生物培育肉補充傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)肉類供應的可行性及挑戰(zhàn)分析

楊峰，李瑩瑩，李石磊，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068）

中國的畜牧業(yè)經(jīng)歷了巨大的轉(zhuǎn)變[1]，從生產(chǎn)方式、科學技術(shù)水平、國內(nèi)和全球糧食供應、資源利用、氮和磷的損失以及溫室氣體（GHG）的排放等方面均產(chǎn)生了深遠的影響。在過去的三十年中國牲畜單位數(shù)量增加了2 倍，動物源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量增加了2.1 倍，新品種供應、新技術(shù)和政府支持推動了該變化。于此同時，動物飼料進口量增加了49 倍，氨氣和溫室氣體排放增加了1 倍，水中的氮損失增加了3 倍（中國統(tǒng)計年鑒）[2]。此外，在健康方面，動物農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)互聯(lián)，食源性疾病，飲食有關(guān)的疾病，抗生素耐藥性和感染性疾病問題加劇，同時加劇了包括溫室氣體排放，土地利用和水利用等環(huán)境問題。這預示著，在未來的幾十年中，隨著人口增加，糧食和動物蛋白的生產(chǎn)將無法滿足全球人類的基本需求。這一結(jié)果表明，未來傳統(tǒng)糧食生產(chǎn)及肉類供應方法將面臨重大的不確定性和需求危機。

生物培育肉，即通過細胞體外培養(yǎng)、分化、生肌形成的具有肌肉結(jié)構(gòu)組織的肉類產(chǎn)品。目前已成為國際肉類食品研究的熱點，受到美國、歐盟、日本、以色列等主要發(fā)達國家或地區(qū)的高度重視。其特點是清潔、衛(wèi)生、成分可知并可調(diào)節(jié)，最重要的是生物培育肉沒有傳統(tǒng)動物過程中使用的抗生素及各種環(huán)境污染，并且不存在動物福利問題。生物培育肉被認為是一種最有可能解決未來肉品供應問題的新型肉類生產(chǎn)方式。生物培育肉通過動物肌肉干細胞的體外大規(guī)模、低成本組織培養(yǎng)實現(xiàn)，生產(chǎn)過程主要包括種子干細胞的分離獲取、細胞的大規(guī)模培養(yǎng)增殖、細胞的誘導分化、培育肉的收獲和分離、食品化加工等諸多步驟，有望補充傳統(tǒng)肉類的供應不足甚至在未來替代傳統(tǒng)肉類的生產(chǎn)模式。

1 傳統(tǒng)肉類現(xiàn)狀分析

由于畜禽相關(guān)養(yǎng)殖技術(shù)及科技水平存在差異，西方國家在畜禽品種的技術(shù)水平明顯高于國內(nèi)技術(shù)現(xiàn)狀，導致國內(nèi)目前優(yōu)質(zhì)種畜禽嚴重依賴進口。主要通過國外優(yōu)質(zhì)品種與國內(nèi)地方品種雜交獲得雜交優(yōu)勢，但傳統(tǒng)育種周期較長，加上西方國家壟斷行為，盡管國內(nèi)現(xiàn)在加大科研技術(shù)投入，突破了部分領(lǐng)域的壟斷行為。但隨著人口增加和經(jīng)濟提高，肉類蛋白依賴進口越來越嚴重（圖1a），其中大型動物中的牛肉進口數(shù)量由2013 年到2019 年逐年增加，并且2019 年進口量（175.93 萬t）是2013 年（34.1 萬t）的5 倍，而出口量對比變化不大（2.2 萬t～3.4 萬t）。同時，作為一個豬肉消費大國，我國豬肉進口數(shù)量近年呈持續(xù)上升趨勢[3]，進出口比例失衡。以2020 年1 月～7 月為例（圖1b），豬肉進出口比例嚴重失衡，2020 年7 月當月進口豬肉數(shù)量為55.58 萬t，而出口豬肉僅為11.33萬t，主要進口國家分布為進口數(shù)量大于60 萬t 的國家有美國、西班牙；進口數(shù)量在30 萬t 到60 萬t 的國家有丹麥、荷蘭、加拿大、德國；進口數(shù)量在10萬t 到30 萬t 的國家有巴西、智利、法國、英國。出口國分布為1 萬t 以上出口國日本；0.01 萬t 到1 萬t國家新加坡以及小于0.01 萬t 出口國剛果、澳大利亞、印度尼西亞等，總體而言，豬肉存在嚴重進口依賴問題。同時國內(nèi)生豬存出欄量統(tǒng)計結(jié)果可以看出（圖1c），從2012 年開始到2018 年肉豬出欄量、期末存欄量、能繁母豬存欄量均呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢。2019年非洲豬瘟和2020 年新冠病毒爆發(fā)引發(fā)豬肉產(chǎn)量和消費量驟減，導致豬期末存欄量、能繁母豬存欄量大幅度降低。這一結(jié)果將導致后疫情時代豬肉產(chǎn)量低和消費量驟增的矛盾更為突出，因此對進口豬肉量的依賴將進一步提升，而這將進一步加劇傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式供應生產(chǎn)源頭面臨的不確定性。此外，我國肉羊養(yǎng)殖主要集中在內(nèi)蒙、東三省、青海及新疆等地區(qū)，但隨著過度放牧，環(huán)境治理等因素，我國肉羊飼養(yǎng)總量逐漸減少，并且從羊肉進口數(shù)量來看（圖1d），從2015年開始隨著我國經(jīng)濟發(fā)展的快速提升，羊肉進口量逐年上升，盡管進出口量較我國總產(chǎn)量比例較小，但該趨勢同樣預示了我國肉羊總產(chǎn)能的飽和以及對進口羊肉依賴性的提升。這一結(jié)果進一步的顯示出傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式達到臨界點進而加劇了我國未來傳統(tǒng)生產(chǎn)方式的不確定性。從全球范圍來看，2019 年全球牛的平均庫存量約10 億[4]；雞的平均庫存量估計為190 億；羊和豬的平均庫存量約10 億。受經(jīng)濟發(fā)展的影響，預計到2050 年全球?qū)游镄援a(chǎn)品的需求將翻一倍[5]。同時受飲食偏好的變化，預計全球牛飼養(yǎng)量將在2030年增加到24 億，到2050 年增加到26.4 億[6]。

