超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)婦康寶口服液中阿膠皮源成分的鑒別

張玉婷，曲 佳，周 軍，吳 燕

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

婦康寶口服液屬于中成藥，非國(guó)家基本藥物，為一類非處方藥，出自東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景《金匱要略方論》卷下的經(jīng)典名方“芎歸膠艾湯”，按藥味處方量由熟地黃（173 g）、白芍（139 g）、阿膠（104 g）、當(dāng)歸（104 g）、川芎（69 g）、艾葉（69 g）、甘草（69 g）共7味藥組成。方中阿膠成分具有補(bǔ)血滋陰、安胎止血的功效，與有溫經(jīng)止血、安胎止痛作用的艾葉共為君藥，是處方中的關(guān)鍵藥味組成之一。婦康寶口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)早期收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十一冊(cè)》（WS3-B-2139-96），后續(xù)經(jīng)不斷修訂完善為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-2139-96-5），主要通過(guò)采用薄層色譜法鑒別阿魏酸、芍藥苷、熟地黃及甘草成分，檢查總氮量、相對(duì)密度、pH值、裝量及微生物限度等來(lái)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定樣品中芍藥苷、阿魏酸含量來(lái)作為質(zhì)控指標(biāo)［1-2］。經(jīng)調(diào)研，各廠家在生產(chǎn)工藝方面均略有不同，企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及限度要求也存在差異。實(shí)驗(yàn)室前期參照《中國(guó)藥典》（2015年版）一部阿膠項(xiàng)下檢查方法，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)婦康寶口服液中的阿膠成分進(jìn)行了鑒別［3］，發(fā)現(xiàn)市售該產(chǎn)品中的阿膠成分存在摻假摻雜情況，部分產(chǎn)品未檢出阿膠成分。為進(jìn)一步探索鑒別阿膠成分可能摻假摻雜的皮源種類、完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及為市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐，本文建立了婦康寶口服液中阿膠成分及馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等非驢皮源成分的超高效液相色譜-質(zhì)譜鑒別法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1290-6470高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；MillAdvantage A10純化水裝置（法國(guó)Millipore公司）；METTLER TOLEDO XS205DU電子天平（METTLER公司），AS20500AD超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），ADP310C真空干燥箱（重慶雅馬拓科技有限公司），Vorter-Genie2振蕩器（美國(guó)科學(xué)儀器公司）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（LC-MS級(jí)，TCI公司）；碳酸氫銨（純度：99.995%，麥克林公司）；胰蛋白酶（貨號(hào)T1426-100 mg，Sigma公司）；水為Milli-Q超純水。阿膠對(duì)照藥材（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121274-201703，供鑒別、檢查用）。馬源寡肽A（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)112035-201701，純度：96.0%），牛皮特征肽A（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111941-201804，純度：93.8%），新阿膠（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121745-201701，供薄層鑒別用），羊特征肽（購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物有限公司，批號(hào)2019-07-15，純度：98.34%），駱駝特征肽（購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物有限公司，批號(hào)2019-07-15，純度：98.83%），鹿特征肽（購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物有限公司，批號(hào)2019-07-15，純度：98.17%）。婦康寶口服液樣品為2019年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，由全國(guó)21個(gè)省、自治區(qū)和直轄市抽取，涉及5家生產(chǎn)企業(yè)（不同企業(yè)名稱以字母代號(hào)表示），共計(jì)61批；陰性樣品為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，按以下程序進(jìn)行梯度洗脫：0~25 min，5%A→20%A；25~40 min，20%A→50%A；流速：0.3 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：AJS-ESI，正離子掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源電壓：3.5 kV；干燥氣流量：8 L/min；干燥氣溫度：300℃；鞘氣流量：11 L/min；鞘氣溫度：350℃；霧化氣壓力：310 275 Pa；碰撞氣：氮?dú)?。特征肽監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碎裂電壓及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 特征肽監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碎裂電壓及碰撞能量

2.2 溶液的制備

2.2.1 阿膠對(duì)照藥材溶液的制備 取阿膠對(duì)照藥材0.1 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 ml，超聲提取30 min，放至室溫，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液100 μl，置于2 ml微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，用1%碳酸氫銨溶液制成每1 ml中含1 mg的溶液，臨用前新制）10 μl，搖勻，置烘箱中37℃恒溫酶解12 h，渦旋振蕩混勻，即得。

