氨基化磁珠非靶向富集食源性致病菌的條件篩選及優(yōu)化

李詩瑤，彭青枝，王鳴秋，劉艷 ,董婉婷

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(動物源性食品中重點(diǎn)化學(xué)危害物檢測技術(shù))，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430075）（2.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院,湖北武漢 430205）

食源性病原菌是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌，其入侵宿主并具有致病性。常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、結(jié)核菌等[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提供的數(shù)據(jù)，全世界每年有近200 萬人死于食源性病原體引起的腸道疾病[2]?，F(xiàn)階段，食源性致病菌的主要檢測方法有培養(yǎng)法、生化鑒定及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法等[3-5]，其中培養(yǎng)法是黃金標(biāo)準(zhǔn)方法[1]，需要進(jìn)行增菌、分離、鑒定等多個(gè)步驟,耗時(shí)長，具有一定的局限性。即使經(jīng)過選擇性增菌培養(yǎng)后，致病菌的快速檢測仍然受到培養(yǎng)基成分、食品成分等影響[6-9]。因此,選擇合適的分離富集方法使低濃度靶細(xì)菌能從食品基質(zhì)中分離出來且減少食品成分對檢測方法的干擾,對實(shí)現(xiàn)靶細(xì)菌快速、靈敏的檢測顯得尤為重要。

磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）因其比表面積大，具有良好的生物相容性且具有超順磁性等特點(diǎn)，為在食品基質(zhì)中快速吸附分離致病菌提供了一種解決方案[10-12]。氨基化磁珠（N-MNPS）是在Fe3O4MNPs 表面修飾了大量氨基，在pH 值為5～9的條件下，其表面電荷為正電荷，與裸磁珠相比帶正電荷的納米粒子與細(xì)菌間的相互作用更強(qiáng)，更容易吸附細(xì)菌[13]。本研究基于表面帶正電荷的（N-MNPS）與表面帶負(fù)電荷的細(xì)菌間的靜電相互作用，無需在MNPs 表面修飾特異性識別元件，省去了復(fù)雜的生物偶聯(lián)步驟,減少了制備成本；因?yàn)閷?xì)菌不具有特異性，因此能對幾乎所有帶負(fù)電細(xì)菌都有吸附捕獲作用，當(dāng)食源性疾病爆發(fā)時(shí)，可用N-MNPS 富集樣品中所有類型的病原菌實(shí)現(xiàn)非把向檢測，可以避免漏檢導(dǎo)致的陰性結(jié)論，下游可結(jié)合多重檢測手段，實(shí)現(xiàn)對多種食源性致病菌同步檢測，提高檢測效率[14]。本研究通過一系列優(yōu)化確定了氨基化磁珠的最佳吸附條件，并初步驗(yàn)證了在模擬添加食品樣品中其對常見食源性病原菌的吸附效果，為下游多重檢測奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115、大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7），均購自美國菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

腦心浸液（Brain Heart Infusion，BHI）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽平板（Xylose Lysine Deoxycholate，XLD）、Baird-Parker（Baird-parker agar，BP）瓊脂培養(yǎng)基、單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（Listera Chromogenic Medium，LC）、大腸埃希氏菌O157 顯色培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS），均購自北京陸橋；氨基化磁珠（NH2-magnetic Nanoparticles，N-MNTPs），粒徑分別為1 μm、300 nm、100 nm，均購自海貍生物；其他分析試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1600Ⅱ A2二級生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Heratherm IGS400 生化培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific Inc；ZQTY-70F 臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SX-700 壓力蒸汽滅菌器，日本TOMY 公司；ST40R 離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific Inc；wi114629 麥?zhǔn)媳葷醿x，梅里埃中國有限公司；磁力架，上海奧潤微納新材料科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及制備

用接種環(huán)分別從培養(yǎng)基斜面（保存在4 ℃的冰箱）挑取實(shí)驗(yàn)菌株Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 至BHI 溶液中，隨后于振蕩培養(yǎng)箱36 ℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)得到的菌液5000 r/min 離心10 min，然后將離心后的沉淀菌體用10 mmol/L、pH 值7.4 的無菌PBS 緩沖液洗滌三次，離心收集菌體，重懸于5 mL PBS 緩沖液中。通過麥?zhǔn)媳葷醿x制備102～108CFU/mL 的菌液。

