泡椒鳳爪加工過程中細(xì)菌群落組成及變化分析

尹含靚，杜秋，譚益升，孫軍華,，劉洋,3，蔣立文,3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）（2.鹽津鋪?zhàn)邮称饭煞萦邢薰荆祥L沙 410000）（3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128）

泡椒鳳爪是用雞爪加工成的一種休閑食品，主要流行于川渝地區(qū)[1]，其鮮脆開胃，且富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素等[2]，具有維持鉀鈉平衡、提高免疫力、美容養(yǎng)顏等功效，經(jīng)常食用有利于人體健康[3]。泡椒鳳爪生產(chǎn)過程比較復(fù)雜，主要生產(chǎn)工藝包括原材料解凍、切分、去血水、漂燙、鹵制調(diào)味、真空包裝、輻照處理等工序，且泡椒鳳爪屬于動物性食品，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，在加工貯藏過程中常被微生物污染。高溫?zé)釟⒕夹g(shù)不適用于泡椒鳳爪，因?yàn)榕萁辐P爪經(jīng)高溫處理或低溫長時間處理后，會導(dǎo)致膠原蛋白析出影響產(chǎn)品脆度和外觀。而國家在2015 年明確提出禁止雞爪加工中使用過氧化氫后，添加食品防腐劑結(jié)合輻照殺菌成為了泡椒鳳爪常用的保質(zhì)方法[4]。輻照殺菌是一種冷殺菌的方式，它可以最大限度保留食品的風(fēng)味及品質(zhì)[5]，但其殺菌效果受多種因素的影響，如微生物對輻照的耐受性、輻照劑量等[6]，而不同的食品防腐劑對不同微生物的抑制效果也不同。目前泡椒鳳爪產(chǎn)品中依然存在微生物導(dǎo)致的溶爛、漲氣等腐敗現(xiàn)象，而國內(nèi)外有關(guān)泡椒鳳爪產(chǎn)品中腐敗微生物的研究較少。楊琴[2]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致泡椒鳳爪脹袋的微生物包括解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）、畢赤氏酵母（P.guilliermondii）、腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）和產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）。馬含笑[7]對發(fā)軟泡椒鳳爪中微生物進(jìn)行分離，得到一株小鱒魚大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus oncorhynchi）。因此探究泡椒鳳爪加工過程中微生物多樣性變化，有利于生產(chǎn)過程中的微生物控制及防腐保鮮技術(shù)研究。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法被廣泛用于計(jì)數(shù)和分離鑒定食品中的微生物，可以直接反映樣品中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量級及食品的變質(zhì)程度[8]，但對不可培養(yǎng)微生物的研究存在局限性[9]。近年來應(yīng)用于檢測食品中微生物群落組成的高通量測序技術(shù)是一種高效、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)[10]，可以更全面分析樣品中微生物群落的組成及相對豐度。目前研究中常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法與高通量測序法結(jié)合詳細(xì)分析食品中微生物存在情況。張欣等[11]利用高通量測序及傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析了發(fā)酵普洱茶細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)高通量測序可以更全面揭示發(fā)酵普洱茶樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成。Cauchie 等[12]對288 份豬肉末樣品進(jìn)行高通量測序并結(jié)合耐冷菌和乳酸菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩種方法結(jié)合可以提供互補(bǔ)的結(jié)果。因此，本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合高通量測序技術(shù)測定了泡椒鳳爪加工過程中微生物數(shù)量及群落組成的變化情況，確定其加工過程中的主要污染及微生物組成變化情況，旨在為泡椒鳳爪加工過程中微生物污染防控和品質(zhì)及安全性提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

泡椒鳳爪不同加工階段的樣品來自湖南某食品企業(yè)生產(chǎn)車間，其加工階段主要包括解凍、切分、漂洗、煮制、泡制、真空包裝、輻照殺菌。采集同一批次生產(chǎn)過程中各個步驟的樣品裝至透明PE 袋中，置于含有冰袋的泡沫采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，部分樣品直接用于菌落總數(shù)測定，部分樣品加入適量無菌水混合均勻并使用孔徑為0.22 μm 的水系濾膜進(jìn)行過濾，過濾后將濾膜裝入已滅菌的50 mL 離心管中，置于-20 ℃冰箱保藏待高通量測序分析。

表1 泡椒鳳爪樣品信息表Table 1 Chicken feet with pickled peppers sample information sheet

圖1 泡椒鳳爪的主要制作流程Fig.1 The main production process of chicken feet with pickled peppers

