含馬兜鈴酸中藥的毒性與毒理學(xué)研究進(jìn)展

黃春華，向微，汪思齊，王一凡，樓迪棟

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省法醫(yī)中藥毒理學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

馬兜鈴酸（Aristolochic Acids, AAs）是一系列結(jié)構(gòu)相似、天然存在于馬兜鈴科植物中的硝基菲羧酸類化合物，主要毒性成分為8-甲氧基-3,4-亞甲二氧基-10-硝基菲-1-甲酸（馬兜鈴酸I，也稱馬兜鈴酸A，AAI），有明確的腎毒性、致突變性及致癌性。馬兜鈴科植物主要分布于熱帶和溫帶地區(qū)，我國大部分地區(qū)均有分布。 該科多種植物在世界各地作為傳統(tǒng)藥物，用于治療關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、毒蛇咬傷等，如美洲的蛇根馬兜鈴、印度的印度馬兜鈴。 我國常見的馬兜鈴科植物來源藥材有關(guān)木通、廣防己、馬兜鈴、青木香、細(xì)辛和杜衡等，含AAs 的中成藥有龍膽瀉肝丸（含關(guān)木通）、分清五淋丸（含關(guān)木通）、冠心蘇合丸（含青木香）、復(fù)方蛇膽川貝散（含馬兜鈴）等，后來部分中成藥已將其中包含的AAs 組分替換掉， 如龍膽瀉肝丸用木通科木通替代了關(guān)木通。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2017 年公布的結(jié)果，可能含有AAs 的馬兜鈴科藥材共計(jì)24 種，已上市的中成藥共計(jì)47 種。

因AAs 中毒而造成的急、慢性腎小管間質(zhì)疾病被稱為馬兜鈴酸腎?。ˋristolochic Acid Nephropathy，AAN），表現(xiàn)為腎小管變性、萎縮、壞死和廣泛的腎間質(zhì)纖維化，且與上尿路上皮癌高度相關(guān)。 中毒的原因包括濫用、誤用以及長(zhǎng)期服用含AAs 的中草藥，以及食品、環(huán)境被AAs 污染而造成的蓄積中毒，后者主要見于巴爾干地區(qū)的農(nóng)村。 20 世紀(jì)90年代初期，比利時(shí)逾百名婦女因服用了含廣防己的減肥藥“苗條丸”而罹患AAs 腎病，并快速進(jìn)展為腎衰竭。 此后，在英、法等國也相繼發(fā)現(xiàn)了類似的病例。 21 世紀(jì)初期，國內(nèi)發(fā)生了多人因長(zhǎng)期服用龍膽瀉肝丸而致腎損傷、腎衰竭的事件，因而引發(fā)的藥品糾紛曾被稱為“藥品侵權(quán)最嚴(yán)重、危害最廣的事件”。 不久，研究證實(shí)巴爾干地區(qū)流行的巴爾干腎病也是因AAs 暴露造成的。 因上述一系列事件，AAs 及含AAs 的中草藥的毒性與毒理成為了相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并積累了一定的研究成果。 因此，本文對(duì)各種含AAs 的中草藥造成的中毒病例進(jìn)行搜集整理，并對(duì)其毒性與毒理學(xué)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期引起臨床及法醫(yī)毒物鑒定人員對(duì)相關(guān)中草藥的關(guān)注，并為含AAs 中藥中毒的診斷及鑒定提供參考。