1.3.2 不同pH 緩沖液中N-MNPS 以及病原菌zeta 電位測定

細(xì)菌的表面電位遵循大島軟粒子理論，其表面電位取決于細(xì)菌電荷密度和膜結(jié)構(gòu)[15]。根據(jù)四種細(xì)菌的最適生長pH范圍，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將10 mmol/L PBS 分別調(diào)節(jié)至pH 值：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。通過測定不同pH 值細(xì)菌菌懸液以及三種粒徑（100 nm、300 nm、1 μm）N-MNPS 的zeta電位值來對細(xì)菌與N-MNPS 靜電結(jié)合進(jìn)行評估。

1.3.3 N-MNPS的用量對四種病原菌捕獲率的影響

分別取不同量的N-MNPS（1 mg/mL）5、10、20、30、50、75、100、125、150、175、200 μg 于2 mL離心管中，磁分離后棄上清，分別加入1 mL 103CFU/mL 四種菌的新鮮菌液，在振蕩培養(yǎng)箱36 ℃，120 r/min下溫育60 min，混合均勻后磁分離N-MNPS，吸取上清液0.1 mL 分別涂布于XLD、BP、LC、大腸桿菌O157 顯色平板上，同時(shí)將未使用N-MNPS 捕獲的菌液同步溫育，作為初始加入的總菌量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行捕獲率的計(jì)算。

捕獲率計(jì)算公式：

式中：

X——捕獲率，%；

D——上清液中的菌落數(shù)，CFU；

D0——未磁捕獲的總菌落數(shù)，CFU。

1.3.4 N-MNPS 的吸附時(shí)間對四種病原菌捕獲率的影響

于2 mL 離心管中，分別加入1 mL 103CFU/mL四種菌的新鮮菌液，添加由1.3.3 計(jì)算出捕獲率最高的N-MNTPs 添加量，孵育5、10、20、30、45、60、90 min 后，磁吸取上清，同時(shí)將未使用N-MNPS 捕獲的菌液同步溫育，依照1.3.3 的溫育條件及公式進(jìn)行捕獲率的計(jì)算。

1.3.5 單菌正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)四種病原菌的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用L9（33）正交表，以磁珠粒徑，磁珠用量，吸附時(shí)間為考察因素，進(jìn)行3 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，選取1.5 mL 濃度為103CFU/mL 的各菌液進(jìn)一步優(yōu)化捕獲的條件。因素水平表如表1 所示。

表1 單菌正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors to orthogonal test in individual bacteria

1.3.6 混菌單因素實(shí)驗(yàn)

依據(jù)1.3.5 單菌正交試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)混菌單因素實(shí)驗(yàn)，選出最適宜在該條件下混合的目標(biāo)菌，設(shè)計(jì)條件盡量覆蓋所有目標(biāo)菌。分別吸取0.5 mL 103CFU/mL各菌液至2 mL 離心管充分混勻，單因素磁珠添加量為10、25、50、75、100、150、175、200 μg 孵育60 min，使用最優(yōu)添加量，單因素孵育時(shí)間5、10、20、30、45、60、90 min，依照1.3.3 的溫育條件及公式進(jìn)行捕獲率的計(jì)算。

1.3.7 大體積中N-MNTPs 對混菌的捕獲效率

根據(jù)1.3.6 的小體系中最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)在10、50 mL 的PBS 中，平均添加三種菌液使混合菌液濃度至103、102CFU/mL，計(jì)數(shù)結(jié)果依照1.3.3 的溫育條件及公式進(jìn)行捕獲率的計(jì)算。

1.3.8 實(shí)際樣品中N-MNTPs 的捕獲效率

取牛奶、水果沙拉各5 份，勻漿后分裝為5 g 每份，向100 mL 錐形瓶中分別加入5 g 樣品和45 mL PBS，于121 ℃滅菌15 min 后冷卻至室溫，加入目標(biāo)病原菌菌液，使得樣品中病原菌混菌終濃度為 1 02～106CFU/mL（g）。以1.3.6 的最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)，依照1.3.3 的溫育條件及公式進(jìn)行捕獲率的計(jì)算。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)與分析

本文中所有捕獲率實(shí)驗(yàn)平行三次。運(yùn)用SPSS Statistics 26 軟件統(tǒng)計(jì)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-MNTPs 以及各病原菌在不同pH 緩沖體系中的帶電荷數(shù)

