黃芪多糖對Lewis荷瘤小鼠PD-1/PD-L1表達的影響

李津津，楊金穎，孫芳芳，王 麗

（1.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

肺癌是全球最常見的癌癥，近年來發(fā)病率逐漸上升，每年有超過180萬人死于該種疾病，已經(jīng)成為發(fā)病率增長最快、死亡率最高的腫瘤之一［1］。據(jù)統(tǒng)計，男性和女性肺癌患者的平均死亡率分別為27%和26%［2］。目前，手術、放療、化療是肺癌的主要治療手段，然而這些療法有許多副作用，且耐受性差［3］，因此開發(fā)新的藥物逐漸成為研究熱點。

肺癌高度依賴免疫，其發(fā)生發(fā)展與患者的免疫功能密切相關［4］。已有研究表明，免疫檢查點抑制劑為首的免疫治療可顯著延長患者生存周期，降低死亡及復發(fā)風險，尤其是針對PD-1及其配體PD-L1這一對免疫檢查點抑制取得了良好的效果［5］。PD-1與其在活化的腫瘤細胞上的配體PD-L1結合，抑制T細胞增殖及IFN-γ，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-2的產(chǎn)生，從而獲得免疫逃逸［6］。免疫檢查點抑制劑通過阻斷PD-1與PD-L1結合，重新激活T細胞的免疫應答來消除腫瘤，進而治療多種癌癥［7］。黃芪多糖是黃芪的主要成分，具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種藥理功效［8-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可增強細胞的免疫功能、減輕放化療毒副反應、改善肺癌患者的生活質(zhì)量，因此，在肺癌的治療中應用廣泛［11-13］。然而黃芪多糖治療肺癌的具體機制仍需驗證。本研究采用Lewis荷瘤小鼠為模型，觀察黃芪多糖在荷瘤小鼠體內(nèi)的作用，并從調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1共刺激分子表達角度對黃芪多糖抗腫瘤機制進行初步探討，為臨床運用并推廣黃芪多糖治療肺癌提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 黃芪多糖（天津賽諾制藥有限公司，批號200907），給藥前新鮮配制；紅細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；CD3+、CD4+、CD8+抗體（abcam公司）；IFN-γ、IL-2 ELISA試劑盒（藍基因生物科技有限公司）；PD-1抗體（proteintech公司）；PD-L1抗體（abcam公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)Lewis小鼠肺癌細胞珠（中國科學院上海生命科學研究院），復蘇時取液氮保存的Lewis細胞37℃水浴融化，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素）。1 000 r/min離心5 min，去上清液。沉淀的細胞用完全培養(yǎng)液重新懸浮，接種于T25培養(yǎng)瓶。細胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，24 h換液1次，細胞密度達到80%左右融合時，用胰酶消化進行傳代。取對數(shù)生長期細胞用于造模。

1.3 肺癌小鼠模型的建立 選取雄性C57BL/6小鼠，體重（20±2）g［北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證編號為SYXK（津）2019-0002］。動物級別：SPF級別，室溫（22±2）℃，給予無菌飼料及無菌水。收集對數(shù)生長期的Lewis細胞，加生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1.0×107/ml。用75%酒精消毒小鼠右側前肢腋下皮膚，用1 ml注射器抽取細胞懸液接種于小鼠右前肢腋下，每只0.2 ml，接種后7 d左右成瘤。

1.4 實驗分組及給藥方案 將40只小鼠隨機分為四組：模型組、陽性藥組、黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組，每組10只。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，各組建立肺癌小鼠模型。接種后7 d后，模型組每日腹腔注射氯化鈉注射液0.2 ml；陽性對照組小鼠隔日腹腔注射順鉑2 mg/kg；黃芪多糖低劑量組每日灌胃黃芪多糖200 mg/kg；黃芪多糖高劑量組每日灌胃黃芪多糖400 mg/kg，各組連續(xù)給藥14 d。其中，黃芪多糖給藥劑量根據(jù)人每日給藥劑量經(jīng)動物給藥劑量換算公式計算得到，低劑量組為人等效劑量。

1.5 抗腫瘤作用指標監(jiān)測 末次給藥結束后24 h，記錄小鼠體重、脾、胸腺和皮下腫瘤組織重量，計算抑瘤率、脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積（mm3）=長徑（mm）×短徑（mm）2/2；抑瘤率計算公式：抑瘤率=（模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.6 檢測外周血中T細胞數(shù)量 造模給藥結束后，收集小鼠外周血，紅細胞裂解液去除紅細胞，流式細胞儀檢測外周血細胞中CD4+T細胞（CD3+CD4+）、CD8+T細胞（CD3+CD8+）百分比。所有流式細胞術結果采用FlowJo軟件進行分析。

1.7 ELISA造模給藥結束后，將小鼠麻醉后進行目內(nèi)眥取血，室溫靜置1 h后使用高速低溫離心機，4℃3 000 r/min，離心10 min，移液器取上清分裝至2 ml EP管中存入，80℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書進行IFN-γ、IL-2指標檢測。