1 馬兜鈴酸中毒事件

1.1 關(guān)木通中毒

國內(nèi)的AAs 中毒以關(guān)木通及含關(guān)木通復(fù)方、中成藥所造成的中毒居多。 關(guān)木通，別名木通馬兜鈴、東北木通等，為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴（Aristolochia manshuriensis Kom.）的干燥藤莖。 關(guān)木通味苦、性寒，功效為清心火，利小便，通經(jīng)下乳，用于熱淋澀痛，經(jīng)閉乳少等癥。 以木通為名者，有多種植物來源，除了關(guān)木通以外，還有木通科木通、三葉木通，以及毛茛科的川木通，品種頗為混亂。 20 世紀(jì)50 年代以后，關(guān)木通在市場(chǎng)上逐漸成為主流，凡用木通處多為關(guān)木通，而其余木通用量較少，因此，在藥典1990 年版所收載的龍膽瀉肝丸等方中將木通改為了關(guān)木通。 王智民等測(cè)得關(guān)木通生品及制品水煎劑小鼠灌胃LD分別為50.32 g·kg和226.62 g·kg，急性毒性小鼠的死亡時(shí)間主要分布于藥后48～72 h 之間。

關(guān)木通中毒的最早報(bào)道見于1964 年，吳松寒首次報(bào)道了2 例因服用木通馬兜鈴所造成的腎衰竭病例：一例是23 歲女性產(chǎn)后為通乳服用過量木通馬兜鈴而致急性腎衰竭、尿毒癥；另一例為產(chǎn)婦的公公（57 歲），因食用了與木通同煮的赤豆，一個(gè)多月后也出現(xiàn)了腎衰竭。 此后，河南、河北等地也出現(xiàn)了幾例木通馬兜鈴中毒案例，甚至致死的報(bào)道，但在當(dāng)時(shí)并未引起足夠的重視。 早期的關(guān)木通中毒基本是自服過量關(guān)木通所致，單次服用100～200 g，隨即出現(xiàn)上腹不適、惡心、嘔吐、腹脹等急性胃腸道反應(yīng)，繼而排尿異常、水腫，部分出現(xiàn)神志不清，入院后診斷為急性腎衰竭。 20 世紀(jì)90 年代以后，國內(nèi)多家醫(yī)院的腎內(nèi)科接診了多名服用龍膽瀉肝丸等含關(guān)木通中成藥而造成腎損害、甚至是尿毒癥的病人，其中北京中日友好醫(yī)院腎內(nèi)科在1998—2004 年間收治的此類病人超過了百例。 楊亞蕾等對(duì)1994—2020 年間的101 例關(guān)木通用藥不良反應(yīng)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，其中約半數(shù)為龍膽瀉肝丸不良反應(yīng)，除此之外還有分清五淋丸、甘露消毒丸、含關(guān)木通湯劑、散劑等，不良反應(yīng)以腎臟損害、消化系統(tǒng)損害為主，還涉及泌尿系統(tǒng)等。蔣艷偉等對(duì)關(guān)木通中毒死亡者進(jìn)行的尸檢顯示雙腎表面及切面未見異常，鏡下腎小管上皮細(xì)胞重度變性、壞死、脫落，形成裸基底膜，以近端腎小管病變較重，腎小管管腔內(nèi)見較多蛋白管型，腎間質(zhì)增寬、水腫，有輕度早期間質(zhì)纖維化。

1.2 廣防己中毒

廣防己為馬兜鈴科植物（Aristolochia fangchi Y.C. WuexL. D. Chou. et S.M. Hwang）的干燥根。 與木通相同，防己藥材也存在著品種混亂的問題，有馬兜鈴科的廣防己和漢中防己，還有防己科的粉防己和木防己。 胡世林等以小鼠灌胃LD為指標(biāo)對(duì)4 種防己的急性毒性進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)廣防己的急性毒性最大，LD為（25.1±6.4）g·kg，而漢中防己的急性毒性最小，LD為（258.0±20）g·kg，粉防己和木防己介于兩者之間，LD分別為（81.9±8.2）g·kg和（79.2±3.8）g·kg。

