響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂精油微膠囊的制備工藝研究*

鄒惠亮，陳柯，陳褚建，王新財(cái)，成霄，張誠(chéng)賢，陳敏

（湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 湖州 313000）

肉桂來(lái)源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮[1]，其提取物肉桂精油有著悠久且廣泛的使用歷史。肉桂精油的主要成分為肉桂醛和丁香酚等物質(zhì)[2]。肉桂精油具有良好的抗氧化、抗菌活性[3-4]，在食品、藥品及化妝品等領(lǐng)域都具有良好的開發(fā)前景[5]。但肉桂精油容易揮發(fā)及降解，其主要活性成分在空氣中易氧化變質(zhì)而導(dǎo)致功效降低[6-7]，使其應(yīng)用受到限制。

將植物精油微膠囊化，能有效防止其氧化和降解，并且能夠控制植物精油緩慢釋放[8]。近年來(lái)，隨著微膠囊技術(shù)的日益成熟，植物精油微膠囊在眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[9]。目前常用的微膠囊制備方法有噴霧干燥法、復(fù)凝聚法、超臨界流體法等，其中復(fù)凝聚法具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，是一種良好的微膠囊制備方法。至今已有松籽油、廣藿香油、茶油和野壩子揮發(fā)油等通過(guò)復(fù)凝聚法被成功制備成微膠囊的研究報(bào)道[10-13]，但目前關(guān)于應(yīng)用復(fù)凝聚法制備肉桂精油微膠囊并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征與性能研究的報(bào)道較少。

本研究以明膠與阿拉伯膠為壁材，肉桂精油為芯材，采用復(fù)凝聚法制備肉桂精油微膠囊，并以包埋率為主要指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)微膠囊進(jìn)行顯微、紅外光譜的結(jié)構(gòu)表征和緩釋性能的測(cè)定，以期為肉桂精油的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；76-1A型電動(dòng)攪拌玻璃恒溫水浴（常州國(guó)宇儀器制造有限公司）；UV2600型紫外分光儀（日本島津公司）；Hicolet型紅外分光光度計(jì)（美國(guó)熱電公司）；T18型高速勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）；DM2500型生物顯微鏡（Leica公司）；XS205DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平（Mettler Toledo公司）；Mili-Q超純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.2 藥物與試劑 肉桂精油（批號(hào)：BH14865，上海博湖生物科技有限公司）；明膠（批號(hào)：C11527215，上海麥克林生化科技有限公司，含有量99%，生物技術(shù)級(jí)）；阿拉伯膠（批號(hào)：C12115131，上海麥克林生化科技有限公司，醫(yī)藥級(jí)）；吐溫-80（批號(hào)：C11717332，上海麥克林生化科技有限公司）；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（批號(hào)：Q15N11N130754，上海源葉生物科技有限公司）；冰乙酸（批號(hào)：20210129，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號(hào)：20130530，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 肉桂精油微膠囊制備 參照梁博等[12]的實(shí)驗(yàn)方法，并稍作修改。稱取阿拉伯膠和明膠各2 g分別溶于100 mL蒸餾水中，備用。按比例稱取一定量的肉桂精油與明膠溶液混合，同時(shí)加入2 mL吐溫-80，6 000 r/min剪切乳化2 min，在一定溫度的水浴中200 r/min的機(jī)械攪拌下，向肉桂精油混合乳液中逐滴加入阿拉伯膠溶液，攪拌均勻，隨后滴加10%醋酸溶液，調(diào)節(jié)混合液pH值至預(yù)定值，同時(shí)在顯微鏡下觀察至微囊形成，繼續(xù)反應(yīng)一定時(shí)間。從水浴取出燒杯，攪拌降溫，隨后移至冰浴中，急速降溫至10 ℃以下，用10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（固化劑）1 g，保持15 ℃攪拌固化3 h。室溫下靜置12 h，經(jīng)離心、洗滌后，得到濕微膠囊，低溫干燥，即得肉桂精油微膠囊。

2.2 肉桂精油線性關(guān)系考察 對(duì)肉桂精油進(jìn)行全波段掃描后將紫外檢測(cè)波長(zhǎng)定為286 nm。將肉桂精油用無(wú)水乙醇稀釋到不同濃度梯度，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，于286 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度與樣品濃度建立線性回歸方程。并以肉桂精油濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X軸），吸光度為縱坐標(biāo)（Y軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=209.4X-0.009 7（R2=0.999 4），線性范圍為2.0～10.0 μg/mL。

2.3 微膠囊包埋率測(cè)定 稱取0.05 g微膠囊，加入一定量的無(wú)水乙醇，超聲提取15 min，使其完全破壁溶解。過(guò)濾，將濾液稀釋至合適的體積，在286 nm測(cè)定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微膠囊中肉桂精油量[14]，然后計(jì)算微膠囊的包埋率。包埋率（%）=（微膠囊中肉桂精油的量/加入肉桂精油總量）×100%。

