分數(shù)為5%)，80 ℃條件下磁力攪拌5.3 h至AXT溶解，以此作為油相。乳液的水相為明膠和阿拉伯膠的混合溶液。取不同明膠/阿拉伯膠質量比(1、2.5、5、10)和不同乳化劑(明膠+阿拉伯膠)質量分數(shù)(1%、1.5%、2%、3%)的水相，逐滴加入油相，以11 000 r/min的轉速在剪切機中高速剪切乳化。保持水相與油相的質量比為9∶1。

1.4 微觀形貌觀察

取1滴乳液于光滑干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片不留氣泡，置于載物臺上，40倍鏡頭下觀察乳液的微觀形貌。乳液粒徑通過Image J計數(shù)軟件獲得，隨機選擇光學顯微照片的計數(shù)區(qū)域，所計液滴個數(shù)不少于300個。

1.5 穩(wěn)定性測定

利用多重光散射分析儀測定不同乳化劑含量的乳液穩(wěn)定性。取20 mL乳液置于圓柱形玻璃管中，25 ℃條件下測量12 h，每隔10 min掃描1次樣品。通過穩(wěn)定性指數(shù)(T)的變化評估乳液穩(wěn)定性，計算公式如下：

(1)

1.6 流變學性質測定

利用配備60 mm鋁錐板的旋轉式流變儀測試不同明膠/阿拉伯膠質量比和不同乳化劑質量分數(shù)的乳液流變學性能。所有測試均在25 ℃條件下進行，測試條件為：頻率1 Hz，應變范圍0.01%～100%，進行全應變掃描；選取適當應變值，設置角頻率范圍為1～100 rad/s，進行頻率掃描；設置剪切速率范圍為0.1～100 s-1，進行穩(wěn)態(tài)掃描。對黏度曲線進行Herschel-Bulkley模型擬合，公式如下：

τ=τ0+Kγn。

(2)

式中:τ為剪切應力；τ0為屈服應力；K為稠度系數(shù)；γ為剪切速率；n為流動因子。

按如下公式計算得到復合黏度與角頻率之間的關系：

(3)

式中:h*為復合黏度；G′為儲能模量；G″為損失模量；ω為角頻率。

1.7 環(huán)境因素對乳液的影響測定

選取明膠/阿拉伯膠質量比為5、乳化劑質量分數(shù)為1.5%的樣品用于研究環(huán)境因素對乳液的影響。首先，研究溫度對乳液的影響，將乳液樣品分別在25 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃條件下水浴加熱2 h，取出后觀察樣品的顯微形貌，并測定AXT含量；其次，將AXT乳液和AXT溶液(油相對照)在紫外條件下照射41 h，于不同時間段(0 h、18 h、29 h、41 h)測定樣品的AXT含量；最后，將AXT乳液和AXT溶液(油相對照)在27 ℃條件下避光保存，于不同天數(shù)(0 d、5 d、10 d、20 d)測定樣品的AXT含量。AXT保留率(R)按如下公式進行計算：

(4)

式中:Ct為處理后測得的AXT總濃度；C0為初始樣品中的AXT總濃度。

1.8 生物可及性測定

生物可及性研究參照Zhang等[15]的方法。模擬胃液消化：將HCl、NaCl溶于超純水中，取15 mL上述溶液加入AXT樣品，得到樣品混合鹽溶液。將胃蛋白酶與15 mL磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH=7)混合，加入樣品混合鹽溶液中，調節(jié)體系pH值至2.5，37 ℃水浴攪拌1 h?？刂企w系中胃蛋白酶的最終質量濃度為3.2 g/L，HCl的最終物質的量濃度為84 mmol/L，NaCl的最終質量濃度為2 g/L。AXT乳液取0.1 g，AXT溶液(油相對照)取與AXT乳液同等AXT當量的質量。