廣防己中毒主要見于國外的文獻(xiàn)報(bào)道，中毒原因基本為誤用。20 世紀(jì)90 年代初期，比利時(shí)發(fā)生了逾百例因服用中草藥減肥藥“苗條丸”而導(dǎo)致的特征性腎間質(zhì)纖維化，并快速進(jìn)展為腎衰竭的病例，約半數(shù)病人需要進(jìn)行腎移植。研究人員發(fā)現(xiàn)問題批次的“苗條丸”中沒有粉防己該有的粉防己堿，而含有AAs，并在需要腎移植的病人的腎組織中檢測(cè)到了AAs 與DNA 的加合物， 從而證實(shí)了問題批次“苗條丸”中的粉防己實(shí)為廣防己。 “苗條丸”廣防己中毒表現(xiàn)為早發(fā)的嚴(yán)重貧血、 輕度腎小管蛋白尿，半數(shù)病人血壓正常，腎臟組織病理檢查見廣泛寡細(xì)胞性腎間質(zhì)纖維化，伴腎小管萎縮及腎小球硬化，近半數(shù)病人后期罹患上尿路上皮癌。

1.3 青木香中毒

青木香，又名馬兜鈴根、獨(dú)行根等，為馬兜鈴科植物馬兜鈴（Aristolochia debilis Sieb. et Zucc）及北馬兜鈴（Aristolochia contorta Bge.）的根。古代青木香是木香的別稱，為菊科植物。 唐代出現(xiàn)的獨(dú)行根，曾充當(dāng)木香使用，因其性味作用有所區(qū)別，明代從木香中分出，以青木香之名使用。 李時(shí)珍在《本草綱目》中記載：“木香，草類也……昔人謂之青木香。 后人因呼馬兜鈴根為青木香，乃呼此為南木香、廣木香以別之?！蓖踅鹑A等對(duì)青木香生品和炮制品水提物小鼠灌胃LD進(jìn)行了測(cè)定，分別為146.45 g·kg和846.06 g·kg。

1995年何福開報(bào)道了1例口服鮮青木香150 g致急性腎功能衰竭的案例，患者聽信草醫(yī)以嚼服鮮青木香治蛇傷，隨后出現(xiàn)惡心嘔吐，食入即吐，繼則尿少，腹脹肢腫，入院診斷為急性腎衰竭、尿毒癥。后期青木香中毒的報(bào)道多為長(zhǎng)期服用冠心蘇合丸所致不良反應(yīng)。 冠心蘇合丸源于宋代太平惠民和劑局編寫的《太平惠民和劑局方》，由蘇合香、冰片、乳香、檀香和青木香組成，主要用于治療心絞痛、胸悶憋氣。史文慧等對(duì)102 例冠心蘇合丸相關(guān)腎損害進(jìn)行了回顧性研究，患者因冠心病或疑似冠心病而長(zhǎng)期服用冠心蘇合丸，其中明確確診為冠心病的有58 例，平均服藥時(shí)間為（8.45±7.55）年。冠心蘇合丸所致腎損害臨床表現(xiàn)均不典型，病情呈隱匿性發(fā)展，均伴有貧血，貧血程度與腎功能減退程度不平行，雙腎體積縮小，嚴(yán)重受損，且大小不對(duì)稱，結(jié)構(gòu)不清呈彌漫性改變。

綜上，含AAs 中草藥主要有以馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物為來源的藥材，而引起的中毒以馬兜鈴屬的關(guān)木通、廣防己和青木香最為常見。 除此之外，也有少量其他含AAs 中草藥引起的中毒， 如朱砂蓮、馬兜鈴，也是馬兜鈴屬來源藥材。 中毒原因主要是該類藥材單味藥大劑量服用造成的急性中毒，以及含該類藥材中成藥的長(zhǎng)期服用造成的慢性中毒。急性中毒表現(xiàn)為消化道刺激，有強(qiáng)烈胃腸道反應(yīng)，繼而出現(xiàn)腎功能急速下降，腎衰竭；慢性中毒表現(xiàn)為慢性腎損傷、腎功能逐漸減退，因起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)入衰竭期、終末期。