2.4 單因素試驗(yàn) 以包埋率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取壁芯比、復(fù)凝聚pH值、成囊溫度、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素作為單因素考察的對(duì)象。

2.4.1 壁芯比對(duì)包埋率的影響 設(shè)定復(fù)凝聚pH值為3.5、成囊溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為30 min，在不同壁芯比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1）條件下按“2.1”項(xiàng)下方法制備微膠囊，并測(cè)定包埋率，結(jié)果見圖1。在壁芯比1∶2～2∶1范圍內(nèi)，壁材濃度的增加可以提高微膠囊的包埋率；壁芯比大于2∶1時(shí)，包埋率反而降低?？赡鼙诓臐舛冗^(guò)低時(shí)不足以用來(lái)包埋體系中的肉桂精油，因此包埋率較低，隨著壁材濃度不斷增加包埋率也逐漸升高。但當(dāng)壁材過(guò)多時(shí)，壁材會(huì)凝聚結(jié)塊，影響微膠囊形成，浪費(fèi)壁材。

圖1 壁芯比對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.4.2 成囊溫度對(duì)包埋率的影響 設(shè)定復(fù)凝聚pH值為3.5、壁芯比為2∶1、反應(yīng)時(shí)間30 min，在不同的成囊溫度（25、35、45、55、65 ℃）下按“2.1”項(xiàng)下方法制備微膠囊，并測(cè)定包埋率，結(jié)果見圖2。隨著成囊溫度的升高，包埋率先升高后降低。成囊溫度在45 ℃時(shí)包埋率（77.02%）達(dá)到最高。當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，包埋率明顯降低。可能溫度過(guò)高使壁材穩(wěn)定性降低，微膠囊容易破碎，從而包埋率降低；但溫度過(guò)低，壁材容易凝固，包埋率也降低。結(jié)果表明，成囊溫度在35～55 ℃范圍包埋率較高。

圖2 成囊溫度對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.4.3 復(fù)凝聚pH值對(duì)包埋率的影響 設(shè)定壁芯比為2∶1、成囊溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min，在不同復(fù)凝聚pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）下按“2.1”項(xiàng)下方法制備微膠囊，并測(cè)定包埋率，結(jié)果見圖3。復(fù)凝聚pH值為4.0時(shí)包埋率（81.87%）達(dá)到最高。因?yàn)榘⒗z在水中溶解帶負(fù)電，呈弱酸性。明膠屬于兩性高分子材料，當(dāng)pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，明膠分子電離帶正電，與帶負(fù)電荷的阿拉伯膠相互凝聚，形成微膠囊。pH高于4.0時(shí)，明膠分子所帶正電荷減少，因此微膠囊包埋率明顯降低。故復(fù)凝聚pH值在3.5～4.5時(shí)包埋率較高。

圖3 復(fù)凝聚pH 值對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)包埋率的影響 設(shè)定復(fù)凝聚pH值為3.5、壁芯比為2∶1、成囊溫度40 ℃，在不同反應(yīng)時(shí)間（15、30、45、60、75 min）下按“2.1”項(xiàng)下方法制備微膠囊，并測(cè)定包埋率，結(jié)果見圖4。在15～30 min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微膠囊包埋率呈上升趨勢(shì)，在30 min時(shí)包埋率最大，為80.0%，當(dāng)時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，微膠囊包埋率并沒有增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到75 min時(shí)，可能因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，已形成微膠囊粘連聚集，導(dǎo)致囊壁破裂，包埋率稍微降低。故反應(yīng)時(shí)間固定30 min為宜。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取壁芯比（A）、成囊溫度（B）、復(fù)凝聚pH值（C）3個(gè)對(duì)包埋率有顯著影響的因素為自變量，分別對(duì)以上因素進(jìn)行編碼，并以微膠囊包埋率（Y）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化工藝。因素和水平取值見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 模型擬合及顯著性檢驗(yàn) 用Design-Expert8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素經(jīng)過(guò)回歸擬合后，得到回歸方程Y=83.56+0.76A+1.84B+1.39C-0.52AB+0.065AC+1.37BC-3.15A2-3.25B2-2.81C2（R2=0.989 3），方差分析見表3。模型的顯著水平（Prob＞F）明顯小于0.05，方程的失擬項(xiàng)P值為0.073 8，表明模型擬合度良好。A、B、C、BC、A2、B2、C2為作用顯著的影響因素，各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。在各因素中，對(duì)包埋率影響由大到小的排列順序依次為成囊溫度、復(fù)凝聚pH值、壁芯比。