1.8 Western blot造模給藥結束后，剖取脾組織和腫瘤組織各20 mg，分別加入200 μl裂解液。裂解后離心留取上清，測定總蛋白濃度。蛋白變性后取30 μg樣品，進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，脾組織加入一抗PD-1（1∶500），腫瘤組織加入一抗PD-L1（1∶1000）。4℃孵育過夜后，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，顯色，成像，Image-J軟件分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學處理 實驗結果采用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪多糖抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤增殖 通過建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，并腹腔注射不同劑量的黃芪多糖。結果顯示黃芪多糖低劑量組抑瘤率為41.29%，黃芪多糖高劑量組抑瘤率為61.20%。黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組均可顯著增加肺癌小鼠脾指數(shù)（P＜0.05）。黃芪多糖低劑量組可增加肺癌小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組可顯著增加肺癌小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠抑瘤率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（±s，n=10）

表1 各組小鼠抑瘤率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（±s，n=10）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 抑瘤率（%） 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)模型組 0 4.33±0.81 1.87±0.29陽性藥組 42.81 4.44±1.21 1.97±0.05黃芪多糖低劑量組 14.58 5.26±1.07* 2.25±0.43*黃芪多糖高劑量組 30.70 5.37±1.32* 2.28±0.31**

2.2 黃芪多糖可增加CD4+T細胞比率及CD4+/CD8+T細胞比率 流式結果顯示，黃芪多糖可顯著增加CD4+T細胞（CD3+CD4+）比率及CD4+/CD8+T細胞（CD3+CD4+/CD3+CD8+）比率（P＜0.01），見表2。

表2 黃芪多糖對肺癌小鼠外周血中淋巴細胞比率的影響（±s，n=3）

表2 黃芪多糖對肺癌小鼠外周血中淋巴細胞比率的影響（±s，n=3）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 CD3+CD4+/CD3+ CD3+CD8+/CD3+CD3+CD4+/CD3+CD8+UL-%Gated LR-%Gated模型組 43.33±0.43 30.93±1.23 1.43±0.07黃芪多糖低劑量組 54.78±0.66** 26.80±0.65** 2.05±0.07**黃芪多糖高劑量組 65.90±0.66** 35.12±1.59* 2.10±0.07**

2.3 ELISA測定結果 造模給藥結束后，與模型組比較，黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組均可顯著升高血清中IFN-γ含量（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖低劑量組可升高血清中IL-2含量（P＜0.05），黃芪多糖高劑量組顯著升高血清中IL-2含量（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2含量

2.4 Western blot結果 造模給藥結束后，與模型組比較，陽性藥組可降低脾組織中PD-1表達量（P＜0.05）、黃芪多糖高劑量組可顯著降低脾組織中PD-1表達量（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和黃芪多糖高劑量組均可顯著降低腫瘤組織中PD-L1表達量（P＜0.01）。見圖2-3。

圖2 各組小鼠PD1、PDL1蛋白免疫印跡

圖3 各組小鼠PD1、PDL1蛋白免疫量化

3 討論

肺癌是最普遍的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率快速增長，嚴重危害人類健康［1］。盡管近年來醫(yī)療技術突飛猛進，但肺癌的預后仍不容樂觀，總體5年生存率不足15%［14］。因此，尋找能有效治療肺癌的藥物迫在眉睫。隨著腫瘤免疫微環(huán)境研究的發(fā)展，免疫療法已被列為癌癥的重要治療手段之一，改善腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)也是肺癌防治的關鍵［15］。其中，免疫檢查點抑制劑作為一種新型的抗腫瘤療法，利用機體自身的免疫系統(tǒng)發(fā)揮殺傷腫瘤，其最大優(yōu)勢是產(chǎn)生持久應答，可有效提高腫瘤患者生存率，在腫瘤治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。腫瘤細胞可以通過程序性細胞死亡蛋白1及其配體PD1/PDL1逃避T細胞免疫監(jiān)視，因此針對PD1/PDL1免疫檢查點通路已成為惡性腫瘤的重要治療策略［16］。針對免疫檢查點PD1/PDL1的抑制劑（包括nivolumab和pembrolizumab）已在肺癌臨床治療中取得了突破性的進展［17-18］。