1.1.2 主要試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Pusion Hot start flex 2X Master Mix，上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Maker，Takara；Gene colour，北京金博益生物技術(shù)有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit，Invitrogen，Life technologies；Biowest Agarose G-10，BIOWEST；生工50×TAE Buffer，上海生工生物工程股份有限公司；AxyPrep PCR Cleanup Kit，AXYGEN，Life Science Research；Stool DNA Kit，OMEGA biotek。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50 KBS 型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD 型無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250BⅢ型恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；DW-HL388 型超低溫冷凍儲存箱，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；Centrifuge 5424 型常溫離心機(jī)，Eppendorf；Microfuge R 22R Centrifuge 冷凍離心機(jī)，上海鵬儀電子科技有限公司；WH-861 型旋渦振蕩儀，太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司；DK-8D 型三溫三控恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；A200型PCR 儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；MiSeq 測序儀，Illumina 公司；Tanon EPS300 型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀，上海天能公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》進(jìn)行測定。

1.3.2 總DNA 的提取

采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒提取泡椒鳳爪樣品中細(xì)菌總DNA。并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，同時用紫外分光光度計(jì)對DNA 進(jìn)行定量。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增

利用16S rDNA V3～V4 區(qū)引物341F～805R 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系總體積為25 μL，其中包含25 ng模板DNA，2×Taq master Mix 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR 產(chǎn)物10 μL 用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

對下機(jī)數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼（Barcode）信息對數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊（Overlap）關(guān)系，將序列拼接成長的tags，并將序列上建庫引入的Barcode 和引物序列去除。使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾掉質(zhì)量值低的序列以及嵌合體序列[13]，再將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OUT）。每個OTU 選擇代表性序列，然后使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（Ribosomal Database Project，RDP）分類器將數(shù)據(jù)歸類到每個代表性序列[14]。利用MAFFT（V7.310）軟件對不同類群優(yōu)勢種群的差異進(jìn)行多序列比對，研究不同OTU 間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以Chao1、Shannon、Simpson 和Observed OTUs 為指標(biāo)，用QIIME（1.8.0 版）計(jì)算了所有樣品的各項(xiàng)指標(biāo)并進(jìn)行聚類，再通過Alpha 及Beta 多樣性分析單個樣本中物種的多樣性以及樣本間菌群結(jié)構(gòu)之間的差異[15,16]，根據(jù)每個OTU 代表序列與RDP 數(shù)據(jù)庫和Unite 數(shù)據(jù)庫的比對，得到各個樣本所有OTU 的物種注釋，對OTU 進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)后獲得門水平和屬水平上的物種豐度表。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及柱狀圖繪制，使用在線網(wǎng)址 https://www.omicstudio.cn/tool 上的OmicStudio 工具進(jìn)行PCA 圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡椒鳳爪不同加工過程菌落總數(shù)的變化

表2 為不同加工過程泡椒鳳爪菌落總數(shù)的變化情況，解凍前后鳳爪原料中就有一定數(shù)量的細(xì)菌，達(dá)103～104。將鳳爪原料經(jīng)過切分后（Y5），其細(xì)菌總數(shù)較解凍后（Y3、Y4）增加，達(dá)2.20×104CFU/g，鳳爪原料受污染較重[17]。漂洗后的鳳爪（Y6）中微生物數(shù)量降低至1.63×104CFU/g，說明漂洗對鳳爪中的微生物具有一定的清潔作用但效果不顯著。經(jīng)過煮制工序（Y7）后，由于熱處理對微生物殺滅有效果，微生物數(shù)量下降明顯，降低至＜10 CFU/g。在后續(xù)的泡制（Y8）和真空包裝（Y9）工序微生物防控效果較好，微生物數(shù)量依然保持在較低水平。

表2 不同加工過程泡椒鳳爪樣品菌落總數(shù)變化Table 2 Changes of total number of bacteria in Chicken Feet with Pickled Peppers samples during different processing processes

2.2 泡椒鳳爪不同加工過程的clean data

為了明確泡椒鳳爪加工過程中主要細(xì)菌污染情況，對泡椒鳳爪各加工工序樣品進(jìn)行了細(xì)菌高通量測序分析。由表3 可知，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過濾之后，所有樣品最終均得到70 000 個以上有效序列，且Q20 值均大于95%，Q30 值均大于90%，說明測序結(jié)果質(zhì)量高，達(dá)到了16s rDNA 分析測試的要求。

