靈芝HPLC指紋圖譜研究及其在產(chǎn)地追溯中的應(yīng)用

汪麗娜,蔣昆霞,關(guān)夢瑤,許 文,徐 偉,林 羽

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenceZhao,Xu et Zhang的干燥子實體[1],具有平喘止咳、安神補氣等功效[2-3]。福建是靈芝的主產(chǎn)地之一,福建靈芝入選福九味,為福建省重點名貴道地藥材之一[4]。中藥指紋圖譜是一種廣泛用于整體反應(yīng)中藥材質(zhì)量的方法[5-6],靈芝種類繁多,不同產(chǎn)區(qū)靈芝的成分及含量相差較大,利用中藥指紋圖譜可以標(biāo)識不同產(chǎn)地靈芝共有峰,為區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)的靈芝提供方法。查閱靈芝指紋圖譜文獻(xiàn),許曉燕等[7]建立了四川產(chǎn)地靈芝的14個HPLC共有峰;趙如詩等[8]建立了安徽、吉林等4個產(chǎn)地靈芝10個HPLC特征峰;Da等[9]建立安徽、山東等7個產(chǎn)地靈芝24個HPLC共有峰;Chen等[10]構(gòu)建了浙江、山東和安徽產(chǎn)地靈芝29個HPLC共有峰。然而,基于HPLC指紋圖譜法應(yīng)用于靈芝藥材溯源中的研究報道較少,因此本研究以福建靈芝為主要的溯源研究對象,構(gòu)建靈芝HPLC指紋圖譜,為靈芝的道地追溯提供新的技術(shù)手段。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),EX225DZH/AD十萬分之一分析天平(奧豪斯儀器有限公司),MILLI-Q Direct16超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

靈芝酸F(寶雞市辰光生物科技有限公司,批號:HS18048S1,純度≥98%,HPLC)。甲醇、乙腈、甲酸、乙醇(色譜純),其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

32批靈芝藥材飲片(S1-S32),分別購自福建、浙江、安徽、吉林,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明正高級實驗師鑒定為赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的干燥子實體。

2 方法

2.1 色譜方法

色譜柱采用Thermo Scirntific AcclaimTMRSLC PA2 Polar AdvantageⅡ(2.1 mm×150 mm,2.2μm),流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B),流速:0.25 mL·min-1,梯度程序為(B):0～34 min,26.5%～26.5%;34～52 min,26.5%～38.5%;52～60 min,38.5%～55%;60～75 min,55%～90%;75～80 min,90%～20%;80～90 min,20%～20%,柱溫:30℃,檢測波長:257 nm,進(jìn)樣量:5 μL。

2.2 供試品及對照品溶液的制備

取靈芝酸F對照品適量,精密稱定,加入甲醇分別制成質(zhì)量濃度約為1 mg·mL-1的對照品儲存液。

精密稱定靈芝藥材粗粉約1.0 g于具塞錐形瓶中,精密加95%乙醇50 mL,密塞,稱量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,用提取溶液補失重,搖勻,過0.22 μm濾膜,精密移取2 mL濾液于蒸發(fā)皿蒸干,精密加入50%甲醇0.5 mL復(fù)溶,過0.22 μm濾膜,取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取靈芝藥材(S12),采用“2.2”項的方法制樣,“2.1”項條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,以靈芝酸F為參照,記錄各指紋峰相對保留時間與相對峰面積,兩者RSD均小于2.7%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取靈芝藥材(S12),采用“2.2”項的方法制樣,在“2.1”項條件下別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,以靈芝酸F為參照,記錄各指紋峰相對保留時間與相對峰面積,兩者RSD均小于3.5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取靈芝藥材(S12)6份,采用“2.2”項的方法制樣,在“2.1”項條件下進(jìn)樣,以靈芝酸F為參照,記錄各指紋峰相對保留時間與相對峰面積,兩者RSD均小于4.7%,表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 靈芝藥材HPLC指紋圖譜共有模式的建立

取18批福建靈芝樣品(S1-S18)和14批其他產(chǎn)區(qū)樣品(S19-S32),分別按“2.2”項下制備樣品,按“2.1”項下條件進(jìn)樣采集數(shù)據(jù)。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)[11],對福建靈芝以及其他產(chǎn)區(qū)樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析,以靈芝酸F為參照,福建靈芝樣品(S1-S18)在共有模式中共建立了46個共有峰,其他產(chǎn)區(qū)樣品(S19-S32)共建立了23個共有峰,見圖1和圖2。

圖1 福建靈芝樣品HPLC指紋圖譜

圖2 其他產(chǎn)區(qū)靈芝樣品HPLC指紋圖譜

3.2 化學(xué)計量學(xué)分析

為了進(jìn)一步區(qū)分福建靈芝樣品與其他產(chǎn)區(qū)靈芝樣品的區(qū)別,以靈芝酸F為參照峰,對所有峰面積進(jìn)行相對峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化處理(Z標(biāo)準(zhǔn)化)后導(dǎo)入SPSS 26.0和SIMCA-P14.0進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析,采用聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)進(jìn)行化學(xué)計量分析。