模擬腸液消化：將CaCl2、NaCl溶于超純水中得到CaCl2-NaCl混合鹽溶液。進行模擬腸液消化時，膽鹽溶液和胰酶懸浮液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH=7)新鮮配制。取模擬胃液消化后的樣品調節(jié)pH至7，加入1.5 mL CaCl2-NaCl混合鹽溶液和2.5 mL膽鹽溶液，再次調節(jié)pH至7，繼續(xù)加入3.5 mL胰酶懸浮液，得到模擬腸液?？刂企w系中CaCl2和NaCl的物質的量濃度分別為5 mmol/L和15 mmol/L，膽鹽溶液和胰酶懸浮液的質量濃度分別為5 mg/mL和1.6 mg/mL。

將模擬胃、腸液消化后的樣品在9 500 r/min、25 ℃條件下離心30 min，取上清液(膠束)。按照測定AXT含量的方法測定離心前后樣品中的AXT含量，按如下公式計算樣品的生物可及性(B)：

(5)

式中:Cmicelle代表膠束中的AXT濃度；Cdigestion代表胃腸消化液中的AXT濃度。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示，采用Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進行差異顯著性分析，P<0.05認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳液的微觀形貌及穩(wěn)定性

圖1為不同明膠/阿拉伯膠質量比乳液的光學顯微照片。包埋AXT的乳液整體呈紅褐色，無分層現(xiàn)象，顯微形貌為鮮紅色球狀液滴，外部連續(xù)相中無AXT晶體析出，表明負載AXT的乳液體系較為穩(wěn)定，AXT被包埋于內分散相中。由表1中的乳液粒徑結果可以看出，乳液平均粒徑隨明膠/阿拉伯膠質量比的增加而減小，平均粒徑從3.84 μm減小到2.69 μm。當明膠/阿拉伯膠質量比為5和10時，粒徑尺寸較為均一，乳液體系較為穩(wěn)定。因此，選取明膠/阿拉伯膠質量比為5的樣品用于進一步探究明膠-阿拉伯膠復合乳化劑的含量對乳液粒徑和穩(wěn)定性的影響。

圖1 不同明膠/阿拉伯膠質量比乳液的光學顯微照片F(xiàn)ig.1 The optical micrographs of emulsions with different mass ratios of gelatin/arabic gum注：網(wǎng)絡版為彩圖。

表1 不同明膠/阿拉伯膠質量比乳液的平均粒徑Tab.1 The average particle sizes of emulsions with different mass ratios of gelatin/arabic gum

圖2為不同乳化劑質量分數(shù)乳液的光學顯微照片。隨著乳化劑質量分數(shù)的增加，乳液粒徑逐漸減小，平均粒徑從4.11 μm減小至1.71 μm(表2)。這是由于明膠具有更好的乳化性，更有利于穩(wěn)定油水界面，隨著乳化劑質量分數(shù)的增加，液滴界面的蛋白覆蓋量增加，可以穩(wěn)定更多小液滴，且乳液液滴在高速剪切時聚結的概率減小，形成的乳液粒徑更小且均一[16]。

圖2 不同乳化劑質量分數(shù)乳液的光學顯微照片F(xiàn)ig.2 The optical micrographs of emulsions with different mass fractions of emulsifier注：網(wǎng)絡版為彩圖。

表2 不同乳化劑質量分數(shù)乳液的平均粒徑Tab.2 The average particle sizes of emulsions with different mass fractions of emulsifier

圖3中的乳液穩(wěn)定性測試結果表明，不同乳化劑質量分數(shù)乳液的穩(wěn)定性指數(shù)均小于1，說明乳液都較為穩(wěn)定。乳液樣品的穩(wěn)定性指數(shù)隨時間延長呈現(xiàn)出先增加后平緩的趨勢。在12 h內，隨著乳化劑質量分數(shù)從1%增加至3%，乳液穩(wěn)定性先增加后降低。當乳化劑質量分數(shù)為2%時，乳液穩(wěn)定性指數(shù)最小，表明其在儲存12 h后最穩(wěn)定。因此，當明膠/阿拉伯膠質量比為5、乳化劑質量分數(shù)為2%時，乳液粒徑較小且均一，穩(wěn)定性最佳。

