參黛清腸湯介導(dǎo)PI3K/Akt-mTOR通路抗?jié)冃越Y(jié)腸炎相關(guān)癌變的作用研究*

杜明民，郎曉猛，崔建從，張曉利

（河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的消化系統(tǒng)慢性、非特異性、難治性疾病[1]。潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌變（ulcerative colitis associated carcinogenesis，UCAC）屬散發(fā)性結(jié)腸癌的一種，涉及多基因、多信號，是導(dǎo)致UC患者死亡的主要原因之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者病程30年癌變的發(fā)生率高達18%[3]。目前，UCAC的治療方法主要包括藥物治療、外科手術(shù)等方法，但治療效果不太理想。中醫(yī)藥在整體觀念、辨證論治的原則下針對病因病機、標(biāo)本兼治以及隨證加減的靈活用藥，對UCAC治療效果顯著。參黛清腸湯以《壽世保元》中清腸湯為基礎(chǔ)方，結(jié)合UCAC的中醫(yī)證候辨證加減所得，可化濕濁，解瘀毒，具有化濁升清、解毒祛瘀之效[4-5]。目前關(guān)于此方對UCAC的作用及可能機制的研究少見報道。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylcholine-3 kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路參與了調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲。近年研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AktmTOR通路與UCAC發(fā)生過程密切相關(guān)[6]。故本研究通過制備UCAC小鼠模型，探究參黛清腸湯對UCAC的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6健康雄性SPF級小鼠95只，6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-003。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食和進水，環(huán)境溫度21～27 ℃，相對濕度45%～55%，通風(fēng)換氣，氣流速度10～25 cm/s，頻率8～15次/h。本研究已經(jīng)過醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 參黛清腸湯組成：青黛20 g，白及20 g，黃柏15 g，兒茶15 g，黃連15 g，地榆12 g。以上中藥經(jīng)河北省中醫(yī)院中藥制劑室用蒸餾水煎煮并濃縮成藥液，方藥濃度為每1 mL原液含生藥2 g。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）（批號：02160110-CF，純度：99%）購自MP Biomedical公司；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（批號：A5486）購自美國Sigma公司；水飛薊賓（批號：20151106，純度：99%）購自天津天士力集團有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號：191204）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脫氧核糖核酸斷裂的原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色試劑盒（批號：11684817910）購自德國Roche公司；甲基噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（批號：M201910）購自美國Sigma公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）小提試劑盒（批號：12183025）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠磷脂酰肌醇3激酶（phosphatid ylinositide3-OH kinase，PI3K）一抗（批號：MA1-74183）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（phosphorylated serine/threonine kinase，p-Akt）一抗（批號：44-621G）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）一抗（批號：44-609G）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）一抗（批號：PA5-34663）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）一抗（批號：44-1125G）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2）一抗（批號：MA5-11757）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗（批號：PA5-11378）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批號：PA1-16777）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗兔PI3K辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab7090）、山羊抗兔p-Akt辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab97057）、山羊抗兔Akt辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab205718）、山羊抗兔p-mTOR辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab6721）、山羊抗兔mTOR辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab6702）、山羊抗兔Bcl-2辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab97080）、山羊抗兔Bax 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab7085）、山羊抗GAPDH兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：ab97051）均購自英國Abcam公司；實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 主要儀器 E0987型組織包埋機、E0972型全自動石蠟切片機（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BX53M型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Optima離心機（美國Beckman公司）；Multiskan SkyHigh全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；G05型PCR儀（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；DYCZ-24DH型雙板垂直電泳儀、DYCZ-40S型四板轉(zhuǎn)印儀（北京六一生物科技有限公司）；TH-690型光密度掃描儀（北京海泰天恒科技有限公司）。

