唑來膦酸通過抑制Wnt5a介導(dǎo)的軟骨下異常骨吸收減輕大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎

丁 一，馬貴英，王麗梅，丁 冬，劉國強(qiáng)

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性、進(jìn)行性和退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，近幾年發(fā)病率呈上升趨勢[1]。在OA早期，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，軟骨下骨小梁丟失，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨響應(yīng)載負(fù)荷的生物力學(xué)功能改變，導(dǎo)致軟骨退變[2]。Wnt5a在某些疾病中具有雙向調(diào)節(jié)作用，它的表達(dá)與甲狀腺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)性，與黑色素瘤、胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)性[3]。另有研究表明，Wnt5a對Wnt3a既有促進(jìn)作用[4]，也有抑制作用[5]。因此，Wnt5a信號的功能是復(fù)雜的，在不同的微環(huán)境中結(jié)合不同的受體后，Wnt5a信號所發(fā)揮的生物學(xué)作用也不同。破骨細(xì)胞的分化受NF-κB受體配體(RANKL)/RANK/骨保護(hù)素(OPG)軸調(diào)控[6]，這一調(diào)節(jié)作用是否與Wnt5a共同參與早期OA的軟骨下異常骨吸收仍然不清楚。唑來膦酸(ZOL)具有抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收的功能。本文通過內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)法(DMM)建立大鼠膝OA模型，確認(rèn)OA早期的骨吸收時間窗，應(yīng)用ZOL干預(yù)DMM所致的SD大鼠OA模型作為陽性對照，檢測ZOL對軟骨下骨重塑、關(guān)節(jié)軟骨的退變及破骨細(xì)胞的活性等作用。為了進(jìn)一步明確其機(jī)制，本文檢測了Wnt5a信號以及RANKL等與破骨細(xì)胞形成相關(guān)的分子在早期OA中的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:健康8周齡雄性SD大鼠90只，質(zhì)量(287±12)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，scxk(寧)2020-0012。ZOL(諾華制藥，瑞士),光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)，恒冷式冰凍切片機(jī)(LEICA CM1850，德國)，Elisa試劑盒(聯(lián)碩，上海)。兔抗大鼠一抗：Wnt5a、RANKL(Proteintech，中國)，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(博士德，武漢)，番紅O-固綠染色試劑盒與抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(賽維爾，武漢)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒(全式金，北京)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理:將90只大鼠中的72只隨機(jī)分為Sham+PBS組、DMM+PBS組和DMM+ZOL組。分別于OA誘導(dǎo)后2、4、8、12周處死大鼠(n=6)，觀察ZOL對OA大鼠膝軟骨和軟骨下骨的影響。在此基礎(chǔ)上，將另外18只大鼠隨機(jī)分為與上述相同的3組(每組6只)，術(shù)后4周取材檢測，評價破骨細(xì)胞在OA早期的活化情況，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，應(yīng)用DMM方法建立大鼠OA模型[7]。切斷右膝的內(nèi)側(cè)半月板脛側(cè)副韌帶，將內(nèi)側(cè)半月板翻轉(zhuǎn)至股骨近端，然后逐層縫合創(chuàng)面。Sham+PBS組，大鼠僅暴露內(nèi)側(cè)半月板脛側(cè)副韌帶后縫合創(chuàng)面。為了觀察ZOL對軟骨下骨中破骨細(xì)胞的活性的影響，DMM+ZOL組于造模后次日予以ZOL腹腔注射 (100 μg/kg溶于1 mL PBS緩沖液)，每周2次，連續(xù)4周。Sham+PBS組和DMM+PBS組，均給予等量PBS緩沖液。

1.2.2 Micro-CT(μCT)檢測:將膝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，采用SKYSCAN1076掃描儀(掃描參數(shù)：像素10 μm，峰值管電壓40 kV，電流250 μA，旋轉(zhuǎn)角度0.6°)進(jìn)行三維CT成像。脛骨內(nèi)側(cè)平臺負(fù)重區(qū)域(前后范圍3.5 mm)被確定為感興趣區(qū)(ROI)，計(jì)算各組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)和連接密度(CD)。