表3 不同加工過程泡椒鳳爪clean dataTable 3 Clean data of chicken feet with pickled peppers during different processing processes

2.3 泡椒鳳爪不同加工步驟細(xì)菌α多樣性分析

α多樣性可以反映樣品中物種組成的豐富度和多樣性。通常，Observed OTUs 和Chao1 用來反映物種豐富度[18]，而Simpson 和Shannon 主要反映物種多樣性。由表4 可知，所有樣品的Goods coverage 均達(dá)0.99 以上，說明本次檢測基本可以真實(shí)反映樣品中微生物群落的多樣性情況。Y10（輻照）和Y7（煮制）被檢測到Observed OTUs 和Chao1 值最低，反映其群落中包含的物種數(shù)目較少，說明煮制和輻照的殺菌工序均能有效殺滅泡椒鳳爪中存在的部分微生物。而Y9（真空包裝）被檢測到Shannon 和Simpson 值最高，微生物多樣性最高，可能是真空包裝袋等給樣品帶來了一定的污染。

表4 不同加工過程泡椒鳳爪細(xì)菌α 多樣性Table 4 α diversity of bacteria from Chicken Feet with Pickled Peppers during different processing processes

2.4 泡椒鳳爪不同加工過程細(xì)菌β多樣性分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）可以用來直觀地分析樣品之間的差異。如圖2 所示，Y1（凍鳳爪）、Y7（煮制）、Y8（泡制）、Y9（真空包裝）、Y10（輻照后成品）的組內(nèi)樣本較為分散，但組間距離較近且有一定的重疊，說明這五個工序細(xì)菌群落組成相似。而Y2（凍雞腳桿）、Y3（解凍鳳爪）、Y4（解凍雞腳桿）、Y5（切分）、Y6（漂洗）五個工序的樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，且與煮制工序后（Y7、Y8、Y9、Y10）的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)有一定的差異?？赡苁且?yàn)閅7（煮制）工序除去了大部分Y3（解凍）～Y6（漂洗）工序中的污染微生物，而鳳爪原料（Y1）中存在的微生物比較耐高溫，導(dǎo)致Y7（煮制）工序后微生物群落結(jié)構(gòu)與鳳爪原料中相似。

圖2 泡椒鳳爪不同加工過程細(xì)菌組成PCA 分析Fig.2 PCA analysis of bacterial composition in different processing processes of chicken feet with pickled peppers

2.5 泡椒鳳爪不同加工步驟細(xì)菌群落組成變化

Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）是泡椒鳳爪加工過程中的優(yōu)勢菌門，其次為Actinobacteria（放線菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門）等（圖3）。其中Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）在多種肉制品中被檢測到為優(yōu)勢菌門[17,19,20]。Proteobacteria（變形菌門）是泡椒鳳爪所有工序樣品中最優(yōu)勢的菌門（33.78%～87.34%），Y5（切分）中變形菌門相對豐度最高（87.34%），這可能是切分的儀器導(dǎo)致變形菌門細(xì)菌污染。Firmicutes（厚壁菌門）在Y8（泡制）工序中相對豐度增加（29.74%），說明泡制的鹵水帶來了厚壁菌門細(xì)菌污染，而經(jīng)Y10（輻照后成品）工序后其相對豐度達(dá)到最高（33.53%），可能是由于厚壁菌門細(xì)菌較耐受輻照。Bacteroidetes（擬桿菌門）可能不耐受高溫，其在Y1（凍鳳爪）中相對豐度最高（30.78%），而經(jīng)Y7（煮制）后其相對豐度顯著降低。

圖3 泡椒鳳爪不同加工過程門水平細(xì)菌相對豐度變化Fig.3 Changes of phylum bacterial relative abundance during different processing processes of Chicken Feet with Pickled Peppers