表3 方差分析表

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證 響應(yīng)面交互作用圖見圖5。3D曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線的形狀可以直觀反映兩自變量之間交互作用的顯著性。圖5顯示壁芯比與成囊溫度兩者之間的交互作用較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，對(duì)應(yīng)等高線呈橢圓形，沿溫度方向變化較快。在試驗(yàn)水平下，成囊溫度對(duì)包埋率的影響比壁芯比顯著。而壁芯比和復(fù)凝聚pH值及成囊溫度和復(fù)凝聚pH值兩兩之間的交互作用不明顯，等高線近似圓形。對(duì)模型方程求一階偏導(dǎo)，得出模型的極值點(diǎn)，得到最佳制備條件為壁芯比2.1∶1、成囊溫度48.5 ℃、復(fù)凝聚pH值4.2，在此條件下微膠囊包埋率的預(yù)測(cè)值為84.15%。采用上述條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際包埋率平均值為83.55%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)99.29%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的肉桂精油微膠囊制備工藝合理可行。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面分析圖

2.6 微膠囊的紅外光譜分析 使用KBr壓片法進(jìn)行試驗(yàn)，將明膠、阿拉伯膠、肉桂精油、肉桂精油微膠囊分別與溴化鉀混合并充分研磨后進(jìn)行壓片，紅外掃描分析[15]，波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2 cm-1，結(jié)果見圖6。肉桂精油中含有肉桂醛、丁香酚等成分，具有-CHO和苯環(huán)等基團(tuán)，在2 816.25、1 678.89、1 626.20、1 449.95 cm-1處存在較強(qiáng)的醛基和苯基的特征吸收峰（圖6D）。肉桂精油微膠囊的紅外圖譜（圖6C），可以看作是阿拉伯膠和明膠紅外圖譜的疊加，并且保留了肉桂精油的特征吸收峰1 681.36、1 450.42 cm-1，其中在3 300～3 500 cm-1內(nèi)肉桂精油微膠囊對(duì)應(yīng)峰的最高點(diǎn)是3 349.89 cm-1，說(shuō)明明膠酰胺基團(tuán)與阿拉伯膠中多糖攜帶的羥基形成氫鍵，從而使得C-O的伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)移動(dòng)。

圖6 紅外圖譜

2.7 微膠囊顯微形態(tài)觀察 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后得到最佳制備條件下制備肉桂精油微膠囊，將肉桂精油濕微膠囊乳濁液直接滴在載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，并拍攝照片和測(cè)量粒徑。通過(guò)顯微鏡觀察可見球形微膠囊。粒徑為20～30 μm。（見圖7）

圖7 微膠囊顯微圖（×40）

2.8 微膠囊緩釋性考察 分別稱取干燥后的肉桂精油微膠囊和肉桂精油各0.5 g若干份置于玻璃平皿中，放置在80 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中模擬釋放[16]，每隔一段時(shí)間后測(cè)定肉桂精油微膠囊中肉桂精油的含量和稱定對(duì)照組肉桂精油的質(zhì)量，計(jì)算肉桂精油的釋放率，以橫坐標(biāo)為釋放時(shí)間，縱坐標(biāo)為釋放率，繪制釋放曲線，結(jié)果見圖8。隨著加熱時(shí)間的增加，肉桂精油和肉桂精油微膠囊均有部分精油揮發(fā)釋放，但兩者的釋放率相差較大，在加熱10 h時(shí)，肉桂精油的釋放率達(dá)到75.87%，而肉桂精油微膠囊的釋放率僅為25.02%，明顯低于肉桂精油的釋放率。由此可見，肉桂精油微膠囊化可以明顯降低精油的釋放速度，有利于肉桂精油持久長(zhǎng)效地發(fā)揮其功效。

圖8 微膠囊化的緩釋效應(yīng)

3 討論

肉桂精油主要由肉桂醛等揮發(fā)性成分組成[17-18]，其在空氣中揮發(fā)性強(qiáng)，不耐光熱，易發(fā)生氧化分解，會(huì)影響使用效果，使其應(yīng)用受到很大制約。微膠囊技術(shù)，即使用天然或人工合成的高分子材料包埋目標(biāo)芯材的一門技術(shù)，可以使芯材不被腐蝕、不失活和抗氧化，增強(qiáng)活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，有效減緩芯材的擴(kuò)散和揮發(fā)[19-21]。借助微膠囊技術(shù)可以有效地控制肉桂精油緩慢釋放，并能解決肉桂精油本身的穩(wěn)定性和活性持久性問(wèn)題。

本研究以明膠與阿拉伯膠為壁材，肉桂精油為芯材，采用復(fù)凝聚法制備肉桂精油微膠囊。通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)微囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的工藝參數(shù)為壁芯比2.1∶1、成囊溫度48.5 ℃、復(fù)凝聚pH值4.2。在此條件下微膠囊包埋率的預(yù)測(cè)值為84.15%，實(shí)測(cè)值為83.55%。驗(yàn)證試驗(yàn)證明工藝合理可行，紅外光譜和顯微觀察證明微膠囊成功制備。緩釋性研究結(jié)果表明，微膠囊化顯著降低了肉桂精油的揮發(fā)釋放速率。本研究使肉桂精油的使用性能得到顯著提高，可為肉桂精油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。