圖1 我國主要肉類進出口現(xiàn)狀統(tǒng)計Fig.1 Statistics on China's meat import and export status

全球糧食安全和糧食生產(chǎn)和消費的可持續(xù)性很大程度上取決于如何管理畜牧業(yè)生產(chǎn)和動物源食品消費。牲畜生產(chǎn)系統(tǒng)占用了世界重要比重的資源，例如土地和水（占比例3%～5%），并且導致CO2為主源的溫室氣體（GHG）和NH3（空氣中的）以及氮（N）和磷（地表水源中）的排放[7]。最近的全球評估機構(gòu)對不同牲畜生產(chǎn)系統(tǒng)的生物量使用，飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率進行了系統(tǒng)的量化。畜牧生產(chǎn)方式的變化，轉(zhuǎn)向更高效的單胃動物和無地生產(chǎn)系統(tǒng)（飼養(yǎng)動物，從其他農(nóng)場和國家進口飼料，而糞便僅部分流向耕地），已在動物的水平為節(jié)省大量資源和減少排放做出了貢獻。然而，由于畜牧業(yè)生產(chǎn)的總體影響較大，盡管通過提高生產(chǎn)水平和農(nóng)場飼料和動物生產(chǎn)的效率，但對糧食、土地、水資源等的依賴依舊是影響環(huán)境和能源的重要指標。從近幾年數(shù)據(jù)看，農(nóng)業(yè)用地及耕地面積近年變化不大，并且受溫室效應影響，整個陸地面積甚至在減少，全球糧食產(chǎn)量相對穩(wěn)定，并且在科技水平提高的基礎(chǔ)上，相對產(chǎn)量有所提高。但從近幾年的糧食總產(chǎn)量看（圖2），全球糧食總產(chǎn)量維持在相對恒定的比例，意味著全球糧食供應在未來也不會發(fā)生特別大的變化，即未來畜產(chǎn)品供應在當前已經(jīng)趨于飽和狀態(tài)，盡管畜產(chǎn)品供應主要受市場供求關(guān)系影響，但從側(cè)面來看，隨著人口數(shù)量的增加，畜產(chǎn)品的供應可能無法得到滿足。

圖2 全球糧食總產(chǎn)量變化趨勢Fig.2 Trends in global food production

牲畜將地球整個陸地表面的30%用作永久牧場；33%的耕地用于生產(chǎn)牲畜飼料[8]，因此牲畜業(yè)對全球的環(huán)境影響很大[9]。Pelletier 和Tyedmers（2010 年）預計，到2050 年，畜牧業(yè)將在氣候變化、活性氮損耗及食用性植物占用規(guī)模三個問題上對環(huán)境產(chǎn)生更大的影響[10]。與此同時，畜牧業(yè)消耗了全球8%的可食用淡水資源[11]，對清潔水和衛(wèi)生設(shè)施產(chǎn)生了重大影響。世界上近三分之一的農(nóng)業(yè)總水食用與動物產(chǎn)品有關(guān)[12]。除了水，畜牧業(yè)溫室氣體排放導致了很大程度的氣候問題。由于其重要性，氣候變化與畜牧業(yè)之間的相互作用現(xiàn)已得到廣泛認可。畜牧業(yè)造成了很大一部分農(nóng)業(yè)排放[13]。農(nóng)業(yè)約占當前人為排放的10%～12%。一些人估計，在2010 年所有人為排放造成的0.81 ℃的總模擬升溫中，畜牧業(yè)的直接非二氧化碳排放約占19%[14]。由于CH4和N2O 具有較高的全球變暖潛能值，反芻動物單位畜產(chǎn)品的溫室氣體排放量高于單胃動物[15]?？傮w而言，畜牧業(yè)對全球土地、水、糧食的消耗產(chǎn)生巨大影響。同時排放了大量的溫室氣體及對環(huán)境造成了重大污染。