Zeta 電位可以監(jiān)測出不同緩沖體系中細(xì)菌表面的帶電荷數(shù)、N-MNTPs 表面的帶電荷數(shù)。不同pH 值條件下各細(xì)菌的Zeta 電位值結(jié)果見圖1。金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在pH 值4～11 之間Zeta電勢值均低于-40 mV，沙門氏菌在pH 值6～11 之間低于-10 mV，大腸桿菌O157:H7 在pH 值5～11 之間電勢低于-5 mV。由圖2 可以看出N-MNPS 在pH 值2～7之間處于20 mV，在pH 值8～11 時(shí)電勢值下降在pH值9～11 電勢值為負(fù)值。由此可以得出四種菌在pH 值2～11 之間，表面均帶負(fù)電荷。如圖2 可知，三種粒徑的N-MNPS 在pH 值2～9 時(shí)，表面均帶正電荷，所以吸附環(huán)境在pH 值2～9 時(shí)對帶負(fù)電荷的細(xì)菌靜電吸附能力會更強(qiáng)，考慮到大部分病原菌最適生長pH 值7.2～7.6，為保證活菌數(shù)量，選擇pH 值7.4 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)體系的pH 值。

圖1 不同pH 條件下各細(xì)菌的Zeta 電位值Fig.1 Zeta potential of bacteria under different pH conditions

圖2 不同pH 條件下N-MNPS 的Zeta 電位值Fig.2 Zeta potential of N-MNPS under different pH conditions

2.2 N-MNTPs 用量及時(shí)間對四種病原菌捕獲率的結(jié)果分析

由圖3 可以看出在1 mL 103CFU/mL 的各菌液中加入不同量的N-MNPS，四種菌在N-MNPS 添加量為100 μg 時(shí)，捕獲率均可達(dá)到70%以上，其中除了大腸埃希氏菌O157:H7，其余三種菌均可在磁珠添加量為75 μg 時(shí)捕獲率達(dá)到70%以上。以100 μg 添加量作為最優(yōu)條件對孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，如圖4 可以看出沙門氏菌在孵育時(shí)間為5 min 捕獲率就可以達(dá)到90%以上，金黃色葡萄球菌和大腸O157:H7 在45 min 時(shí)能達(dá)到80%，單核細(xì)胞增生李斯特菌在45 min 時(shí)捕獲率為66%。正交試驗(yàn)顯著性分析沙門氏菌：粒徑有顯著影響（p＜0.05），因素主次順序?yàn)榱剑緯r(shí)間＞添加量；金黃色葡萄球菌：三因素均無顯著影響（p＞0.05），因素主次順序?yàn)榱剑咎砑恿浚緯r(shí)間；單核增生李斯特菌：粒徑有顯著影響（p＜0.05），因素主次順序?yàn)榱剑緯r(shí)間＞添加量，大腸埃希氏菌O157:H7 粒徑有顯著影響（p＜0.05），因素主次順序?yàn)榱剑緯r(shí)間＞添加量，單菌體系中正交實(shí)驗(yàn)極差分析最優(yōu)結(jié)果見表3。綜合正交結(jié)果，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌三者磁珠吸附的最優(yōu)粒徑均為300 nm，大腸埃希氏菌O157:H7 的最優(yōu)粒徑為1 μm，為保證富集病原菌的多樣性，后續(xù)試驗(yàn)使用300 nm 的N-MNPS富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌的混合菌液進(jìn)行捕獲。

圖3 單菌體系中N-MNPS 用量對捕獲率的影響Fig.3 Effect of N-MNPS dosage on capture rate in single bacteria system

圖4 單菌體系中孵育時(shí)間對捕獲效率的影響Fig.4 Effect of incubation time on capture efficiency in single bacteria system

表2 正交實(shí)驗(yàn)極差分析最優(yōu)結(jié)果Table 2 The optimal results of range analysis to orthogonal test

2.3 N-MNTPs 在混菌體系中不同的磁珠添加量和孵育時(shí)間的捕獲結(jié)果分析

在1.5 mL 混菌體系中加入不同量300 nm 粒徑的N-MNTPs，不同孵育時(shí)間，結(jié)果如圖5、圖6。當(dāng)磁珠添加量為50 μg，孵育60 min，三種混菌吸附率分別可達(dá)到90%以上；即使在添加量為50 μg，孵育30 min 三種混菌吸附率分別可達(dá)60%以上。證明在沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌三種菌的混合體系中，菌體之間并未對捕獲率造成很大影響，混合菌體的捕獲率達(dá)到預(yù)期（≥50%）。

圖5 合菌體系中磁珠添加量對捕獲效率的影響Fig.5 Effect of adding amount of magnetic beads on capture efficiency in mixed bacteria system

圖6 合菌體系中孵育時(shí)間對捕獲效率的影響Fig.6 Effect of incubation time on capture efficiency in mixed bacteria system