2.2.2 其他皮源對(duì)照品溶液的制備 取馬源寡肽A、牛皮特征肽A、羊特征肽、駱駝特征肽及鹿特征肽對(duì)照品適量，精密稱定，分別置50 ml量瓶中，加阿膠基質(zhì)溶液（取阿膠對(duì)照藥材粉末0.1 g，置50 ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 ml，超聲提取30 min，放至室溫，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）制成每1 ml含0.2 μg特征肽的對(duì)照品溶液。另取新阿膠對(duì)照藥材0.1 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 ml，超聲提取30 min，使樣品完全溶解，放至室溫，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 ml置100 ml量瓶中，加入阿膠對(duì)照藥材粉末0.2 g，加1%碳酸氫銨溶液80 ml，超聲提取30 min，使樣品完全溶解，放至室溫，再加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)”起，照阿膠對(duì)照藥材溶液的制備方法同法操作，即得。

2.2.3 樣品溶液的制備 取樣品充分搖勻，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)”起，照阿膠對(duì)照藥材溶液的制備方法同法操作，即得。同法制備陰性樣品溶液。

2.3 鑒別試驗(yàn)專屬性 在給定儀器條件下，取上述各皮源特征肽對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性樣品色譜圖無(wú)明顯色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。另外，不同皮源特征肽相互之間也無(wú)干擾，說(shuō)明該方法專屬性較好。各對(duì)照品、樣品和陰性樣品的總離子流圖（TIC）及提取的MRM圖見(jiàn)圖1。

圖1 阿膠對(duì)照藥材（A）其他皮源對(duì)照品（B～G）陰性樣品（H）和5個(gè)廠家問(wèn)題樣品（I～M）的TIC及MRM色譜圖

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果 依法對(duì)5個(gè)廠家的61批樣品進(jìn)行阿膠皮源成分的鑒別分析，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，5個(gè)廠家的產(chǎn)品均不同程度地存在阿膠成分摻假摻雜的情況，不合格率為45.5%~100%，品種整體質(zhì)量較差。SH廠家產(chǎn)品未檢出阿膠及其他皮源成分，可能存在阿膠藥味未投料的情況。其余4個(gè)廠家均檢出含有阿膠成分，但同時(shí)不同程度地檢出含有馬皮源或豬皮源成分，分析原因可能是生產(chǎn)企業(yè)為降低成本，部分摻用馬皮、騾子皮或豬皮等雜皮膠代替阿膠投料。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 整體質(zhì)量不佳原因分析 根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站國(guó)產(chǎn)藥品的查詢結(jié)果，目前全國(guó)共有婦康寶口服液生產(chǎn)企業(yè)22家，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)該品種生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)研情況，分析認(rèn)為不同廠家工藝流程存在差異、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、質(zhì)控指標(biāo)不完善，可能是導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、整體質(zhì)量不理想的主要原因。

3.2 后續(xù)試驗(yàn)思路討論 本文建立了婦康寶口服液中阿膠皮源成分的超高效液相色譜-質(zhì)譜鑒別方法，可篩查產(chǎn)品中是否含有阿膠成分，以及可能摻雜馬皮、牛皮、豬皮、羊皮、駱駝皮、鹿皮等雜皮膠的情況。方法專屬性較強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單。存在的不足之處是，可以篩查的皮源成分仍有限，后續(xù)可以考慮通過(guò)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)及質(zhì)譜搜庫(kù)技術(shù)，增加篩查范圍，提高篩查效率。同時(shí)，為考查阿膠成分是否足量投料，可對(duì)驢源多肽A1、A2進(jìn)行含量測(cè)定來(lái)表征阿膠含量，并結(jié)合處方量及生產(chǎn)工藝設(shè)置合理限度。此外，為避免結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，可采用道地藥材嚴(yán)格按產(chǎn)品生產(chǎn)工藝制備標(biāo)準(zhǔn)制劑同步進(jìn)行試驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整前處理及試驗(yàn)條件，進(jìn)一步提高方法的專屬性及準(zhǔn)確率。

3.3 全面質(zhì)量評(píng)價(jià)展望 試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同廠家的婦康寶口服液中的阿膠成分均存在不同程度摻入雜皮膠的情況，有必要對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善，增加阿膠成分的控制指標(biāo)，從而保障產(chǎn)品質(zhì)量和療效。另外，阿膠只是婦康寶口服液藥味組成的其中一個(gè)組分，單從阿膠成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)還不足以說(shuō)明該品種的整體質(zhì)量狀況以及對(duì)不同廠家的產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量區(qū)分，后續(xù)可增加其他有效性組分的含量測(cè)定，并考查防腐劑、色素、金屬元素、農(nóng)藥殘留等安全性指標(biāo)，通過(guò)主成分分析法（PCA）來(lái)分析不同廠家產(chǎn)品的化學(xué)成分及造成不同廠家產(chǎn)品質(zhì)量差異的特征性組分，從而可對(duì)該品種產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行全面分析評(píng)價(jià)。