2 生物培育肉的形成過程及其特點

在肌肉組織中，肌纖維占干物質(zhì)90%的比重，結(jié)締組織和脂肪組織占比10%[16]。肌肉中細胞種類可以分為成肌細胞、肌衛(wèi)星細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞和支持細胞。生物工程學的進步實現(xiàn)了不同種類細胞在體外的共培養(yǎng)，并進一步實現(xiàn)了體外組織的類器官模擬再生[17,18]。基于這一技術(shù)的發(fā)展，生物培育肉技術(shù)應運而生，通過成肌細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞及可以產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的支持細胞等共培養(yǎng)，實現(xiàn)在3D支架材料中生成具有組織結(jié)構(gòu)的骨骼肌。從技術(shù)角度來看，生物培育肉的特點是通過細胞培養(yǎng)的，在體外形成肌肉纖維蛋白的一種肉類生產(chǎn)方法[19]。

生物培育肉的制造中，主要通過兩種途徑進行細胞的制備：1、通過肌衛(wèi)星細胞分化為成肌細胞，成肌細胞擴增后進入分化途徑進而產(chǎn)生肌纖維組織；2、通過間充質(zhì)干細胞誘導成肌細胞、成纖維細胞以及脂肪前體細胞，進而進行細胞的增殖，最后通過細胞誘導，促使成肌細胞形成肌纖維，成纖維細胞形成細胞外基質(zhì)，脂肪前體細胞誘導形成脂肪細胞進而形成脂肪組織。其整個過程主要分為三個主要階段（圖3）：細胞增殖階段，這個階段的目的是通過細胞增殖產(chǎn)生大量的生物培育肉的基本元件-細胞，為形成更多的肌纖維做前提準備；之后是分化階段，成肌細細胞分化之后形成肌管，為產(chǎn)生肌肉蛋白做準備。脂肪細胞分化生脂，為生物培育肉的脂肪生成做準備，成纖維細胞進行表達調(diào)控，產(chǎn)生諸如膠原、透明質(zhì)酸等細胞外基質(zhì)，支持其他細胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)；最后是肌肉形成階段，這個階段的復雜性最高，因為這個階段是肌纖維組織、肌內(nèi)外脂肪組織以及細胞外基質(zhì)進行生物學的融合，進而形成真正意義上的生物培育肉，其過程受包括基因、蛋白、激素等多種條件控制，是產(chǎn)生的生物培育肉與體內(nèi)形成的肉相似性最關(guān)鍵的一步，同時也是目前最亟待解決的技術(shù)難題。因此多類型細胞共培養(yǎng)在生物培育肉的制造過程中將成為未來發(fā)展的主要方向和趨勢。然而，生物培育肉的制造在國內(nèi)目前研究只是處于實驗室水平上形成的雞肉、豬肉、鴿子湯等產(chǎn)品（如南京農(nóng)業(yè)大學生產(chǎn)的豬肉糜及中國肉類食品綜合研究中心生產(chǎn)的雞肉排、養(yǎng)生鴿子湯及豬肉排等），尚無上市售賣的生物培育肉產(chǎn)品。根本原因在于目前的研究水平尚無法做到在規(guī)?；a(chǎn)過程中有效的控制培育肉制造成本，盡管新加坡目前已經(jīng)具有上市的培育肉產(chǎn)品，其相對產(chǎn)量較低，仍無法滿足市場需求，同時，在國內(nèi)沒有針對生物培育肉的相關(guān)食品安全方面的法律法規(guī)出現(xiàn)，行業(yè)標準等也需要相關(guān)部門的努力中積極推進。

圖3 生物培育肉形成過程Fig.3 The formation process of biologically cultivated meat

盡管生物培育肉目前已經(jīng)在實驗室水平上進行的大量的研究，但若將其推上市場，仍需要較長時間的準備，其主要受限于制造成本，而成本中主要包括種子細胞的來源，廉價的針對生物培育肉制造的培養(yǎng)基的研究以及胎牛血清的替代產(chǎn)品的研究。