1.4 造模與分組 隨機取85只小鼠采用DSS/AOM復(fù)合法制備UCAC小鼠模型，具體方法[7]：常規(guī)清潔水、飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，次日給予小鼠10 mg/kg AOM腹腔注射1次，并用4%DSS溶液替換清潔水飲用1周，后2周飲用普通清潔水，3周為1個循環(huán)，造模持續(xù)3個循環(huán)共9周。剩余10只小鼠同步給予腹腔注射生理鹽水，普通清潔水飲用作為空白組。UCAC模型小鼠出現(xiàn)消瘦、倦怠、活動量減少、腹瀉、便血、腹部膨隆等癥狀且小鼠腹部超聲結(jié)腸見癌結(jié)節(jié)，提示造模成功。共有51只小鼠造模成功，腫瘤發(fā)生率60%（51/85）。將UCAC小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（11只）、水飛薊賓組（10只）、參黛清腸湯低劑量組（10只）、參黛清腸湯中劑量組（10只）、參黛清腸湯高劑量組（10只）。

1.5 實驗給藥 水飛薊賓組小鼠給予水飛薊賓（生理鹽水溶解）灌胃，36 mg/kg；參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠給予參黛清腸湯（生理鹽水溶解）灌胃，給藥劑量分別為15、30、60 mg/kg，空白組、模型組小鼠給予生理鹽水灌胃，各組小鼠灌胃體積均為1 mL/100 g，1次/d，連續(xù)4周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠一般情況 每天觀察小鼠飲水、進食、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)、大便、活動度等一般情況。

1.6.2 小鼠疾病活動指數(shù)（disease active index，DAI）變化 根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化與糞便性狀進行評分。與造模成功后體質(zhì)量比較，藥物干預(yù)小鼠體質(zhì)量下降≤1%，計0分；下降＞1%且≤5%，計1分；下降＞5%且≤10%，計2分；下降＞10%且≤15%，計3分；下降＞15%，計4分。小鼠糞便性狀正常，計0分；軟便但成型，計2分；軟便不成型，計3分；腹瀉，計4分。根據(jù)小鼠體質(zhì)量下降率、糞便性狀評分計算小鼠DAI。

1.6.3 HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 藥物干預(yù)結(jié)束24 h后，頸椎脫臼法將小鼠處死，解剖并由回盲瓣至肛門分離其全部結(jié)腸，截取潰瘍、腫瘤處病變腸段，若無潰瘍及腫瘤則取紅腫糜爛明顯處腸段，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，脫蠟，組織切片（4 μm），常規(guī)蘇木素、伊紅染色，封片，顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.6.4 TUNEL法檢測小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況 取石蠟切片，嚴(yán)格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書步驟進行操作。主要操作如下：切片脫蠟、水化，蛋白酶K工作液消化，磷酸鹽緩沖液清洗，依次加末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal transferase，TdT）與熒光素標(biāo)記脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP）混合反應(yīng)液和封閉液，暗濕盒中反應(yīng)，漂洗，加DAB底物，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下隨機選取5個視野觀察，記錄陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6.5 MTT法檢測小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況 分離小鼠結(jié)腸癌組織塊（空白組取相近部位組織塊），去除血塊、結(jié)締組織及壞死組織，剪碎至糊狀。200目尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100pg/mL鏈霉素的改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。細(xì)胞密度達80%后傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)期結(jié)腸癌細(xì)胞，以1×105個/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h后，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，每孔加DMSO 150 μL，微振蕩10 min。選擇波長490 nm在酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度（A）值。實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞增殖抑制率，腫瘤細(xì)胞增殖抑制率（%）＝1-（實驗組A值/空白組A值）×100%。

1.6.6 RT-qPCR檢測小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達 取小鼠病變結(jié)腸組織，試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA，嚴(yán)格按照說明書步驟操作，測RNA濃度、純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），根據(jù)2×SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，雙蒸水7 μL，配制PCR反應(yīng)體系，上樣（3個平行孔）進行熒光定量PCR反應(yīng)，程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次，以內(nèi)參基因β-actin Ct值計算目的基因相對表達量。采用DNAMAN軟件設(shè)計引物，序列見表1。