在細(xì)辛屬藥材方面，傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)其毒性有深刻認(rèn)識(shí)，自古即有“辛不過錢”之說。 但AAs 不是細(xì)辛屬藥材的主要毒性成分，因其而造成的AAs 中毒未曾見報(bào)道。袁金斌采用高效液相色譜法對(duì)關(guān)木通、廣防己、青木香、遼細(xì)辛等藥材中AAs 的種類及含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得關(guān)木通主要含有AAI 和馬兜鈴酸II， 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為3.57～3.82 mg·g和0.958～1.30 mg·g，此外還含有馬兜鈴酸C 和馬兜鈴酸D；廣防己主要含AAI，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.76 mg·g，其次為馬兜鈴酸D、馬兜鈴酸II 和馬兜鈴酸C；青木香主要含AAI，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.61 mg·g，其次為馬兜鈴酸II 和馬兜鈴酸C；遼細(xì)辛的AAI 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.5～125 μg·g，馬兜鈴酸D 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.8～73.5 μg·g，馬兜鈴酸C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.5～56.2μg·g?？梢?，從AAs 的含量來看，細(xì)辛屬藥材比馬兜鈴屬藥材低得多。 近日，研究人員通過對(duì)小鼠每天持續(xù)飼喂0.5 mg·kg低劑量的AAs，發(fā)現(xiàn)飼喂56 d 后小鼠出現(xiàn)腎小管間質(zhì)損傷，因而建議對(duì)于低AAs 含量的中藥（如細(xì)辛），應(yīng)注意使用劑量并盡量控制服藥時(shí)間少于一個(gè)月。

2 馬兜鈴酸毒理學(xué)研究

作為馬兜鈴科植物特有成分的AAs，早期曾有過短暫作為藥物開發(fā)的歷史，但其顯著的腎毒性、致突變性和致癌性很快為人所知，并且因?yàn)锳As 暴露造成的具有特征性病理表現(xiàn)而廣受關(guān)注。 近年來，AAs 與腎癌、肝癌等癌癥的關(guān)聯(lián)也成為了研究的熱點(diǎn)。 雖然AAs 家族多達(dá)幾十個(gè)成員，在馬兜鈴屬植物中有著不同的分布，但是普遍以AAI 的含量最高，是腎毒性的主要來源，與腺嘌呤A 形成的加合物可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，因而目前的大多數(shù)研究均以AAI 作為研究對(duì)象。

2.1 腎毒性分子機(jī)制

2.1.1 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

生理狀態(tài)下，細(xì)胞正常代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、活性氮（Reactive Nitrogen Species, RNS）對(duì)于維持機(jī)體多種生理功能有著重要作用。 但是ROS/RNS 的過量產(chǎn)生，或機(jī)體抗氧化能力減弱引起ROS/RNS 清除能力減弱，則誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。 細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究表明，AAI 暴露可誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的ROS/RNS 而發(fā)生氧化應(yīng)激。

YU 等使用不同含量的AAI 處理人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（HL-60）和人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后的細(xì)胞ROS 呈劑量依賴性升高，并通過激活MEK/ERK1/2 信號(hào)通路以及消耗細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）而導(dǎo)致DNA 損傷，產(chǎn)生細(xì)胞毒性； 而抗氧化劑鈦鐵試劑、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和谷胱甘肽（GSH）則對(duì)AAI 誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，有明顯的抑制作用，可降低AAI 導(dǎo)致的遺傳毒性。 ROMANOV 等的研究顯示，低劑量的AAI通過激活DNA 損傷檢查點(diǎn)通路ATM-Chk2-p53-p21 誘導(dǎo)G2/M 期細(xì)胞周期阻滯，而抗氧化劑NAC可在一定程度上抑制該通路的激活。 同時(shí)，AAI 激活絲裂原活化蛋白激酶ERK1/2 和p38，而抑制ERK1/2 和p38，或者用NAC 抑制ROS 生成均可一定程度緩解G2/M 期細(xì)胞周期阻滯。 ZHANG 等研究發(fā)現(xiàn)，AAI 可誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞ROS 水平升高，造成DNA 損傷和細(xì)胞早期凋亡，影響卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟，進(jìn)而干擾其減數(shù)分裂進(jìn)程和受精能力。YOUL 等研究了AAs 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926的作用，發(fā)現(xiàn)在AAs 暴露的EAhy926 細(xì)胞中胞內(nèi)ROS 水平明顯上升； 而添加抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸則對(duì)AAs 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有抑制作用。