3 生物培育肉的關(guān)鍵細胞及功能

作為生物培育肉制造起始材料，種子細胞的選擇起到至關(guān)重要的作用。通過實驗驗證，細胞隨著物種年齡的增加，在體外增殖的效率逐漸降低，而在胚胎中，胚齡越小細胞活性越強。但如果胚胎周期過早，將會導致提取的細胞處于分化前期，細胞具有一定干性，比如肢體發(fā)育之前，體節(jié)細胞可以分化成多種肌肉和骨骼相關(guān)的細胞，因此選取準確的細胞提取樣本和提取時間是影響后期生物培育肉制造效率的關(guān)鍵。此外，生物培育肉的種子細胞來源主要有三個方向（圖4）：1、干細胞，作為生物體最原始的細胞，干細胞作為祖細胞群，可以進行增殖以增加細胞群數(shù)量，同時可以分化成具有專一功能的細胞。干細胞研究是動物科學領(lǐng)域的一個固有領(lǐng)域[20]，而專注于成肌和成脂干細胞的研究對于生物培育肉技術(shù)具有重要的意義。Yuan 等[21]對牛胚胎干細胞進行培養(yǎng)，獲得了一個穩(wěn)定培養(yǎng)物，總結(jié)了骨骼肌發(fā)育所需要的細胞類型[22-25]。但干細胞作為生物培育肉種子細胞的缺點是細胞具有不定向分化，培養(yǎng)過程中細胞的分化方向控制難度大；2、間充質(zhì)干細胞，作為胚胎發(fā)育過程中中胚層的主要細胞類型，在肌肉發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用[22]，并且可以分化為成肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞[26-31]。在肌肉發(fā)育過程中，間充質(zhì)干細胞參與肌源性過程，分化出成肌細胞和肌衛(wèi)星細胞。其他間充質(zhì)干細胞參與成肌細胞纖維化、成脂祖細胞譜系[22]，產(chǎn)生肌纖維和成脂祖細胞。間充質(zhì)干細胞在特定培養(yǎng)條件下，可以有效增殖并保持其分化潛能[32-35]。3、誘導多能干細胞也可以作為生物培育肉重要的細胞來源，誘導多能干細胞特點是容易獲取。這一特點決定了誘導多能干細胞在培養(yǎng)成本和開發(fā)穩(wěn)定的干細胞系方面具有較大的優(yōu)勢。此外，誘導多能干細胞可以從普遍存在的組織類型中獲取[36]，但是誘導多能干細胞的使用需要通過基因編輯、生物改造，并且其產(chǎn)量較低，存在基因?qū)用娴臒o法預料的風險[37]，并且作為食品類科學，在監(jiān)管程序和消費者接受程度上存在一定的不確定性。因此，目前全球范圍內(nèi)生物培育肉制造過程中主要使用的細胞來源為肌衛(wèi)星細胞和間充質(zhì)干細胞。

圖4 生物培育肉細胞來源及肌肉形成過程Fig.4 The source of biologically cultivated meat cells and the process of muscle formation

肌衛(wèi)星細胞是成體干細胞，具有干細胞特性，但細胞分化方向單一，只能分化為成肌細胞。肌衛(wèi)星細胞主要存在于骨骼肌組織中，其功能是參與肌肉損傷的修復[38,39]。細胞的獲取過程為首先通過從胚胎或畜體分離肌肉組織[40,41]，通過粉碎組織，胰蛋白酶消化，預鋪板富集細胞，然后通過CD56 抗體、CD29 抗體進行細胞純度驗證，進而對進行細胞純化最終獲得肌衛(wèi)星細胞[42]。研究表明生長因子可以調(diào)節(jié)衛(wèi)星細胞的增殖和分化，LIF，TGF-β和胰島素樣生長因子1 可以提高細胞的增殖效率[43-46]，TGF-β1 在平面培養(yǎng)環(huán)境中抑制成肌細胞的肌生成，而在3D 培養(yǎng)環(huán)境中可以促進成肌細胞的肌生成[47]，這為體外肌肉組織發(fā)育中肌生成提供了新的研究方向。細胞外基質(zhì)形成同樣可以誘導促進肌生成[48]，IGF 和肌原性miRNA 通過抑制細胞產(chǎn)生的肌原性生長因子從而抑制肌纖維的形成[49]。這些關(guān)鍵因子和基因的調(diào)控未來將成為生物培育肉技術(shù)中的研究重點。