3.2.1 聚類分析

將32批靈芝樣品18個共有峰面積導(dǎo)入SPSS 26.0版軟件進(jìn)行PCA,以瓦爾德及歐氏距離作為樣品間距離計算方法,見圖3。結(jié)果顯示,當(dāng)聚類距離為25時,32批靈芝被分為兩類,第1類為福建靈芝樣品,第2類為其他產(chǎn)區(qū)樣品。當(dāng)聚類距離為12時,32批樣品劃分成4類,第1類為福建產(chǎn)地樣品,第2類為浙江產(chǎn)地靈芝,第3類為安徽產(chǎn)地靈芝,第4類為吉林產(chǎn)地靈芝。結(jié)果表明,分類情況與產(chǎn)地有關(guān)。

圖3 聚類分析

3.2.2 主成分分析和正交偏最小二乘法分析

將18個共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件,計算特征值和方差貢獻(xiàn)率,見表1,成分矩陣見表2。將特征值>1的成分提取出來,由表1、2可知,主成分1-4累積方差貢獻(xiàn)率為85.24%>85%,表明這4個主成分能較全面反映所有指標(biāo)的信息。主成分1的特征值為9.257,方差貢獻(xiàn)率為51.428%,載荷較高的峰為1號峰和6號峰,表明1號峰和6號峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值為3.491,方差貢獻(xiàn)率為19.394%,載荷較高的峰為8號峰和9號峰,表明8號峰和9號峰主要反映主成分2的信息;主成分3的特征值為1.515,方差貢獻(xiàn)率為8.414%,載荷較高的峰為16號峰和17號峰,表明16號峰和17號峰主要反映主成分3的信息;主成分4的特征值為1.081,方差貢獻(xiàn)率為6.003%,載荷較高的峰為4號峰和18號峰,表明4號峰和18號峰主要反映主成分4的信息。由表1與圖4可知,主成分1-4特征值均大于1,其累積方差貢獻(xiàn)率為85.239%,表明上述4個主成分為不同產(chǎn)地靈芝質(zhì)量差異的主要成分。

表1 特征值和方差貢獻(xiàn)率

表2 靈芝藥材成分矩陣

圖4 碎石圖

利用SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行PCA,將32批靈芝藥材中18個共有峰的數(shù)據(jù)帶入軟件,見圖5。32批4個產(chǎn)地的靈芝藥材各自聚為一類,與PCA結(jié)果一致。福建產(chǎn)區(qū)的靈芝整體分布較為集中,可與其他3個產(chǎn)地完全分開,吉林產(chǎn)區(qū)的靈芝樣品分布較為離散。進(jìn)一步利用OPLS-DA,將VIP大于1作為提取評價標(biāo)準(zhǔn)[12],見圖6。結(jié)果顯示,色譜峰3、4、5、6、8、9、18的VIP值均>1,表明這7個峰所指代的成分是區(qū)別不同產(chǎn)地靈芝差異的主要標(biāo)志性成分。

圖5 主成分分析注:FZ:福建,ZJ:浙江;AH:安徽;JL:吉林

圖6 偏最小二乘法分析注:FZ:福建,ZJ:浙江;AH:安徽;JL:吉林

4 討論

在預(yù)實驗期間,筆者比較了超聲、回流、索式提取、溫浸提取等提取方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲、回流這兩種提取方式的效果優(yōu)于索式提取和溫浸提取,考慮操作簡便性,本實驗選擇較便捷的超聲提取法來制備靈芝供試品。

本實驗建立福建靈芝樣品HPLC指紋圖譜共標(biāo)定46個共有峰,其他產(chǎn)區(qū)樣品藥材HPLC指紋圖譜共標(biāo)定23個共有峰,為了進(jìn)一步區(qū)分福建靈芝樣品與其他產(chǎn)區(qū)靈芝樣品的區(qū)別,以靈芝酸F為參照峰,對所有峰面積進(jìn)行相對峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化處理(Z標(biāo)準(zhǔn)化)后導(dǎo)入SPSS26.0和SIMCA-P14.0進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析,并進(jìn)行指紋圖譜的HCA、PCA、OPLS-DA,實現(xiàn)了福建靈芝的有效溯源,在具體使用過程中將靈芝藥材樣品指紋圖譜信息導(dǎo)入已建立好的HCA模型、PCA模型和OPLS-DA模型中,將靈芝藥材樣品與模型進(jìn)行比對,共有色譜峰3、4、5、6、8、9、18是影響不同產(chǎn)地靈芝差異的主要標(biāo)志性成分,從而有效追溯福建靈芝樣品。

綜上,本研究構(gòu)建了靈芝HPLC指紋圖譜,結(jié)合HCA模型、PCA模型和OPLS-DA模型,可快捷、準(zhǔn)確地應(yīng)用到靈芝產(chǎn)地追溯,為靈芝的質(zhì)量追溯提供新的技術(shù)手段。