表1 引物序列

1.6.7 Western blotting法檢測小鼠結(jié)腸組織PI3K/Akt-mTOR通路相關(guān)分子及Bcl-2、Bax蛋白表達 提取小鼠病變結(jié)腸組織總蛋白，上樣進行蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗孵育，洗膜，加HRP標(biāo)記二抗孵育，洗膜，加顯影液于凝膠成像系統(tǒng)下曝光，光密度掃描儀檢測目的蛋白光密度，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度/GAPDH光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，兩樣本比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及DAI評分變化 空白組小鼠飲水、進食量正常，反應(yīng)敏捷，體質(zhì)量隨時間增加，毛發(fā)光澤，大便成型、規(guī)律，活動自如，無小鼠死亡。模型組小鼠飲水、進食量明顯減少，精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)粗糙無光澤，大便稀軟出現(xiàn)膿血便，懶動。模型組中2只小鼠因嚴(yán)重便血死亡。與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠飲水、進食量、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)光澤、大便及活動度等均不同程度改善。水飛薊賓組灌胃時不慎死亡1只，參黛清腸湯低、中劑量組灌胃時各不慎死亡1只，參黛清腸湯高劑量組無小鼠死亡。

與空白組比較，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠DAI評分均明顯降低（P＜0.05），且參黛清腸湯的作用呈劑量依賴性；參黛清腸湯中劑量組小鼠DAI評分與水飛薊賓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠DAI 評分比較（）

表2 各組小鼠DAI 評分比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊賓組比較，cP＜0.05；與參黛清腸湯低劑量組比較，dP＜0.05；與參黛清腸湯中劑量組比較，eP＜0.05

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化情況 空白組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞均勻飽滿，未見炎癥細(xì)胞浸潤和病變；模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮脫落，腺體萎縮，潰瘍大且數(shù)量多，上皮內(nèi)瘤變，部分出現(xiàn)浸潤癌；參黛清腸湯低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)部分破壞，結(jié)腸黏膜充血腫脹，出現(xiàn)低度不典型增生、淋巴濾泡及少量癌變；水飛薊賓組和參黛清腸湯中劑量組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，潰瘍數(shù)量較少，部分出現(xiàn)低度不典型增生、淋巴濾泡及癌變；參黛清腸湯高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，潰瘍數(shù)量極少，部分出現(xiàn)低度不典型增生。（見圖1）

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯增多（P＜0.05），且參黛清腸湯的作用呈劑量依賴性；參黛清腸湯中劑量組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量與水飛薊賓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3、圖2）

表3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量比較（）

表3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊賓組比較，cP＜0.05；與參黛清腸湯低劑量組比較，dP＜0.05；與參黛清腸湯中劑量組比較，eP＜0.05

2.4 各組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率比較 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率均明顯升高（P＜0.05），且參黛清腸湯的作用呈劑量依賴性；參黛清腸湯中劑量組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率與水飛薊賓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率比較（）

表4 各組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與水飛薊賓組比較，bP＜0.05；與參黛清腸湯低劑量組比較，cP＜0.05；與參黛清腸湯中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對表達量比較 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05），Bax mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Bax mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），且參黛清腸湯的作用呈劑量依賴性；參黛清腸湯中劑量組PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對表達量與水飛薊賓組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。6組小鼠結(jié)腸組織Akt mRNA、mTOR mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 相對表達量比較（）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 相對表達量比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊賓組比較，cP＜0.05；與參黛清腸湯低劑量組比較，dP＜0.05；與參黛清腸湯中劑量組比較，eP＜0.05

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K/Akt-mTOR通路相關(guān)分子及Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），Bax蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組和參黛清腸湯低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Bax蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），且參黛清腸湯的作用呈劑量依賴性；參黛清腸湯中劑量組小鼠結(jié)腸組織PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量與水飛薊賓組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。6組小鼠結(jié)腸組織Akt、mTOR蛋白相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3、表6）

表6 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K/Akt-mTOR 通路相關(guān)分子及Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量比較（）

表6 各組小鼠結(jié)腸組織PI3K/Akt-mTOR 通路相關(guān)分子及Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊賓組比較，cP＜0.05；與參黛清腸湯低劑量組比較，dP＜0.05；與參黛清腸湯中劑量組比較，eP＜0.05