成纖維細胞可以產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，即細胞外無細胞組分，是機體組織的重要組成，胞外基質(zhì)增加組織彈性，提供細胞粘附的粘附點，同時為細胞提供三維微環(huán)境，并調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移、形態(tài)以及組織形成方式[50]。此外，胞外基質(zhì)包含營養(yǎng)成分，包括多種成分的蛋白質(zhì)及多聚糖等，可以通過調(diào)節(jié)影響肌肉組織的理化性質(zhì)[51]。肌肉胞外基質(zhì)具有三個上升的結(jié)締組織層：填充肌纖維之間間隙的內(nèi)胚層，將肌束分隔開的包膜肌層和包裹整個肌肉的上皮層。Kadler 等[52]通過研究闡述了不同種類的膠原蛋白的生物學功能及在組織中分布狀態(tài)，為生物培育肉在支架及機械性能上提供了重要指導。支持細胞作為分泌胞外基質(zhì)的功能性細胞起到重要作用，在肌肉組織中，絕大多數(shù)的胞外基質(zhì)是由成纖維細胞產(chǎn)生。已有研究顯示成纖維細胞和成肌細胞可以促進組織工程構(gòu)建中肌肉發(fā)育，同時該研究對生物培育肉的制造過程中具有重要的作用。成纖維細胞增殖周期短，細胞增殖速度快，但細胞濃度控制相對較難，并且非常容易受到基因調(diào)控的影響，這意味著成纖維細胞和成肌細胞的共培養(yǎng)不容易實現(xiàn)，需要新方法新思路尋求突破（比如以微囊化的方式對細胞進行共培養(yǎng)以及細胞產(chǎn)物作為添加因子再培養(yǎng)等方式）。

脂肪細胞和肌內(nèi)脂肪的生成：在肌肉脂肪中，肌內(nèi)脂肪約占80%，肌纖維內(nèi)部脂肪約占20%。肌內(nèi)脂肪和脂肪酸的含量是影響肉風味的重要指標，影響肉的水分、風味、嫩度及營養(yǎng)價值[53]。肌內(nèi)脂肪是通過脂肪生成形成的，在形成過程中，間充質(zhì)干細胞分化為脂肪前體細胞，脂肪前體細胞成熟后形成脂肪，成脂細胞來源于間充質(zhì)干細胞和成脂祖細胞，受Zfp423基因調(diào)節(jié)的命運決定[51,22]。脂肪前體細胞在CCAAT增強子結(jié)合蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)過程中進一步分化為脂肪細胞，在通過過氧化物酶受體誘導激活PPARG-γ受體誘導細胞形成脂滴。在體外可以通過抗糖尿病藥等誘導細胞成脂。有研究證實了成肌細胞及成纖維細胞向脂肪細胞分化的方案。在脂肪生成代謝途徑中，甘油三酯是長鏈脂肪酸（LCFA）和3-磷酸甘油酯從頭合成的。這個過程中脂肪酸合酶、脂肪酸結(jié)合蛋白4 和PPARG 等起到了促進脂肪細胞成熟的作用[54]，并且可以作為脂肪生成的標記物，而追蹤脂肪形成和生成的方法包括定量比色油紅O 染色，熒光尼羅紅染色，F(xiàn)ABP4 免疫標記等。體外產(chǎn)生肌內(nèi)脂肪的研究仍需深入研究，目前脂肪組織工程學研究主要針對肌肉外部的脂肪。Hausman 研究了細胞外基質(zhì)對動物脂肪形成的影響表明，層粘連蛋白、膠原V 和膠原VI 是肌肉內(nèi)脂肪形成中關(guān)鍵的細胞外基質(zhì)成分[55]。

4 生物培育肉的關(guān)鍵技術(shù)

4.1 無血清培養(yǎng)基的技術(shù)突破

生物培育肉相關(guān)技術(shù)已經(jīng)取得了一定的研究進展，但從未來商業(yè)化生產(chǎn)的角度來看，仍然存在著一些特殊的技術(shù)挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)成為了阻礙培育肉商業(yè)化進程的主要障礙，尤其在低成本、規(guī)?；a(chǎn)以及肉類產(chǎn)品的市場化進程上。目前尚沒有專門針對生物培育肉而設(shè)計出的培養(yǎng)基產(chǎn)品，而是通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清的方式進行細胞培養(yǎng)。在大多數(shù)其他動物細胞培養(yǎng)應用中，血清在培養(yǎng)基配方中起著重要的作用。胎牛血清是從屠宰懷孕母牛胎兒體內(nèi)提取的血液中的血清部分。首先是胎牛血清價格昂貴，其次不同批次產(chǎn)生的胎牛血清之間的固有成分及含量存在很大的差異性，同時細胞因子的濃度差異非常顯著，無法做到成分含量的統(tǒng)一。并且很多成分是目前尚未研究徹底的、未知的細胞生長相關(guān)因子，不同批次的胎牛血清之間的這些差異可以導致肌肉表型發(fā)生變化，從而顯著的改變不同批次生物培育肉的肉質(zhì)。此外，在生物培育肉應用中使用的血清成分，增加了不確定的技術(shù)挑戰(zhàn)。因此，血清替代物或其他細胞生長因子的使用仍然是生物培育肉細胞培養(yǎng)基（包括細胞增殖和分化[56,57]）的主要挑戰(zhàn)。在未來研究過程中，研究開發(fā)成分明確的，可以用來控制不同細胞分裂、分化以及成肌細胞肌管形成的培養(yǎng)基將成為解決生物培育肉規(guī)?；a(chǎn)或商業(yè)化的重中之重。此外，如何通過使用不同培養(yǎng)基來影響培育肉產(chǎn)品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)也是生物培育肉未來發(fā)展的一個重要技術(shù)方向。另一方面，如何通過培養(yǎng)基和不同細胞特點來盡可能的節(jié)約細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基使用[58]，或者通過分子試驗替換血清將成為未來最主要的發(fā)展方向之一。

