水木和寧方通過調(diào)控泛素-蛋白酶體通路對MPP+誘導(dǎo)帕金森病體外模型細(xì)胞損傷的影響*

張?zhí)扃?，李傳成，邱朝陽，劉萍，翟茜茜，霍?/p>

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.臨沂市中心醫(yī)院，山東 臨沂 276400；3.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261000；4.山東省婦幼保健院，山東 濟(jì)南 250014；5.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是人類第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，目前全球患病人數(shù)已超過600萬，其病理特征包括路易小體和路易神經(jīng)突起形式的神經(jīng)包涵體、黑質(zhì)和其他腦區(qū)的細(xì)胞丟失[1-3]。泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是體內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，功能缺陷時蛋白質(zhì)不能及時降解，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平上升，促使DA神經(jīng)元變性、凋亡，從而導(dǎo)致PD的發(fā)生[4-6]。本病治療以左旋多巴制劑、多巴胺能受體激動劑、抗膽堿能制劑等為主，盡管在一定程度上減輕了癥狀，但仍然無法阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展，且隨著疾病的進(jìn)展，藥物的療效會逐漸減弱[7]。長期使用還可能出現(xiàn)“開關(guān)現(xiàn)象”、“劑末現(xiàn)象”、肌張力運動障礙等運動并發(fā)癥[8]。水木和寧方是霍青經(jīng)過多年的臨床實踐總結(jié)的治療PD的經(jīng)驗方。本課題組前期多項研究表明，本方可有效改善PD患者運動及非運動癥狀，改善患者睡眠情況，提高患者的生活質(zhì)量，具有良好的臨床療效[9-11]。課題組前期動物實驗結(jié)果表明水木和寧方可能通過調(diào)節(jié)UPP功能，促進(jìn)α-syn的降解，從而改善PD小鼠的運動功能[12]。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，從細(xì)胞層面構(gòu)建PD體外細(xì)胞模型，選擇與UPP通路相關(guān)的指標(biāo)，采用Real-time PCR法和Western blotting法進(jìn)行探究，進(jìn)一步驗證水木和寧方調(diào)控蛋白降解通路，保護(hù)多巴胺（dopaminer,DA）能神經(jīng)元的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗細(xì)胞 PC12細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 水木和寧方配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號：21051561），由熟地黃10 g，山茱萸6 g，黃精10 g，牛膝10 g，當(dāng)歸10 g，桃仁10 g，紅花6 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，地龍10 g等藥物組成[10]；美多芭（上海羅氏，批號：SH5198），以上藥物均購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物（MPP+iodide）（美國西格瑪公司，批號：D048）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8180）；胎牛血清（Lonsera，批號：OB08933）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國康寧公司，批號：BIO10040CV）；BCA試劑盒（批號：P0012S）、ECL化學(xué)發(fā)光液（批號：P0018S）、SDS-PAGE試劑盒（批號：P0690）均購自上海碧云天技術(shù)有限公司；TH抗體（批號：ab112）、UCH-L1抗體（批號：ab8189）、ubiquitin抗體（批號：ab7780）、Parkin抗體（批號：ab77924）、α-syn抗體（批號：ab52168）、UBE1抗體（批號：ab181225）均購自Abcam公司；beta-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：20536-1-AP）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號：7074）、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（批號：7076）均購自CST公司；RNA快速提取試劑盒（思科捷生物，批號：AC0202）；反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒（批號：AG11706）、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（批號：AG11701）、PCR引物均購自艾科瑞生物。

1.3 主要儀器 Multiskan Go1510型酶標(biāo)儀、NanoDrop2000型微量紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；Light Cycler 480 Ⅱ型實時熒光定量PCR儀（美國羅氏集團(tuán)）；Mini-Protean Tetra電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；Fluor Chem Q成像和分析系統(tǒng)（美國Protein simple公司）；Axiovert 40型倒置相差顯微鏡（德國卡爾蔡司）。

2 方法

2.1 水木和寧方的配制 在傳統(tǒng)煎煮方法的基礎(chǔ)上，參考現(xiàn)代離體實驗中藥提取方法[13]。計算水木和寧方顆粒各味中藥總和為300 g，將中藥溶解于180 mL高壓滅菌的ddH2O中，使用水浴鍋進(jìn)行加熱，最終配制成質(zhì)量濃度為2 g/mL的中藥母液。將中藥母液分裝后，以5 000 r/min離心10 min，經(jīng)過多次離心后，取上清液，0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾除菌，分裝避光儲存于-80 ℃冰箱中，現(xiàn)取現(xiàn)用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素），37 ℃、5% CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長融合至80%以上時，消化傳代，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 PD體外細(xì)胞模型建立 MPP+不僅能夠損害DA能神經(jīng)元，產(chǎn)生PD樣癥狀，還能在體外實驗中誘導(dǎo)α-syn的過表達(dá)和聚集，因此本實驗選用MPP+誘導(dǎo)PD模型[14-15]。實驗設(shè)6個復(fù)孔，每孔100 μL，設(shè)置空白對照組、對照組、實驗組（MPP+）。實驗組分為0.25、0.5、1、2 mmol/L共4個濃度，空白對照組和對照組棄原液，加入1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用MTT法篩選MPP+的最佳濃度。選用MPP+最佳濃度作用于細(xì)胞，孵育24 h，觀察造模情況。