POZDZIK 等通過對(duì)大鼠AAs 腎病模型的研究發(fā)現(xiàn)，AAs 腎病早期出現(xiàn)的有：氧化應(yīng)激、鈣黏蛋白缺失伴波形蛋白表達(dá)、基底膜裸露伴活化caspase-3 表達(dá)，以及腎小管細(xì)胞線粒體的損傷。MARIN 等比較了赭曲霉毒素A 和AAs 對(duì)斷奶仔豬肝腎氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)AAs 暴露仔豬肝腎的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）這3 種與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)酶的活性均顯著降低，而赭曲霉毒素A 暴露仔豬只出現(xiàn)了GPx 活性的降低；同時(shí)，不論是與對(duì)照組相比，還是與赭曲霉毒素A 組相比，AAs 組仔豬腎臟的脂質(zhì)過氧化水平顯著升高。Nox2 在腎臟中廣泛表達(dá)，是ROS 生成的主要來源，DECLèVES 等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AAs 中毒小鼠的Nox2 表達(dá)顯著升高，同時(shí)，另一種氧化應(yīng)激的標(biāo)志物（血漿和尿液中的過氧化氫）含量也顯著增加。 此外，DECLèVES 小組還研究了L-精氨酸對(duì)AAs 中毒小鼠的作用，結(jié)果顯示，L-精氨酸可有效降低Nox2 的表達(dá)，增加SOD的濃度而減少ROS 的生成，對(duì)AAs 中毒小鼠腎臟功能和組織結(jié)構(gòu)有改善作用。 QUAN 等將引起AAN的草藥以及AAs 分別飼喂C57BL/6 小鼠，對(duì)小鼠腎臟的8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和錳超氧化物歧化酶（MnSOD）含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不論是草藥組還是AAs 組，其8-OHdG 和MnSOD 水平均較對(duì)照組顯著升高，而草藥組和AAs 組之間并無顯著差別。 最近，GUO 等的研究結(jié)果顯示，人參環(huán)氧炔醇通過激活Keap1-Nrf2 信號(hào)通路抑制AAs 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而對(duì)AAs 導(dǎo)致的腎功能衰竭有緩解作用。

上述各項(xiàng)研究顯示，氧化應(yīng)激是AAs 腎毒性作用的前期環(huán)節(jié)與重要機(jī)制，而一些抗氧化劑的使用可以在一定程度緩解其毒作用，如人參環(huán)氧炔醇、褪黑素、維生素C等。

2.1.2 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

一系列體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，AAs 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 在ROMANOV 等的研究中，低劑量AAI 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激造成細(xì)胞周期阻滯，而高劑量AAI 則誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存活率隨著AAI 劑量的增加而降低。SHI 等研究發(fā)現(xiàn)，AAs 通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)并增加促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，從而誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）凋亡。 與之相應(yīng)地，XIE 等的研究中發(fā)現(xiàn)松弛素通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路可減少AAI 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡。ZHU 等的研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了AAI 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡。LIU 等研究發(fā)現(xiàn)，AAI 暴露誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的凋亡，細(xì)胞存活率下降，并且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性；在促進(jìn)凋亡的同時(shí)，AAI暴露后的NRK-52E 細(xì)胞還有線粒體功能障礙的表現(xiàn)。