3 討 論

UC是UCAC發(fā)病的獨立危險因素之一[8]。UCAC發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。其發(fā)生過程涉及“炎癥-非典型增生-癌變”；腸黏膜抗炎癥細(xì)胞因子、促炎癥細(xì)胞因子分泌異常，引起腸黏膜免疫系統(tǒng)失衡；炎性因子刺激介導(dǎo)腸黏膜發(fā)生持續(xù)、慢性炎癥反應(yīng)，損害腸道黏膜，導(dǎo)致“不典型增生”及“癌變”的發(fā)生。因此尋找高效、低毒的藥物治療UCAC具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UCAC歸屬“痢疾”范疇，病機為穢濁之氣壅塞于腸，氣血搏結(jié)日久，致脈絡(luò)損傷，氣滯血瘀，氣血凝滯，腐敗化膿，耗脾損腎。氣、血、熱、濕、瘀、毒雍滯于腸道，形成癌毒。本病以脾腎虛為本，氣血熱濕瘀毒為標(biāo)[9]。參黛清腸湯中青黛具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚之功效，白及具有收斂止血、消腫生肌之功效，黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之功效，兒茶具有活血止痛、收濕斂瘡、止血生肌之功效，黃連具有瀉火解毒、清熱燥濕之功效，地榆具有解毒斂瘡、涼血止血之功效。諸藥共奏清熱泄?jié)峤舛局?，以治“痢疾”之根本?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青黛提取物可促進結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞增殖、膠原積累，促進結(jié)腸潰瘍愈合，抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[10-12]；白及提取物可抑制機體炎癥水平，恢復(fù)機體免疫平衡，還可抑制癌細(xì)胞增殖，抑制裸鼠瘤質(zhì)量，具有抗腫瘤活性[13-14]。

水飛薊賓是一種多酚類黃酮素，具有抗氧化、肝臟保護等功效，對UC患者結(jié)腸黏膜炎癥具有顯著抑制作用。近年研究顯示，水飛薊賓可降低UCAC的發(fā)生率[15]。故本研究采用水飛薊賓作為陽性對照藥物。本研究采用“DSS+AOM”復(fù)合法制備UCAC小鼠模型，具有操作簡便、周期短、成瘤率高、模擬性好等優(yōu)點。造模期間，UCAC模型小鼠出現(xiàn)精神萎靡、大便稀溏、便血、體質(zhì)量下降、毛發(fā)無光澤、蜷縮喜臥等癥狀；造模結(jié)束后小鼠腫瘤發(fā)生率約60%，與既往報道相符[16]。UCAC小鼠經(jīng)水飛薊賓和低、中、高劑量參黛清腸湯干預(yù)后，小鼠飲水、攝食、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤、活動、大便等均不同程度改善，DAI評分降低，結(jié)腸黏膜組織病理損傷和癌變程度減輕。結(jié)果提示參黛清腸湯可以改善UCAC小鼠一般情況，減輕結(jié)腸黏膜組織損傷和癌變程度。

PI3K/Akt-mTOR信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡、自噬等生命活動的重要信號途徑之一，可通過影響下游信號效應(yīng)分子表達、活化狀態(tài)發(fā)揮促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵作用。PI3K是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）的重要激酶，可催化其產(chǎn)生磷酸肌醇三磷酸（PI3P），PI3P能與Akt結(jié)合并使其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)膜；Akt被磷酸化激活后能通過直接、間接兩種途徑激活下游靶分子mTOR，經(jīng)系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞生長[17]。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制分子，Bax是細(xì)胞凋亡促進因子，兩者均為Akt下游效應(yīng)分子。因此PI3K/Akt-mTOR信號通路的激活、抑制可影響細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax等的表達[18]。DAI J H等[19]研究表明，AG1301可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。KIM J等[20]研究證實，艾蒿乙醇提取物可抑制PI3K/AKT/mTOR通路，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡并抑制其生長、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，UCAC小鼠經(jīng)水飛薊賓和低、中、高劑量參黛清腸湯干預(yù)后，結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，結(jié)腸組織PI3K、Bcl-2的mRNA和蛋白表達下調(diào)，p-Akt、p-mTOR蛋白表達下調(diào)，Bax的mRNA和蛋白表達上調(diào)。結(jié)果提示參黛清腸湯可抑制PI3K表達及AKt、mTOR磷酸化激活，抑制PI3K/Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2表達，上調(diào)促凋亡因子Bax表達，從而促進UCAC小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，參黛清腸湯可改善UCAC小鼠一般情況，減輕結(jié)腸黏膜組織損傷和癌變，促進結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗UCAC的作用。其機制可能與抑制小鼠結(jié)腸組織PI3K、Bcl-2表達和Akt、mTOR活化，促進Bax表達，抑制PI3K/Akt-mTOR信號通路有關(guān)。