2.2 乳液的流變學性能

圖4a、4b分別為不同明膠/阿拉伯膠質量比和不同乳化劑質量分數(shù)乳液的黏度測定結果。在0.1～100 s-1剪切速率范圍內，所有乳液樣品的黏度均隨著剪切速率的增加而降低，呈現(xiàn)出典型的假塑性流體剪切變稀的特點。這是由于剪切速率增加使纏結的聚合物網(wǎng)絡結構被打亂，分子間纏結的恢復速率比破壞速率慢，乳液在較高剪切速率下流動的分子間阻力較小[17]。此外，乳液黏度隨明膠/阿拉伯膠質量比的增加而降低，這是由于隨著明膠/阿拉伯膠質量比的增加，乳化劑中阿拉伯膠的濃度降低，而阿拉伯膠作為一種高分子增稠劑，對體系黏度的維持能力顯著高于明膠。乳液黏度的顯著增加也伴隨著乳化劑質量分數(shù)的增加。

圖4c、4d分別為不同明膠/阿拉伯膠質量比和不同乳化劑質量分數(shù)乳液的復合黏度測定結果。在1～100 rad/s角頻率范圍內，所有乳液樣品的復合黏度均隨著角頻率的增加而降低。乳液的初始復合黏度隨體系中阿拉伯膠含量和乳化劑含量的增加而增加。該復合黏度變化結果與黏度變化結果一致。

表3中的Herschel-Bulkley模型擬合結果表明，屈服應力(τ0)和K值均隨著乳化劑質量分數(shù)的增加而增加，表明隨著乳化劑質量分數(shù)的增加，乳液黏度增加。所有乳液樣品的流動因子(n)均小于0.5，且隨乳化劑質量分數(shù)的增加而降低。n值反映了乳液的假塑性程度，n值越小乳液的流動性越差，n=1時乳液為牛頓流體，n<1時乳液為假塑性流體。因此，不同乳化劑質量分數(shù)的乳液均為假塑性流體，具有剪切變稀的行為；隨著乳化劑質量分數(shù)的增加，乳液黏度增加，流動性變差，呈現(xiàn)出類凝膠結構。

圖4 乳液的流變學性能Fig.4 The rheological properties of emulsions注：網(wǎng)絡版為彩圖。

表3 乳液的Herschel-Bulkley模型擬合結果Tab.3 Herschel-Bulkley model fitting results of emulsions

2.3 環(huán)境因素對乳液的影響

將乳液分別于25、80、90、100 ℃條件下加熱2 h，乳液的光學顯微照片如圖5所示。隨著加熱溫度的升高，乳液發(fā)生破乳，出現(xiàn)熱聚集現(xiàn)象，乳液粒徑明顯增加。當加熱溫度從25 ℃升高至100 ℃時，乳液平均粒徑從2.50 μm增加至3.99 μm，粒徑分布不均一(表4)。這是吸附蛋白熱變性使得乳液乳化性減弱所致[18]。當液滴表面的吸附蛋白發(fā)生熱變性時，會暴露其非極性巰基，增加蛋白質分子間的相互作用，引發(fā)液滴聚集[19]。液滴聚集后，也較易出現(xiàn)聚并現(xiàn)象，因此在溫度升高后，乳液粒徑明顯增大。乳液在80 ℃和90 ℃條件下的AXT降解率分別為2.2%和5.5%(表4)，說明包埋后的AXT乳液具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性。

圖5 不同加熱溫度下乳液的光學顯微照片F(xiàn)ig.5 The optical micrographs of emulsions under different heating temperatures注：網(wǎng)絡版為彩圖。