2.4 水木和寧方和美多芭藥物最佳濃度篩選 篩選水木和寧方最佳濃度時，分為空白對照組、對照組、實驗組（水木和寧方）。實驗組分為0.5、1、2、4、6、8、10、12 mg/mL共8個質(zhì)量濃度，空白對照組和對照組棄原液，加入1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用MTT法篩選最佳濃度。美多芭藥物最佳濃度的篩選方法同水木和寧方，藥物質(zhì)量濃度分別設(shè)置為25、12.5、6.25、3.125 l、1.5625μg/mL。

2.5 細(xì)胞分組及處理 實驗分為對照組、模型組、水木和寧方組、美多芭組，干預(yù)一定時間后，收取細(xì)胞上清，凍存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)進(jìn)行Real-time PCR和Western blotting檢測。

2.6 水木和寧方對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置于倒置顯微鏡下觀察，詳細(xì)記錄各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并拍照分析。

2.7 水木和寧方對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響 采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，將細(xì)胞稀釋成濃度為1×105個／mL的懸液，每孔取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)實驗分組的不同進(jìn)行干預(yù)，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h后加入200 μL MTT溶液（5 mg/mL）。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度值，并計算細(xì)胞存活率。

2.8 Real-time PCR法檢測泛素化相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說明提取總RNA，測定RNA濃度。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃5 s，65 ℃60 s；降溫50 ℃30 s。每個實驗指標(biāo)重復(fù)檢測3次取其平均值，計算采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 α-syn、TH、泛素化相關(guān)基因引物序列

2.9 Western blotting法檢測泛素化相關(guān)蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清收集總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃一抗（β-actin 1∶5 000，Ubiquitin 1∶1 000，α-syn 1∶500，UCH-L1 1∶400，Parkin 1∶400，TH 1∶400，E1 1∶1 000）孵育過夜。次日TBST洗膜15 min×3次，加入二抗（羊抗兔1∶5 000，羊抗小鼠1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次。最后通過化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MPP+最佳造模濃度篩選 隨著MPP+濃度的升高，OD值逐漸下降，MPP+濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L時，OD值分別為1.233±0.012、1.116±0.008、0.867±0.018、0.660±0.011、0.403±0.014，細(xì)胞存活率依次為為100.00%、92.46%、70.29%、53.53%、37.71%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)1 mmol/L MPP+作用于PC12細(xì)胞時，細(xì)胞存活率為53.53%，接近于IC50值，對細(xì)胞的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），故本實驗選擇1 mmol/L作為MPP+最佳造模濃度。（見圖1）

圖1 MPP+對PC12 細(xì)胞存活率的影響（，n=3）

3.2 水木和寧方和美多芭藥物最佳濃度選擇 隨著水木和寧方濃度的升高，PC12細(xì)胞的活力呈下降趨勢，當(dāng)水木和寧方質(zhì)量濃度大于6 mg/mL時，細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），故選擇6 mg/mL作為水木和寧方最佳干預(yù)濃度。隨著美多芭濃度的升高，細(xì)胞存活率呈下降趨勢，當(dāng)美多芭質(zhì)量濃度大于3.125 μg/mL，細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），因此本實驗選擇3.125 μg/mL作為美多芭最佳干預(yù)濃度。（見圖2）

圖2 水木和寧方和美多芭對PC12 細(xì)胞存活率的影響（，n=3）

3.3 各組PC12細(xì)胞存活率比較 與對照組比較，模型組PC12細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05），且水木和寧方組PC12細(xì)胞存活率明顯高于美多芭組（P＜0.05），進(jìn)一步說明水木和寧方和美多芭對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠提高PC12細(xì)胞存活率，且水木和寧方對細(xì)胞保護(hù)作用優(yōu)于美多芭。（見圖3）

圖3 各組PC12 細(xì)胞存活率比較（，n=3）

3.4 各組PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 對照組PC12細(xì)胞呈長梭形或者多角形貼壁生長，折光性能良好，有類似神經(jīng)細(xì)胞的突起；模型組PC12細(xì)胞呈圓形，折光性變差，間隙變大，懸浮細(xì)胞數(shù)目增多，突觸數(shù)目減少；水木和寧方組和美多芭組PC12細(xì)胞的形態(tài)、折光性、細(xì)胞間隙、突觸數(shù)目均優(yōu)于模型組，由此可見水木和寧方和美多芭對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷具有一定保護(hù)作用。（見圖4）

圖4 各組PC12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（×10）

3.5 各組PC12細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組PC12細(xì)胞α-syn mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細(xì)胞α-syn mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與美多芭組比較，水木和寧方組PC12細(xì)胞α-syn mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05），TH mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組PC12 細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平比較（，n=3）

表2 各組PC12 細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平比較（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與美多芭組比較，cP＜0.05