1.2.3 組織形態(tài)學(xué)染色:獲取μCT圖像后，膝關(guān)節(jié)標(biāo)本在10% EDTANa2中脫鈣4周，石蠟包埋，沿冠狀面以5 μm厚切片，按照試劑盒說明進(jìn)行番紅O-固綠染色和TRAP染色。切片在二甲苯中脫蠟2次，20 min/次；用無水乙醇浸泡2次，5 min/次。固綠染色5 min，洗滌，脫水，番紅O染色2 min，光鏡下拍片后按照OARSI評分方法評估關(guān)節(jié)軟骨的退變程度[8]。切片在TRAP工作液中孵育2 h，蒸餾水沖洗3次，蘇木精染色3 min，光鏡下隨機(jī)選擇切片的5個區(qū)域，應(yīng)用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算代表軟骨下骨的骨吸收活性與破骨細(xì)胞表面占比(Oc.S/BS)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色:各組冠狀切片在4 ℃下與兔抗大鼠Wnt5a、RANKL(稀釋比例1∶200)孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3次，5 min/次，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗在37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液洗滌后加入DAB顯色后，蘇木素復(fù)染3 min。光鏡下隨機(jī)選取切片的5個視野拍照，并用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.2.5 RT-qPCR檢測:術(shù)后4周,每組取6只大鼠用過量戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死，去除關(guān)節(jié)軟骨，保留脛骨近端的軟骨下骨，按照試劑盒說明提取總RNA。應(yīng)用Transscript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Kits合成第一鏈cDNA，應(yīng)用Perfect StartTM Green qPCR SuperMix進(jìn)行RT-qPCR，具體引物序列如表1。反應(yīng)條件如下：94 ℃維持30 s，54 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)34 s，持續(xù)45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對相對基因表達(dá)水平進(jìn)行定量，內(nèi)參選擇β-actin。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 ZOL抑制DMM導(dǎo)致的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下異常骨重塑:膝關(guān)節(jié)μCT結(jié)果顯示，與Sham+PBS組比較，DMM+PBS組在術(shù)后4周時軟骨下骨吸收加快，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和CD降低，Tb.Sp增加(P<0.05)；8周時骨形成加快，BV/TV、Tb.Th增加，Tb.N和CD降低(P<0.05)。與DMM+PBS組比較，DMM+ZOL組在術(shù)后4周時骨吸收減輕，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和CD增加，Tb.Sp降低(P<0.05)；8周時骨形成延緩，BV/TV、Tb.Th降低(P<0.05)，見表2至表3。脛骨干骺端發(fā)生骨硬化，可能是由于ZOL抑制生長板中破骨細(xì)胞的活性而導(dǎo)致骨吸收減弱所致(圖1,封三)。

表2 2組大鼠術(shù)后4周時ZOL致DMM誘導(dǎo)的OA膝關(guān)節(jié)軟骨下骨變化的μCT檢測結(jié)果比較

表3 3組大鼠術(shù)后8周時ZOL致DMM誘導(dǎo)的OA膝關(guān)節(jié)軟骨下骨變化的μCT檢測結(jié)果比較

2.2 ZOL抑制DMM誘導(dǎo)的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的退變:軟骨退變發(fā)生在術(shù)后2～12周，并呈時間的依賴性。番紅O-固綠染色顯示，術(shù)后2周與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組的軟骨基質(zhì)和細(xì)胞的降解主要發(fā)生在軟骨淺層。隨著OA進(jìn)展，這些變化進(jìn)一步延伸到深層，并在4周時產(chǎn)生不規(guī)則的裂縫；8周時累及關(guān)節(jié)全層，潮線復(fù)制，這些變化在12周時變得更加明顯(圖2，封三)；DMM+ZOL組軟骨退變程度減輕，進(jìn)程延緩。術(shù)后各時間點(diǎn)OARSI評分顯示，與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組與DMM+ZOL組均增加(P<0.05)；與DMM+PBS組相比，DMM+ZOL組均減低(P<0.05)，見表4。

表4 3組大鼠OARSI評分比較(分，

2.3 ZOL抑制DMM誘導(dǎo)的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中早期破骨細(xì)胞的形成:TRAP染色顯示，與Sham+PBS組相比，DMM+PBS組在術(shù)后4周軟骨下骨中有更多的TRAP+的破骨細(xì)胞，而ZOL顯著抑制破骨細(xì)胞的形成(圖3，封三)。這一結(jié)果與μCT一致，支持ZOL抑制DMM誘導(dǎo)的OA早期破骨細(xì)胞活化造成的骨量減少，見表5。

表5 TRAP染色檢測ZOL抑制DMM誘導(dǎo)的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中破骨細(xì)胞形成情況比較

2.4 ZOL抑制膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中Wnt5a和破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá):為了從分子水平進(jìn)一步闡明OA早期破骨細(xì)胞異?；罨臋C(jī)制，用免疫組化檢測Wnt5a、RANKL的表達(dá)，用RT-qPCR檢測軟骨下骨中Wnt5a、RANKL、CXCL12、活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)、OPG、TRAP和組織蛋白酶K(CTSK)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色顯示，與Sham+PBS組比較，DMM+PBS組中Wnt5a和RANKL的陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.05)；與DMM+PBS組比較，DMM+ZOL組中Wnt5a和RANKL的陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。軟骨下骨的RT-qPCR結(jié)果顯示，ZOL抑制了DMM誘導(dǎo)的Wnt5a和破骨細(xì)胞生成基因的表達(dá)(P<0.05)，見表6。