黃芪多糖（APS）是黃芪中含量最多且活性最強的成分，有體內(nèi)抗癌活性和增強免疫反應的特性［19］。黃芪多糖在腫瘤的治療中應用廣泛，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用，能夠顯著增強腫瘤免疫功能［20-22］。其抗腫瘤作用主要有三個方面：抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡、調(diào)控腫瘤細胞周期生長和免疫調(diào)節(jié)作用［23-26］。臨床研究上，黃芪多糖能增強宿主抗腫瘤免疫機能，進而抑制體內(nèi)腫瘤細胞的生長，并可在臨床治療中可減輕放、化療強烈的毒副反應［27］。黃芪多糖在肺癌的治療上也表現(xiàn)突出，中晚期肺癌患者受限于年齡、體質(zhì)等因素，對常規(guī)的放療、化療副反應大，同時，由于肺癌細胞對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，這也限制了常規(guī)治療手段的效果［28］。黃芪多糖可以改善中晚期非小細胞肺癌放療患者的細胞免疫功能，抑制肺癌患者血清ARGⅠ活性，降低TNF-α、白介素-6（IL-6）水平，有效提高臨床療效，降低副作用［29-30］。為了探究黃芪多糖是否通過抑制免疫檢查點PD-1/PD-L1，改善患者的免疫功能，進而發(fā)揮抗腫瘤的作用，本研究采用Lewis細胞建立肺癌小鼠模型，觀察黃芪多糖對肺癌小鼠免疫功能的影響并初步探究其作用機制。

實驗結果表明，黃芪多糖能顯著提高抑瘤率，增加肺癌小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，驗證了黃芪多糖的抗腫瘤作用。流式細胞術結果顯示黃芪多糖增加CD4+T細胞比率及CD4+/CD8+T細胞比率；ELISA結果表明，黃芪多糖可以提高肺癌小鼠血清中IFN-γ及IL-2含量，提示黃芪多糖在肺癌模型小鼠體內(nèi)可能具有免疫調(diào)節(jié)作用；Western blot結果表明，黃芪多糖可以降低肺癌小鼠脾組織中PD-1和腫瘤組織中PD-L1的蛋白表達量。

T淋巴細胞主要介導細胞免疫，根據(jù)細胞表面標志物不同，T淋巴細胞分為CD4+T和CD8+T淋巴細胞2個主要亞群，CD4+T淋巴細胞可提高免疫功能，CD8+T淋巴細胞則相反。CD4+T和CD8+T細胞比率反映了機體免疫狀態(tài)，CD4+/CD8+T細胞比值的降低表明免疫功能下降［31］。IL-2是Th1細胞分泌的細胞因子，又稱T細胞生長因子，可以誘導T細胞增殖及分化為效應T細胞，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［32］。IL-2在體內(nèi)通過與T細胞表面的IL-2R結合，促進T細胞生長、誘導其他細胞因子的產(chǎn)生和細胞因子受體的表達，從而調(diào)節(jié)免疫，進而發(fā)揮抗腫瘤作用［33］。干擾素被認為是Th1反應因子，主要產(chǎn)生于活化的T細胞。IFN-γ可以影響腫瘤細胞周期變化，抑制腫瘤細胞增殖，加快腫瘤細胞凋亡［34-35］。其分泌程度代表了T淋巴細胞的功能狀態(tài)，與淋巴細胞抗腫瘤免疫活性密切相關，能增強免疫原性，阻止腫瘤免疫逃逸的發(fā)生［36］。本研究結果表明，黃芪多糖能促進肺癌荷瘤小鼠外周T淋巴細胞的增殖，并有效增強T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應，從而對肺癌產(chǎn)生抑制作用。

PD1及其配體PDL1/2是迄今為止研究最廣泛的免疫檢查點分子，已被證明可傳遞調(diào)節(jié)中樞和外周免疫耐受的抑制信號［37］。在外周T細胞耐受中，PD-L1/PD1通路以多種方式調(diào)節(jié)T細胞反應。PD-1在外周免疫系統(tǒng)中主要表達于活化的T細胞表面，其配體PD-L1主要表達于抗原提呈細胞及抗原組織中。PD-L1及PD-L2同屬于共刺激分子B7家族成員，與T淋巴細胞表面PD-1蛋白結合后，負向調(diào)控T細胞受體介導的IL-2生成，抑制T細胞的增殖和活化，阻斷炎癥因子的產(chǎn)生，導致T細胞的耗竭，進而引發(fā)抗腫瘤免疫的失活及腫瘤免疫逃逸［38］。同時，PD-1/PD-L1通路激活還可改變T細胞分化，使效應T細胞（effector T cell，Teff）及記憶T細胞（memory T cells，Tm）分化受損，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（regulatory T cells，Treg）和衰竭T細胞（exhaustion T cells，Tex）分化上調(diào)，從而顯著地抑制T細胞免疫效應。在本研究中，首次證實一定劑量黃芪多糖對免疫共刺激分子PD-1及其配體PD-L1的表達具有抑制作用，并推測黃芪多糖通過對PD-1/PD-L1通路進行負向調(diào)節(jié)，解除了該通路對T淋巴細胞增殖活化的抑制，促進T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應，從而抑制了肺癌細胞在模型小鼠體內(nèi)的生長。

綜上所述，黃芪多糖可抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長，提高肺癌小鼠免疫功能，其作用機制可能與抑制PD1/PDL1信號通路活化有關。