3.6 各組PC12細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組PC12細(xì)胞α-syn蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細(xì)胞α-syn蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與美多芭組比較，水木和寧方組PC12細(xì)胞α-syn蛋白明顯下調(diào)（P＜0.05），TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。（見圖5、表3）

圖5 各組PC12 細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)Westem blotting圖

表3 各組PC12 細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)比較（，n=3）

表3 各組PC12 細(xì)胞α-syn、TH、泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)比較（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與美多芭組比較，cP＜0.05

4 討論

UPP是體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，是保護(hù)細(xì)胞免受錯誤折疊蛋白質(zhì)毒性作用的重要的機(jī)制之一，多項研究結(jié)果表明UPP與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[16]。UPP通過泛素、泛素相關(guān)酶、蛋白酶體等調(diào)控特定蛋白的降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、免疫及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[17]。氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞老化可導(dǎo)致蛋白錯誤折疊，導(dǎo)致?lián)p害蛋白的積聚。當(dāng)損害蛋白異常聚集超過了UPP的降解能力時，可導(dǎo)致泛素化損害蛋白的積聚，進(jìn)而影響神經(jīng)元功能障礙甚至死亡[18-19]。越來越多的遺傳、病理和實驗證據(jù)表明，家族性和散發(fā)性帕金森病的神經(jīng)變性可能與UPP清除蛋白質(zhì)缺陷有關(guān)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)積累、聚集和細(xì)胞毒性[20]。

UPP在PD的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，尤其是清除Lewy小體內(nèi)積聚的α-syn、Parkin蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)α-syn、Parkin和UCH-L1是3種與UPP功能障礙密切相關(guān)的突變基因[21]。其中α-syn是UPP主要底物蛋白，大量聚集會導(dǎo)致線粒體損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。在氧化應(yīng)激、環(huán)境毒性損害或老化等外部因素作用下，α-syn的異常積聚通過刺激免疫反應(yīng)、影響自噬、破壞DA的存儲與釋放等，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。UCH-L1具有泛素水解酶、連接酶活性，能維持泛素單體穩(wěn)定，對神經(jīng)元具有抗氧化保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1與α-syn共聚集，其家族突變與帕金森病和其他神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[23]。UCH-L1的某些翻譯后修飾可能促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的UCH-L1（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟は嚓P(guān)的UCH-L1（M）形式，在α-突觸核蛋白病的形成中發(fā)揮了作用[24]。Parkin作為E3泛素連接酶，能參與細(xì)胞周期調(diào)控、線粒體動態(tài)平衡和能量代謝，調(diào)節(jié)泛素化過程及細(xì)胞自噬，在蛋白質(zhì)分解代謝中發(fā)揮著重要作用，這些或許都作為Parkin預(yù)防PD的基礎(chǔ)[25]。研究表明，TH是催化生物體自身合成左旋多巴胺系列反應(yīng)中第一步反應(yīng)的限速酶，在DA合成中發(fā)揮重要作用，其含量變化與PD的發(fā)生、發(fā)展有著重要聯(lián)系[26]。

本研究從細(xì)胞層面驗證水木和寧方通過調(diào)節(jié)UPP功能對PD的影響，并采用MPP+誘導(dǎo)PD體外細(xì)胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)造模后UPP功能異常，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，α-Syn蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高，考慮可能是MPP+抑制了UPP中蛋白酶體的功能，抑制了蛋白降解通路。水木和寧方干預(yù)后，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白表達(dá)明顯升高，α-Syn蛋白表達(dá)明顯降低，提示水木和寧方可促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，改善UPP功能。與美多芭組比較，水木和寧方組α-syn蛋白明顯降低，TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達(dá)明顯升高。本實驗結(jié)果與本課題組前期動物實驗結(jié)果一致，由此可見水木和寧方可以通過調(diào)控UPP功能，抑制α-Syn蛋白的聚集，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，具有良好的保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用。

水木和寧方由生地黃、肉蓯蓉、狗脊、麥冬等31味藥物組成[10]。研究表明生地黃主要是通過豆甾醇作用于MAOA、ADRA1B、ADRA1A等靶點，從多個途徑發(fā)揮治療帕金森病的作用[27]?，F(xiàn)代藥理研究也表明方中多種成分，如肉蓯蓉多糖、遠(yuǎn)志皂苷、牛膝多肽等可以抑制神經(jīng)元凋亡，抗氧化應(yīng)激損傷，具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用[28-31]。鑒于帕金森病發(fā)病時間長，“久病入絡(luò)，久病及腎”及結(jié)合自身臨床經(jīng)驗，霍青提出了帕金森病以“肝腎虧虛為本，痰濁瘀血為發(fā)病之標(biāo)”的發(fā)病機(jī)制，并制定了滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、祛瘀化痰的治療方法，同時應(yīng)治標(biāo)與治本相結(jié)合，靈活應(yīng)用，充分發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點、整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢。本研究在前期動物實驗的基礎(chǔ)上，從細(xì)胞層面證實水木和寧方能通過提高UPP活性，清除異常蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，從而減輕DA能神經(jīng)元細(xì)胞損傷，為水木和寧方治療PD提供了理論依據(jù)和實驗支持，也為PD中西醫(yī)結(jié)合治療提供了新思路。