表4 不同加熱溫度下乳液的平均粒徑及AXT保留率Tab.4 The average particle sizes and AXT retention rates of emulsions under different heating temperatures

將未包埋AXT溶液(油相對照)和包埋AXT乳液分別置于紫外燈下照射，測定不同照射時間樣品的AXT含量，結果如圖6a所示。在紫外照射時間內，包埋AXT乳液的AXT保留率均大于未包埋AXT溶液，這可能是因為乳化包埋后的乳液液滴能夠散射光波，有害光波難以進入乳液內部，從而使包埋AXT乳液具有更好的光穩(wěn)定性[20]。

圖6 包埋AXT乳液和未包埋AXT溶液(對照)的AXT保留率Fig.6 AXT retention rates of encapsulated AXT emulsion and unencapsulated AXT solution(control)

AXT的特殊結構使其對環(huán)境因素較為敏感，容易在儲存過程中受到異構化的影響[21]。將樣品在避光環(huán)境中儲存20 d，測定不同儲存時間樣品的AXT含量，結果如圖6b所示。貯存過程中所有樣品的AXT保留率均有所下降；貯存20 d后，包埋乳液中的AXT保留率為83%，比未包埋AXT溶液高5%。這是因為包埋后AXT表面形成有蛋白-多糖界面膜層，能夠減弱外界環(huán)境對AXT的影響。此外，上述包埋乳液的AXT保留率優(yōu)于已報道的AXT包埋體系。Zhang等以微球形式包埋AXT，所得AXT微球在25 ℃條件下儲存14 d后，AXT保留率僅為50.4%[22]。Zhao等通過乳化-噴干方式包埋AXT油樹脂，樣品在儲存10 d后的AXT保留率為79%左右[23]。

2.4 AXT的生物可及性

疏水性營養(yǎng)素的生物可及性主要取決于物理化學和生物化學的反應過程，包括在食物中的釋放、胃腸道液體中的溶解、化學或生化反應的轉化以及腸道上皮細胞的吸收等[24-26]。AXT的疏水性較強，而腸上皮細胞頂端表面的滲透性較差，使得AXT的生物可及性較差[27]?；诖?，本研究探究了乳液包埋對AXT生物可及性的影響，結果如圖7所示。乳化劑質量分數(shù)為1%、1.5%、2%、3%乳液的AXT生物可及性分別為81.5%、84.7%、83.4%、86.0%，相互之間無顯著性差異；而未包埋AXT溶液(對照)的AXT生物可及性僅為43%，遠低于包埋乳液的AXT生物可及性。這是由于乳化包埋提升了AXT在水溶液中的溶解性，相較于對照組，被包埋的AXT經(jīng)消化后能夠有效溶解在混合膠束中，從而增加了其生物可及性。

圖7 乳液的AXT生物可及性Fig.7 The AXT bioaccessibility of emulsions注：不同字母代表組間差異顯著。

3 結論

本研究采用DES溶解AXT作為油相、以蛋白-多糖混合體系作為乳化劑，制備AXT乳液，探究水相中明膠/阿拉伯膠質量比、乳化劑質量分數(shù)對AXT乳液的影響及乳化包埋對AXT特性的影響。明膠/阿拉伯膠質量比和乳化劑質量分數(shù)的增加均使得乳液粒徑減小，所制備的AXT乳液穩(wěn)定性良好，表現(xiàn)出剪切變稀特性，且具有類凝膠行為。與未包埋的AXT溶液相比，儲存20 d后包埋乳液的AXT保留率增加5%，為83%。包埋乳液的AXT生物可及性為83%，比未包埋AXT溶液提升37%左右。所構建的包埋體系采用食品級原料，安全性高，制備簡便，成本低廉，AXT在DES中的溶解度相對傳統(tǒng)溶劑較高。本包埋體系的構建以DES作為新型綠色溶劑，為AXT的溶解與包埋提供了新策略，拓寬了AXT在水性基質中的應用。