而針對無血清培養(yǎng)基的建立，可以通過以下幾個方向研究血清替代物。包括血清提取物、組織提取物或水解產(chǎn)物、生長因子、激素、載體蛋白（如白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白）、脂質(zhì)、金屬、維生素、多胺和還原劑等[56]。這些因子的含量及組合數(shù)量幾乎是無限的，而且它們之間的使用配比又會相互影響。因此，不同成分的選擇以及搭配將會耗費巨大的工作量、時間和成本。并且在使用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)時，有兩點需要注意。首先，可以在傳代培養(yǎng)過程中選擇無血清以來的細胞株進行細胞增殖培養(yǎng)，因為無血清培養(yǎng)基比血清培養(yǎng)基更能促進這類特定細胞或細胞亞型的增殖[59]。其次，由于血清中缺乏毒素中和活性，無血清培養(yǎng)基中不可避免的雜質(zhì)對培養(yǎng)細胞的影響可能比含血清的培養(yǎng)基強，因此培養(yǎng)過程需要時刻關(guān)注細胞的生長狀態(tài)。此外，對于無血清培養(yǎng)，還有其他需要注意的事宜，如胰蛋白酶的使用濃度及粘附因子得選擇等。同時還需要注意細胞培養(yǎng)的實時pH 變化，營養(yǎng)供應，細胞的氧化應激等[60,61]。

4.2 基因調(diào)控轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破

肌發(fā)生是指以修復組織損傷或從頭形成為目標的肌肉組織的發(fā)育。在體內(nèi)，這是在胚胎發(fā)育和成年肌肉再生中發(fā)生的一系列復雜事件，涉及各種分子機制和不同細胞類型的發(fā)育階段[62]。增殖的細胞是在成人或胚胎的衛(wèi)星細胞和成肌細胞，它能夠分化和融合形成新肌管（從細胞原始狀態(tài)形成新的肌管）或加入現(xiàn)有的肌纖維從而實現(xiàn)細胞增殖、分化和肌管融合的過程，而這個過程與幾種已知的生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的活性有關(guān)。從嚙齒動物到人類，已在幾種不同動物模型中研究了這些信號傳導因子及其功能[63]。

在一般情況下，生物培育肉制造過程中的培養(yǎng)基需要提供細胞外信號因子，它可以調(diào)節(jié)成肌細胞的活性。大量研究已經(jīng)確定了許多生長因子和細胞因子在肌衛(wèi)星細胞的激活和增殖中的重要作用，例如成纖維細胞生長因子（FGFs）[62]、肝細胞生長因子（HGF）、胰島素樣生長因子（IGFs）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和其他細胞因子[64]。其中FGF 基因家族中，尤其是FGF2，是成肌細胞增殖的有效激活劑和成肌細胞分化的抑制劑。HGF 在肌衛(wèi)星細胞的激活和化學趨化以促進肌肉修復的過程中起主要作用，因此對于生物培育肉的應用同樣存在一定意義。已知FGF 在體外可誘導增殖并抑制分化。IGF 通過刺激成肌細胞的增殖和分化，以及通過刺激發(fā)育中的肌管內(nèi)的蛋白質(zhì)合成來促進肌肉發(fā)育。此外，腫瘤壞死因子（TNFα）可能促進成肌細胞分化[65]，而白血病抑制因子（LIF）促進成肌細胞增殖[53]。而TGF-β配體可抑制成肌細胞和肌管的增殖，分化和生長。與成纖維細胞共培養(yǎng)的過程中，成纖維細胞的存在可有效促進成肌細胞的增殖，分化和融合[44,66]。

同許多生長因子受體一樣，IGF-1 受體是酪氨酸激酶相關(guān)信號（如磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）-Akt 和細胞外信號相關(guān)激酶（MAPK/ERK）信號傳導途徑）級聯(lián)傳導的主要激活劑[67,68]。這些途徑可以協(xié)同雷帕霉素蛋白復合物1（mTORC1）的靶標激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進細胞增殖并增加蛋白質(zhì)合成，從而推動肌肉組織發(fā)育[68,69]。同樣的，許多細胞因子受體如IL-6 受體，可以調(diào)用JAK-STAT 信號通路，在MAPK 信號通路的串擾作用下抑制肌發(fā)生[70]，而TGF-β受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，可以激活其自身涉及SMAD 的獨特信號通路蛋白質(zhì)磷酸化，相反的，幾種miRNA 在肌肉細胞中發(fā)揮重要功能進而抑制該通路，同時促進p38/MAPK通路。多種Wnt 蛋白信號傳導途徑也通過G 蛋白偶聯(lián)受體的卷曲家族在肌發(fā)生中起作用。β-catenin 介導的Wnt3a 途徑通過拮抗Notch 信號從而對肌原性細胞增殖和分化產(chǎn)生刺激作用，而Wnt7a 可以激活非經(jīng)典Wnt極化（PCP）途徑[71]，綜上所述，這些信號因子可以對成肌細胞增殖、分化起到促進和抑制作用，在新的培養(yǎng)基設(shè)計過程中，合理的搭配這些因子的使用將會在培育肉的培養(yǎng)過程中起到重要的作用，同時為未來培養(yǎng)基高效率、低成本的實現(xiàn)提供可能。