ZHOU 等的一項(xiàng)研究報(bào)道：AAs 通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）的去磷酸化和p53 信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞（TECs）凋亡；AAs 暴露的野生型小鼠出現(xiàn)TECs 的大量凋亡和壞死， 而p53 缺陷型小鼠或使用p53 抑制劑可減輕TECs 的凋亡。YANG 等通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究了松弛素對(duì)AAI 引起腎損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示AAI 暴露的小鼠及人腎胚細(xì)胞293 中的促凋亡蛋白Bax 和活性形式caspase-3 高表達(dá)，抗凋亡蛋白Bcl-2 低表達(dá)，松弛素則可降低Bax 和活性形式caspase-3 表達(dá)，而提高Bcl-2 的表達(dá)。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)松弛素通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，增加eNOS 表達(dá)并抑制caspase-3 活化，對(duì)AAI 誘導(dǎo)的人腎胚細(xì)胞293 細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。WU 等的研究顯示：在體外實(shí)驗(yàn)中，雷帕霉素對(duì)于AAI 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡和G2/M 檢查點(diǎn)細(xì)胞周期阻滯有抑制作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素治療組小鼠血清肌酐和尿素氮較AAI 組明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著下降，腎小管萎縮減輕，腎小球數(shù)量增加。 JIN 等發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元可以上調(diào)AAI 暴露SD 大鼠的Bcl-2表達(dá)，下調(diào)其Bax 的表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡誘導(dǎo)因子AIF 的表達(dá)和Caspase-3 的活化，從而緩解AAI 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；通過增加線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白DRP1 和MFN2 的表達(dá)，緩解AAI 誘導(dǎo)的腎線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂；以及通過ULK1 介導(dǎo)的mTOR 通路抑制AAI 誘導(dǎo)的自噬。

因此，實(shí)驗(yàn)顯示AAI 暴露促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá)，而抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 AAI還可能通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，或激活p53 信號(hào)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 研究顯示，松弛素、雷帕霉素、薯蕷皂甙等對(duì)AAI 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定的干預(yù)作用，從而對(duì)AAs 誘導(dǎo)的腎損傷有一定的保護(hù)作用。

2.1.3 誘導(dǎo)炎癥與間質(zhì)纖維化

間質(zhì)炎癥是慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，炎癥與AAs 的毒作用機(jī)制密切相關(guān)。 1994 年，DEPIERREUX對(duì)33 例比利時(shí)AAN 患者的腎活檢標(biāo)本進(jìn)行了病理學(xué)觀察和分析，發(fā)現(xiàn)廣泛的腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮是最主要的病理改變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)大部分樣本存在不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。POZDZIK 等對(duì)大鼠AAs 暴露后炎癥反應(yīng)的變化情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)主要發(fā)生在壞死的腎近曲小管細(xì)胞區(qū)域；從暴露第3 天開始，觀察到壞死小管周圍間質(zhì)CD4+和CD8+ T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增加，并持續(xù)到觀察結(jié)束的第35 天，表明小管上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間存在著重要的相互作用。 POZDZIK 等對(duì)AAN 患者的組織病理學(xué)觀察顯示，髓放線和外髓質(zhì)中有大量巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并向皮質(zhì)迷路上部延伸。 DING 等研究發(fā)現(xiàn)，AAs 暴露的斑馬魚胚胎一系列促炎基因的表達(dá)上調(diào)，包括腫瘤壞死因子α（TNFα）、環(huán)氧合酶（cox2）、髓過氧化物酶（mpo），表明其誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。 JADOT等的研究中也檢測(cè)到AAs 暴露的小鼠促炎因子IL-6、IL-1β 和TNFα 的表達(dá)上調(diào)。 HONARPISHEH等通過對(duì)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)：AAs 暴露造成嚴(yán)重的急性腎小管壞死，然后誘導(dǎo)炎癥和纖維化的發(fā)生；細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示其毒作用機(jī)制與巨噬細(xì)胞的過度聚集和其表型的交替激活有關(guān)。NLRP3 炎性體是一種多蛋白復(fù)合物，其過度活化與多種炎癥性疾病相關(guān)，最近有報(bào)道顯示NLRP3 炎性體與AAs 的腎毒性有關(guān)。 該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸誘導(dǎo)BALB/c 小鼠和HK-2 細(xì)胞的NLRP3 炎性體異常激活；而利用IL-1Ra 抑制IL-1β 和NLRP3 炎性體活化，則可明顯減輕AAs 造成的腎小管損傷和腎功能損害。 研究人員通過對(duì)AAN 大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，早期的炎癥反應(yīng)發(fā)生在腎近曲小管上皮細(xì)胞壞死出現(xiàn)之后與間質(zhì)纖維化發(fā)生之前，因而推測(cè)炎癥反應(yīng)可能是連接兩者的橋梁。

纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的最終共同途徑，廣泛的間質(zhì)纖維化是AAN 的一個(gè)重要特征。 纖維化的特征是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞激活和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）大量沉積，腎臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，形成瘢痕組織。 研究人員通過Sirius Red 染色對(duì)小鼠AAN 模型腎間質(zhì)ECM 沉積的變化進(jìn)行觀察，研究顯示小鼠AAI中毒10 d 后腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯的ECM 沉積。 TGF-β 是促進(jìn)纖維化的關(guān)鍵因子，參與纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括促使基質(zhì)合成、抑制基質(zhì)降解及刺激成纖維細(xì)胞激活等。 多項(xiàng)研究證實(shí)， TGF-β 在AAN 中顯著上調(diào)。POZDZIK 等報(bào)道，在表達(dá)TGF-β的間質(zhì)區(qū)域中，出現(xiàn)波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽性細(xì)胞的積聚，標(biāo)志著管周成纖維細(xì)胞的增多及激活。 LI 等通過小鼠AAN 模型研究發(fā)現(xiàn)，AAI通過激活TGF-β1/Smads 信號(hào)通路誘導(dǎo)間質(zhì)纖維化。 ZHOU 等通過Smad3 基因敲除的小鼠和腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)和體外模型中驗(yàn)證了TGF-β/Smad3 信號(hào)通路在AAI 誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化中的重要作用。此外，AAI 能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9（Mmp9）的活化和表達(dá)，這表明AAI也參與了體內(nèi)腎纖維化過程中基質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變。YE 等的研究顯示，補(bǔ)體C3a 的激活也是AAI誘導(dǎo)炎癥和纖維化的途徑之一。近期，REN 等的研究顯示：在AAs 暴露的野生型小鼠中，Twist1 通過促使CD64巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的IL-1β，以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）在腎臟的積累而促進(jìn)纖維化的發(fā)生；而在Twist1 敲除小鼠中，這些作用都有所減弱，表明Twist1 參與了AAs 誘導(dǎo)的纖維化的發(fā)生。

2.2 致癌與致突變性

AAs 除了具有顯著的腎毒性以外，還有因其可以與DNA 形成加合物而具有致癌性及致突變性。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2008 年將利用馬兜鈴屬植物制作的草藥列為1 類致癌物，并將AAs 類物質(zhì)的天然混合物列入2A 類致癌物。 研究發(fā)現(xiàn)，AAI 在硝基還原酶的催化作用下生成環(huán)狀硝?；x子，所生成的氮正離子一部分轉(zhuǎn)化為馬兜鈴內(nèi)酰胺，進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞并蓄積于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生毒性作用，而另一部分則在還原過程中與DNA 中嘌呤核苷酸的環(huán)外氨基結(jié)合形成特異性的AA-DNA 加合物，誘導(dǎo)基因發(fā)生A:T 到T:A 的異位突變，進(jìn)而可能導(dǎo)致RAS、TP53 基因等腫瘤相關(guān)基因發(fā)生突變。

臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，AAN 與尿路上皮癌高度相關(guān)。 2000 年，NORTIER 等在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的研究顯示，39 例AAN 末期患者有18 例罹患尿路上皮癌。 CHEN 等以AA-DNA 加合物和TP53 特異性突變?yōu)闃?biāo)志物對(duì)我國臺(tái)灣地區(qū)151 例上尿路上皮癌患者進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中89 例檢測(cè)到AA-DNA 加合物，且這些患者檢出TP53 特異性突變的比率顯著增加。 近年來，AAs與其他癌癥之間的關(guān)聯(lián)也逐漸為科研人員所關(guān)注。2016 年，HOANG 等對(duì)我國臺(tái)灣地區(qū)的51 名腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行了AA-DNA 加合物的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)76%的患者（39 名）癌組織中檢測(cè)到了不同水平的AA-DNA 加合物。 2017 年，《科學(xué)》旗下子刊《轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》以封面文章形式報(bào)道了一項(xiàng)對(duì)不同地區(qū)肝細(xì)胞癌患者的分析報(bào)告，該報(bào)告指出含AAs 中草藥在亞洲地區(qū)的使用依然很普遍，是導(dǎo)致亞洲人群肝細(xì)胞癌的重要原因之一。但AAs 與肝細(xì)胞癌之間相關(guān)性的研究不及AAN 清晰透徹，還有待考證，因而該文章刊出后也引發(fā)了不小的爭(zhēng)議。 BARA等對(duì)20 篇有代表性研究AAs 致癌性的論文進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，認(rèn)為AAs 暴露增加了患上尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、胃癌和小腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，并與淋巴瘤生成有關(guān)。

3 結(jié)語

AAs 中毒在世界范圍內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，所波及的地域及人群廣泛，不僅服用含AAs 中草藥會(huì)造成AAs暴露，而且食物、環(huán)境受AAs 污染也會(huì)造成AAs 暴露。由于AAs 的腎毒性、致癌及致突變性，多個(gè)國家已經(jīng)禁止使用含AAs 的產(chǎn)品及制劑，我國藥典也已經(jīng)逐漸取消AAs 含量較高的關(guān)木通、廣防己、青木香等藥材的藥用標(biāo)準(zhǔn)，在2020 年版藥典中僅保留了細(xì)辛的藥用標(biāo)準(zhǔn)。 近年來，因含AAs 中草藥引發(fā)的醫(yī)療糾紛案件時(shí)有發(fā)生，如（2018）浙0303 民初1404 號(hào)、（2019）豫15 民終520 號(hào)、（2020）京0102民初27983 號(hào)等，其中有的案件涉及非法行醫(yī)（（2019）冀0203 刑初79 號(hào)），有的涉及藥品不良反應(yīng)的司法救助（（2020）遼0703 司救執(zhí)3 號(hào)）。 在這些案件中，含AAs 中草藥與中毒之間的因果關(guān)系是司法鑒定的關(guān)鍵。比利時(shí)“苗條丸”事件之后的近30年里，研究人員對(duì)AAs 及含AAs 中草藥進(jìn)行了大量的研究，尤其是通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)于AAs的腎毒性及毒作用的分子機(jī)制方面有了一定的認(rèn)識(shí)與積累。 對(duì)這些研究成果進(jìn)行整理有助于為該類糾紛的司法鑒定提供線索和證據(jù)，并對(duì)毒物管理和中毒防治提供參考。 但迄今為止，對(duì)于AAs 所造成的AAs 腎病還沒有有效的治療手段，對(duì)AAs 毒作用的機(jī)制也未完全明晰，有必要繼續(xù)進(jìn)行深入研究，以期為司法鑒定提供可靠依據(jù)，為臨床治療提供有效的控制手段。