2.4 N-MNTPs 在大體積中對混菌的捕獲結(jié)果分析

依據(jù)2.3 的結(jié)果，選取300 nm 粒徑、50 μg 每1.5 mL添加量、60 min孵育時(shí)間作為大體積實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)反應(yīng)體系的倍數(shù)增大將磁珠添加量提高至500 μg，孵育60 min，分別在10、50 mL 無菌PBS 中，平均添加的混合菌液使其終濃度為103、102CFU/mL。結(jié)果如圖7 所示，混合菌液濃度為103CFU/mL 時(shí)，隨著反應(yīng)體系體積的加大，成倍數(shù)加大投入磁珠的量，沙門氏菌捕獲率為60%左右，金黃色葡萄球菌的捕獲率為75%左右，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在反應(yīng)體系為50 mL 時(shí)，捕獲率由80%下降至70%；混合菌液濃度為102CFU/mL 時(shí)各菌的捕獲率也均可達(dá)到55%以上。由此得出，大體積的反應(yīng)體系與小體積反應(yīng)體系，在磁珠投入量與反應(yīng)體系體積比例不變的情況下捕獲效率影響并未受到明顯影響。證明該優(yōu)化后的條件可應(yīng)用至50 mL 的樣品前處理稀釋液中。

圖7 在10 mL 與50 mL 體系中混菌終濃度為103（a）與102（b）時(shí)的捕獲率Fig.7 The capture rate at the final concentration of 103 (a) and 102 (b) in 10 mL and 50 mL systems

2.5 N-MNTPs 在人工污染樣本中的捕獲結(jié)果分析

牛奶、水果沙拉實(shí)際樣品中三種病原菌混菌終濃度為102～106CFU/mL（g），加入N-MNTPs 進(jìn)行捕獲。牛奶中混菌的濃度在1×102～1×105CFU/mL 時(shí)捕獲率從48%～70%逐步增加，在混菌終濃度為1×106CFU/mL時(shí)，捕獲率下降至50%～60%，在水果沙拉中，混菌終濃度在1×102～1×105CFU/mL 時(shí)捕獲率從64%～78%逐步增加，在混菌終濃度為1×106CFU/mL 時(shí)，捕獲率下降至65%～73%。結(jié)果如圖8 所示，N-MNTPs 對牛奶和水果沙拉中的病原菌捕獲效率均大于48%。水果沙拉的基質(zhì)相比較于牛奶的基質(zhì)更為復(fù)雜，理論上捕獲率應(yīng)低于牛奶基質(zhì)，但是捕獲率更優(yōu)，證明在食品基質(zhì)中N-MNTPs 捕獲效果較好。

圖8 人工污染牛奶（a）和水果沙拉（b）中各菌的捕獲率Fig.8 Capture rate of bacteria in artificially contaminated milk(a) and fruit salad (b)

3 結(jié)論

本探究基于N-MNPS 在pH 值為2～9 范圍內(nèi)帶正電荷，與表面帶負(fù)電荷的細(xì)菌存在靜電吸附作用，確立了在Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes三種食源性致病菌菌的混合菌液體系中N-MNPS 對于這三種菌的吸附條件，并將其應(yīng)用至實(shí)際食物樣本牛奶以及蔬菜沙拉中。研究初步證實(shí)，N-MNPS 的吸附效果于細(xì)菌本身是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性細(xì)菌無直接關(guān)聯(lián),通過對細(xì)菌的不同pH 值下表面帶電情況的研究，側(cè)面證明N-MNPS與細(xì)菌間存在很強(qiáng)的靜電吸附，同樣的結(jié)果研究結(jié)果也在孫程[16]的研究中被證實(shí)，在pH 值為4～8 時(shí)對Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 的捕獲效率大于70%，100 μg的氨基功能化磁性納米粒子對102～106CFU/mL 的菌液濃度捕獲率菌高于85%。本實(shí)驗(yàn)表明，在50 mL 的混菌體系（Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes）中，加入550 μg、粒徑300 nm的N-MNPS，在孵育60 min時(shí)，最低可捕獲1×102CFU/mL各菌，捕獲效率＞50%。對人工污染的牛奶、水果沙拉進(jìn)行目標(biāo)菌捕獲，在混合菌終濃度為1×102CFU/mL時(shí)也可達(dá)到40%以上的捕獲率，捕獲效率較好。捕獲后的細(xì)菌提取DNA 可滿足下游熒光PCR 檢測的檢出限要求，免去了繁瑣耗時(shí)的培養(yǎng)增菌的過程，為后續(xù)食品中食源性致病菌的快速檢測奠定基礎(chǔ)。