傳統(tǒng)的細胞合成蛋白質(zhì)的應用主要有疫苗以及各種抗體的生產(chǎn)，其成本相對較高；但通過成肌細胞產(chǎn)生食源性動物蛋白的方法相比而言成本較低。肌纖維的形成是通過mTOR 介導的信號來調(diào)節(jié)的，氨基酸既可以作為蛋白質(zhì)本身的組成部分，也可以作為調(diào)節(jié)劑[72]?？紤]到用于體外成肌和蛋白質(zhì)合成的許多純化的生長因子和信號分子相關(guān)的成本，非常有必要研究刺激細胞所需的信號通路的更節(jié)約的方法。有研究提出通過與動物具有高度同源性氨基酸序列的植物或真菌提取物在肌肉細胞培養(yǎng)中的使用的方法解決該問題。比如通過大豆肽提取物刺激胰島素相關(guān)的細胞信號通路[73]。同時有研究表示小麥和棉蛋白中的一些因子有可能替代牛血清白蛋白[74]。

4.3 多種細胞共培養(yǎng)的技術(shù)突破

細胞培育肉的最終產(chǎn)品將是由多種類型的細胞進行協(xié)調(diào)包括增值分化及分泌蛋白、脂肪等多組分肉類。即在體外模擬機體環(huán)境進而形成更具有肌肉理化性質(zhì)的培育肉。對于目前而言是生物培育肉的一個技術(shù)挑戰(zhàn)。對工業(yè)生產(chǎn)最重要的細胞類型包括肌衛(wèi)星細胞或肌前體細胞，成肌細胞，肌纖維，脂肪前體細胞，脂肪細胞和成纖維細胞[75]。生物培育肉生產(chǎn)的主要技術(shù)障礙是如何同時生長和控制所有這些細胞類型，從而實現(xiàn)不同細胞在共培養(yǎng)的前提下能夠各自實現(xiàn)的分裂、分化、成肌、成脂、成型而不受其他細胞的影響。

盡管脂肪形成是一個高度受控的調(diào)控的過程，調(diào)節(jié)脂肪形成的細胞外因子比控制肌發(fā)生的相關(guān)因子復雜性低。胰島素和IGF 可刺激多能干或脂肪干細胞分化為脂肪細胞，并可通過其刺激轉(zhuǎn)錄因子-過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT 增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）。相反，Wnt/β-catenin 信號傳導可抑制脂肪生成[43]。

成纖維細胞的分化和增殖在生物培育肉中不是最為迫切的問題，因為在大多數(shù)情況下它們不是主要的所需細胞類型，而是在更進一步的完善生物培育肉細胞培養(yǎng)的過程中起到強化作用。成纖維細胞在生物培育肉中的作用不是提供大量的肉，而是支持肌細胞和脂肪細胞的生長，并制造足夠的細胞外基質(zhì)以產(chǎn)生更真實的肉制品?？傮w而言，生物培育肉細胞培養(yǎng)過程中需要提供一些上述重要的生長因子或其替代物，以允許所需細胞類型的適當增殖和分化。

盡管目前有大量的研究探索細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)和技術(shù)，比如血腦屏障永生化血管內(nèi)皮/膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)模型特性的研究及通過微流體的高通量組合細胞共培養(yǎng)等，在共培養(yǎng)過程中僅僅可以研究不同細胞之間的信號傳遞及細胞的相互作用，尚無法在完全控制的前提下實現(xiàn)某一功能，有報道顯示通過微流控的方法可以實現(xiàn)細胞共培養(yǎng)環(huán)境的搭建，但其方法是將不同細胞共同封裝在微凝膠中，這種共培養(yǎng)方法尚不能實現(xiàn)生物培育肉的共培養(yǎng)-分調(diào)控的功能[76]。