圖4 為泡椒鳳爪不同工序樣品中細(xì)菌在屬水平上的分布，Acinetobacter（不動桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等是樣品最優(yōu)勢的菌屬，平均相對豐度分別為21.50%、9.29%、5.99%。在Y7（煮制）工序前的鮮鳳爪中，Acinetobacter（不動桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）和Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）是相對豐度最高的三種菌屬。這三種菌屬在多種鮮肉制品中被檢測到為優(yōu)勢菌屬[17,21-23]，與本研究結(jié)果一致。Acinetobacter（不動桿菌屬）在Y2（凍雞腳桿）～Y6（漂洗）樣品中被檢測到相對豐度較高（23.44%～62.15%），在Y5（切分）工序中達(dá)到最高（62.15%），可能是由于切分儀器的道具、傳送帶等一直接觸新鮮鳳爪導(dǎo)致不動桿菌屬細(xì)菌的積累和增殖，使切分后的鳳爪受到儀器上不動桿菌屬的污染，相對豐度增加。Pseudomonas（假單胞菌屬）常與食品腐敗有關(guān)[22,24]，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂肪分解[25,26]，在Y2（凍雞腳桿）～Y6（漂洗）工序中相對豐度較高（10.87%～30.80%），而Y7（煮制）工序能有效降低其相對豐度。Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）在Y2（凍雞腳桿）中相對豐度最高（28.15%），它是多種低溫貯藏食品中的優(yōu)勢腐敗菌[27,28]，經(jīng)過Y7（煮制）工序后其相對豐度迅速降低（0.47%）。

圖4 泡椒鳳爪不同加工過程屬水平細(xì)菌相對豐度變化Fig.4 Changes of genus bacterial relative abundance during different processing processes of chicken feet with pickled peppers

凍鳳爪原料中（Y1、Y2）相對豐度較高的菌屬為Acinetobacter（不動桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）和Soonwooa，它們都不是雞腸道或糞便中檢測到的優(yōu)勢菌屬[29]，說明鳳爪原料中的微生物污染不源于雞糞便，可能來源于宰殺的環(huán)境、工作人員、設(shè)備刀具或冷凍運(yùn)輸過程中的污染。此外，Y10（輻照后成品）中相對豐度較高的Acinetobacter（不動桿菌屬）（3.23%）、Serratia（沙雷氏菌屬）（4.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）（6.26%）和Bacillus（芽孢桿菌屬）（4.59%）等都具有一定的產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的能力[30-32]，容易導(dǎo)致肉類食品的腐敗變質(zhì)。有研究表明，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更耐輻照[33]，Bacillus（芽孢桿菌屬）、Acinetobacter（不動桿菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）等是輻照后無菌袋樣品中存在的耐輻照的微生物[34]，且輻照效果受輻照劑量及季節(jié)（溫度）的影響[35]，因此探究更合適的方法對泡椒鳳爪中耐輻照微生物進(jìn)行防控才能預(yù)防產(chǎn)品在貯藏及銷售過程中的腐敗變質(zhì)。雖然可培養(yǎng)結(jié)果顯示Y10（輻照后成品）中菌落總數(shù)＜10 CFU/g，但Y10（輻照后成品）中檢測到相對豐度較高的Serratia（沙雷氏菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬），這些菌屬中包含部分致病菌株。因此在后續(xù)研究中還需考慮對Y10（輻照后成品）進(jìn)行致病菌株純培養(yǎng)檢測，以保障產(chǎn)品的安全性。

3 結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及高通量測序法探究了泡椒鳳爪解凍、切分、漂洗、煮制、泡制、真空包裝和輻照工序中的細(xì)菌污染情況。由兩種方法的分析結(jié)果可知，Y5（切分）是其主要污染環(huán)節(jié)，菌落總數(shù)增加至2.20×104CFU/g，而Y7（煮制）和Y10（輻照）工序能有效降低泡椒鳳爪中微生物的數(shù)量（＜10 CFU/g），達(dá)到一定的殺菌效果。Acinetobacter（不動桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等為所有工序樣品中最主要的微生物菌屬。然而，經(jīng)過煮制及輻照兩次殺菌工藝后，在Y10（輻照后成品）中依然檢測到一定豐度的Acinetobacter（不動桿菌屬）（3.23%）、Serratia（沙雷氏菌屬）（4.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）（6.26%）和Bacillus（芽孢桿菌屬）（4.59%）等。這些產(chǎn)蛋白酶及脂肪酶的微生物是肉制品中常見的優(yōu)勢腐敗微生物，且可能包含部分致病菌株，會給泡椒鳳爪產(chǎn)品帶來一定的質(zhì)量及安全問題。因此在生產(chǎn)過程中可以考慮改變輻照劑量和時間，或調(diào)整防腐劑的用量或種類來抑制耐高溫及耐輻照的腐敗微生物，從而保障產(chǎn)品在貯藏及銷售過程中的質(zhì)量及安全性。目前國內(nèi)外有關(guān)泡椒鳳爪產(chǎn)品中腐敗微生物的研究還較少，明確導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗等問題的微生物及其相關(guān)防控方法還有待進(jìn)一步探究。