柳蘑的低極性化學(xué)成分研究*

尹昭曄，孔炯煒，喬麗菲，趙婷，劉湘，趙引利

（武安市第一人民醫(yī)院，河北 武安 056300）

柳蘑學(xué)名毛栓菌Trametes hirsute（Wulf.Fr.）Pilat屬于擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科，毛栓菌多生于楊樹和柳樹的活立木、枯立木或伐木樁上，分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、河南、山東、山西、陜西、四川、安徽、江蘇、浙江、廣東、海南、甘肅等地區(qū)[1]。柳蘑是民間習(xí)用的治癬菌類生藥，具有消炎解毒、止癢的功效，用于治療牛皮癬、干癬、風(fēng)癬及神經(jīng)性皮炎，臨床療效良好[2]。柳蘑治療癬癥療效確切，目前已有柳蘑作為藥物活性成分的制劑上市銷售，用于皮膚疾病治療，臨床效果顯著，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，沒有合理質(zhì)控方案。本實(shí)驗(yàn)從上市制劑的制備工藝考慮，重點(diǎn)對其脂溶性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的提取分離，以期獲得其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為該藥物質(zhì)控提供依據(jù)。

1 材料與儀器

毛栓菌為天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)趙揚(yáng)教授鑒定為擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科毛栓菌。電子輟擊離子源-質(zhì)譜聯(lián)法（EI-MS）測定用LC-MS-8080質(zhì)譜儀（日本島津公司），核磁共振（NMR）測定用Bruker ARX300和Bruker AV600核磁共振儀（瑞士Bruker公司），LC-20AP制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），半制備液相所用試劑均為色譜純（美國Fisher公司），柱層析及薄層硅膠為青島海洋化工分廠生產(chǎn)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離 本實(shí)驗(yàn)取預(yù)粉好的毛栓菌藥粉4.0 kg，95%乙醇超聲提取2次，1 h/次，每次溶劑用量均為20倍量（kg/L），合并兩次提取，濾過，60 ℃減壓回收溶劑至乙醇回收完全，得濃縮液；將濃縮液用純化水1∶1稀釋，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，低溫回收溶劑至干，得乙酸乙酯萃取干膏42 g。經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮梯度洗脫，調(diào)節(jié)石油醚∶丙酮體積依次為100∶0、100∶1、100∶2、100∶3、100∶4、100∶6、100：8、100∶12、100∶15、100∶20、100∶30、100∶50、100∶100，然后丙酮、甲醇洗脫，薄層監(jiān)測合并相同流分，回收溶劑，取出100∶1的流分，其余流分留存?zhèn)溆谩Ｊ兔?丙酮為100∶1洗脫液的四至六流分中有大量無色針晶析出，濾過分離晶體與母液，得到混合物618 mg，加甲醇至溶解完全，RP-HPLC進(jìn)樣分析其純度，98%甲醇-水洗脫，203 nm紫外檢測，得到4個(gè)色譜峰（見圖1），換取制備色譜柱SHIM-pack PRC-ODS（20 mm×250 mm，5 μm），二極管陣列檢測器，檢測波長為203 nm，柱溫為室溫，98%甲醇-水洗脫，流速為3 mL/min。逐步加大進(jìn)樣量對4個(gè)色譜峰做分離制備，回收制備液低溫干燥得到4種純品化合物，經(jīng)稱質(zhì)量得到化合物1（72 mg）、化合物2（126 mg）、化合物3（51 mg）和化合物4（82 mg）。

圖1 制備色譜圖的四至六流分

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 經(jīng)EI-MS（m/z）結(jié)合核磁共振圖譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定?；衔?易溶于三氯甲烷，EI-MS測定分子離子峰m/z 394，結(jié)合1H-NMR圖譜，確定該化合物分子式為C28H42O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ5.66（1H，m，olefinic ring H），5.50（1H，m，olefinic ring H），5.39（1H，m，olefinic ring H），5.18（2H，m，H-22，23），3.60（1H，m，H-3），1.23（3H，s，H3-19），1.00（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.90（3H，d，J=7.0Hz，H3-28），0.82（3H，d，J=6.0Hz，H3-26 or 27），0.81（3H，d，J=6.0Hz，H3-26 or 27），0.56（3H，s，H-18）。仔細(xì)分析圖譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)詳細(xì)檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫，與已知化合物文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[3]進(jìn)行比較分析，確定化合物1結(jié)構(gòu)是（22E）-ergosta-5，7，9（11），22-tetraen-3β-ol，即（22E）-麥角甾-5，7，9（11），22-四烯-3β-醇。

化合物2易溶于三氯甲烷，EI-MS測定分子離子峰m/z 396，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR圖譜，確定該化合物分子式為C28H44O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ1.03（3H，d，J=6.9 Hz，H3-21），0.94（3H，S，H3-19），0.91（3H，d，J=6.9Hz，H3-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26 or H3-27），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26 or H3-27），0.63（3H，S，H3-18），5.56（1H，dd，J=2.5，5.7 Hz，H-6），5.38（1H，m，H-7），5.19（2H，m）。13C-NMR（600MHz，CDCl3），δ38.34（C-1），31.95（C-2），70.45（C-3），40.75（C-4），139.75（C-5），119.56（C-6），116.25（C-7），141.36（C-8），46.21（C-9），37.00（C-10），21.08（C-11），39.05（C-12），42.79（C-13），54.53（C-14），22.97（C-15），28.27（C-16），55.69（C-17），12.03（C-18），16.26（C-19），40.42（C-20），21.08（C-21），135.54（C-22），131.94（C-23），42.79（C-24），33.06（C-25），19.93（C-26），19.62（C-27），17.58（C-28）。仔細(xì)分析圖譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)詳細(xì)檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫，與已知化合物文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[4]進(jìn)行比較分析，確定化合物2結(jié)構(gòu)是（24R）-ergosta-5，7，22-trien-3β-ol，即麥角甾醇。