4.4 生物培育肉支架材料的突破

水凝膠在組織工程領(lǐng)域無處不在，尤其在生物培育肉的制造過程中是必不可少的技術(shù)之一，因為它們可以模仿成肌細胞肌肉組織的3D 環(huán)境[77]。因此，在設(shè)計時要考慮到它們的機械性能、細胞相容性、質(zhì)量轉(zhuǎn)運和降解動力學。水凝膠可以用作軟支架，大孔支架的原料或填充大孔支架空隙的細胞生物材料[78]。對于后者，必須在細胞接種后使用細胞相容性溶液和方案進行水凝膠聚合。凝膠動力學和技術(shù)必須具有可擴展性，并允許在整個構(gòu)建體中進行均勻凝膠化。這對于目前的生物培育肉研究來說很難快速實現(xiàn)，尤其是細胞生物相容性方面，因此在未來的發(fā)展趨勢中，水凝膠系統(tǒng)也將成為一個重要的突破難點。

膠原蛋白和透明質(zhì)酸天然存在于肌肉細胞外基質(zhì)中，因此，它們可用于模擬天然基質(zhì)的某些生化和生物物理特性，并且還易于被細胞重塑和降解，這對于細胞遷移和成肌細胞的成熟至關(guān)重要[79]。膠原蛋白經(jīng)常用于組織工程。肌肉細胞中的纖維狀膠原I 和III豐富。它們在組織中起結(jié)構(gòu)作用，作為細胞粘附的錨點，并促進細胞遷移和組織發(fā)育。但是，膠原蛋白會在細胞中產(chǎn)生平面結(jié)構(gòu)，并且由于其較高的拉伸強度，膠原蛋白水凝膠主要用于產(chǎn)生機械穩(wěn)定的細胞粘附大孔支架。膠原蛋白-纖維蛋白混合物可以用作肌肉再生的水凝膠，已被證明可促進細胞增殖和肌管分化。但是膠原蛋白和透明質(zhì)酸的成本較高，一種低價的獲取方式是解決這一方案的重要挑戰(zhàn)。比如通過細胞生產(chǎn)膠原蛋白和透明質(zhì)酸，然后應用于生物培育肉中。

透明質(zhì)酸是在身體和肌肉細胞外基質(zhì)中普遍存在的簡單糖胺聚糖。它參與傷口愈合并且可以調(diào)節(jié)細胞行為如脂肪生成。透明質(zhì)酸水凝膠具有良好的粘彈性和高保水性，并且可以通過無動物的平臺上合成。透明質(zhì)酸-膠原蛋白復合材料顯示出改善的機械和生物學特性，可用于肌肉和脂肪形成支架。

海藻酸鹽是一種廉價的基于海藻的多糖，在Ca2+存在下會形成水凝膠。它由兩種單體組成，其中古羅糖醛酸與Ca2+相互作用，可以形成高度可調(diào)的膠連結(jié)構(gòu)。但海藻酸鹽與細胞相容性較差，需要通過RGD肽（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽）功能化，才可以為細胞附著提供位點。殼聚糖是一種可食用的葡萄糖胺聚合物，可以用于骨骼肌組織工程。但受其特性影響，同樣需要化學修飾以促進細胞粘附。上述的所有支架材料在單一特點方面均有各自的利弊，但如此多的支架材料，如何科學的利用其優(yōu)勢，規(guī)避其劣勢并將不同材料進行高效的組合搭配從而促進生物培育肉的發(fā)展是一個非常大的工程學研究，在生物培育肉未來的研究中，如何合理的搭配這些支架材料從而實現(xiàn)低成本，高效率的培育肉制造技術(shù)亦將成為未來技術(shù)的突破難點及發(fā)展趨勢。

5 展望

傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)趨于飽和狀態(tài)，急需尋求新的肉類供應突破口，而生物培育肉技術(shù)的發(fā)展通過組織工程學過程在受控，無動物環(huán)境中生產(chǎn)肉類的一個技術(shù)平臺，可以補充傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)肉類供應的缺口，但在市場化供應的前提下，仍需要攻克一下關(guān)鍵技術(shù)：生物培育肉需要解決血清替代問題，實現(xiàn)成本的極大幅度降低；需要活力高、傳代次世多的包括成肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等多種類細胞共培養(yǎng)，其過程需要培養(yǎng)最優(yōu)化參數(shù)，注重高效廉價的無動物源的生物載體材料進行動物細胞的有效擴增，需要可控的調(diào)節(jié)細胞分裂分化的因子，有效的調(diào)節(jié)細胞分化產(chǎn)生肌纖維。而肌內(nèi)脂肪的組織工程以及側(cè)重于營養(yǎng)價值和感官特性的分析方法，需要來自食品工程和肉類科學領(lǐng)域及生物科學領(lǐng)域綜合的工具和知識來實施以促進開發(fā)新的研究機會，比如肌內(nèi)脂肪的組織工程或新型具有肉香支架的產(chǎn)生以及生物培育肉支架在可食用，模仿結(jié)締組織膜等方面的突破?？傊?，生物培育肉的研究目前尚處于初期階段，研究任重而道遠，需要投入更多的人力物力促進其發(fā)展，最終成為一門跨學科、多門類的綜合技術(shù)知識平臺，從而為傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)的肉類供應提供有效補充甚至是部分替代。