化合物3易溶于三氯甲烷，EI-MS測定分子離子峰m/z 398，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR圖譜，確定該化合物分子式為C28H46O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ5.21-5.17（3H，m，H-7，H-22，H-23），3.57（1H，m，H-3），1.01（3H，d，J=6.6Hz，H3-21），0.91（3H，d，J=6.9 Hz，H3-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.79（3H，s，H3-19），0.54（3H，s，H3-18）。13C-NMR（600 MHz，CDCl3），δ37.34（C-1），29.83（C-2），71.26（C-3），38.18（C-4），40.45（C-5），31.67（C-6），117.66（C-7），139.77（C-8），49.64（C-9），34.42（C-10），21.74（C-11），39.64（C-12），43.50（C-13），55.30（C-14），23.13（C-15），28.32（C-16），56.14（C-17），12.29（C-18），13.25（C-19），40.70（C-20），21.32（C-21），135.87（C-22），132.07（C-23），43.01（C-24），33.29（C-25），17.81（C-26），19.85（C-27），20.16（C-28）。仔細(xì)分析圖譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)詳細(xì)檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫，與已知化合物文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[5-8]進(jìn)行比較分析，確定化合物3結(jié)構(gòu)是（22E，24R）-ergosta-7，22-dien-3β-ol，即（22E，24R）-麥角甾-7，22-二烯-3β-醇。

化合物4易溶于三氯甲烷，EI-MS測定分子離子峰m/z 400，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR圖譜，確定該化合物分子式為C28H48O。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），δ0.92（3H，d，J=6.3 Hz，H3-21），0.79（3H，S，H3-19），0.77（3H，d，J=6.8 Hz，H3-28），0.78（3H，d，J=6.9 Hz，H3-26），0.85（3H，d，J=6.9 Hz，H3-27），0.53（3H，S，H3-18），3.61（1H，m，H-3），5.15（1H，m，H-7）。13C-NMR（600 MHz，CDCl3），δ37.31（C-1），31.64（C-2），71.25（C-3），38.15（C-4），40.42（C-5），29.82（C-6），117.59（C-7），139.81（C-8），49.61（C-9），34.38（C-10），21.72（C-11），39.72（C-12），43.55（C-13），55.20（C-14），23.14（C-15），28.09（C-16），56.17（C-17），12.02（C-18），13.22（C-19），36.80（C-20），19.20（C-21），33.83（C-22），30.86（C-23），39.23（C-24），31.64（C-25），20.71（C-26），17.75（C-27），15.61（C-28）。仔細(xì)分析圖譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)詳細(xì)檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫，與已知化合物文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9-10]進(jìn)行比較分析，確定化合物4結(jié)構(gòu)是（24S）-ergosta-7-en-3β-ol，即（24S）-麥角甾-7-烯-3β-醇。

3 討論

柳蘑主要分布于我國河北省及東三省地區(qū)，其種類繁多，產(chǎn)地不同，品種也有很大差異。本實(shí)驗(yàn)選擇的柳蘑藥材經(jīng)過了趙揚(yáng)教授的鑒定，確定其為擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科毛栓菌。

中藥的傳統(tǒng)提取方法存在諸多缺點(diǎn)，而超聲提取作為一種新興技術(shù)，近來應(yīng)用頗多，與傳統(tǒng)提取方法相比有著顯著的優(yōu)點(diǎn)：（1）常壓萃取，安全性好，操作簡單易行，簡化樣品提取的前處理過程；（2）提取時(shí)間短，加速有效成分溶解；（3）提取溫度低；（4）適應(yīng)性廣；（5）提取藥液雜質(zhì)少，有效成分易于分離、純化[11-14]。柳蘑藥粉顆粒過于細(xì)小，若用傳統(tǒng)回流提取法等提取常會(huì)因藥粉積聚過密甚至結(jié)塊而造成提取困難，提取效率低下，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)超聲提取本身可讓提取液不斷震蕩致松散的特點(diǎn)并借鑒前人實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，綜合二者的利與弊，選擇了超聲提取方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲提取方法是提取柳蘑藥粉行之有效的方法。

柳蘑是民間習(xí)用的治癬菌類生藥，具有消炎解毒，止癢的功效，其油膏劑已收入《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊》，用于治療牛皮癬、干癬、風(fēng)癬及神經(jīng)性皮炎，臨床療效良好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合上市制劑的制備工藝，選擇性地提取脂溶性成分，采用分析型液相色譜檢測完晶體成分后，直接換取半制備型色譜柱以提高柱載樣量，再適當(dāng)加大進(jìn)樣量，快捷地分離獲得足夠的樣品。通過收集同一色譜峰，并回收溶劑得到4個(gè)單體化合物，均為麥角甾類化合物。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR等數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)進(jìn)行對照鑒定了結(jié)構(gòu)，化合物1、2、3、4為首次從該植物中分離得到。麥角甾醇是真菌類的特征甾醇，藥理作用廣泛，近年來有較多研究報(bào)道麥角甾醇及其衍生物具有抗炎活性[15-16]，其主要通過抑制NO產(chǎn)生和抑制細(xì)胞因子釋放，從而達(dá)到抗炎的效果。結(jié)合上市柳蘑軟膏的主治功效，推測麥角甾醇及其衍生物是上市制劑起效成分。