表6 免疫組化染色檢測ZOL降低DMM誘導(dǎo)的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中Wnt5a、RANKL陽性率比較

3 討論

本研究旨在探索ZOL對OA進(jìn)展的影響及可能的分子機(jī)制，結(jié)果證實(shí)DMM可誘導(dǎo)SD大鼠形成OA，使膝關(guān)節(jié)OARSI評分增高。在OA早期，軟骨下骨異常與骨重塑表現(xiàn)為破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，骨量減少，Micro-CT和TRAP染色的結(jié)果均證實(shí)了這一點(diǎn)。ZOL可通過抑制OA早期破骨細(xì)胞的活性，減弱骨吸收，從而延緩OA的病程，減輕軟骨的退變。本研究結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞的異?；罨赡芘cWnt5a信號通路相關(guān)。

OA是一種慢性、進(jìn)行性、退變性疾病，病理表現(xiàn)以軟骨下異常骨重塑和關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘攸c(diǎn)。OA的分期和嚴(yán)重程度可以用OARSI評分來量化，這是OA軟骨組織病理學(xué)評估的一種標(biāo)準(zhǔn)方法[8]。與其他評分方法相比，OARSI評分可以揭示OA的早期病理改變，為基礎(chǔ)研究以及臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。既往的研究顯示，在前交叉韌帶離斷術(shù)(ACLT)所致 的OA模型中，術(shù)后1～2周即可發(fā)現(xiàn)骨小梁的丟失和軟骨的退變[9]。本研究結(jié)果顯示，在OA誘導(dǎo)后4周只有輕微的軟骨退化，這種差異性可能是因?yàn)槲覀兪褂肈MM法誘導(dǎo)了SD大鼠的OA模型所致。相較于ACLT，DMM是一種微創(chuàng)的方法，可以避免嚴(yán)重創(chuàng)傷、急性炎癥或免疫應(yīng)激對OA造成的干擾，更好地模擬退變性O(shè)A的慢性、進(jìn)行性的特點(diǎn)[10]。

OA是一種全關(guān)節(jié)疾病，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨形成一個結(jié)構(gòu)和功能單位，共同參與OA的病理進(jìn)程[11]。動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)，在OA早期軟骨下骨中存在骨囊腫，這是針對異常骨重塑的適應(yīng)性改變，這種改變與破骨細(xì)胞的活化相關(guān)[12]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，通過DMM誘導(dǎo)OA 4周后，軟骨下骨中破骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨吸收增強(qiáng)，骨量減少。ZOL對骨質(zhì)疏松癥的療效已在臨床得到證實(shí)，因此我們將ZOL在DMM誘導(dǎo)的SD大鼠OA早期予以干預(yù)，發(fā)現(xiàn)骨吸收被ZOL抑制，而且μCT、OARSI評分和TRAP染色均證實(shí)ZOL可減輕OA早期軟骨下骨中的異常骨吸收，減輕并延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，這或許是改善OA的一種治療策略。

最新的研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號通路參與了OA晚期的異常骨形成[13]。MAEDA等研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a缺陷的小鼠表現(xiàn)為骨吸收功能障礙[5]。與此相反的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a通過上調(diào)Lrp5/6的表達(dá)，啟動Wnt/β-catenin信號通路從而促進(jìn)成骨分化而抑制成脂分化[4]。Wnt5a在一些腫瘤疾病中也表現(xiàn)出雙重調(diào)節(jié)作用[3]。因此，我們推測在不同的微環(huán)境中，來源于不同細(xì)胞的Wnt5a結(jié)合差異性受體后形成不同復(fù)合物，從而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能。破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞中的單核-巨噬細(xì)胞系，通過分泌酸性蛋白酶類分解骨基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)骨吸收。破骨細(xì)胞的形成和活化與微環(huán)境中的細(xì)胞因子有關(guān)，包括RANKL、OPG、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和破骨細(xì)胞分化因子[14]。RANKL/RANK/OPG軸在破骨細(xì)胞形成過程中起著重要的調(diào)控作用。來自成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的RANKL與破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，隨后激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-κB、激活蛋白1(AP1)、NFATc1和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)相關(guān)的生物分子。這些下游因子的激活啟動了與破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，包括TRAP、CTSK、降鈣素受體(CTR)和MMP-9，最終形成成熟的多核破骨細(xì)胞[15]。OPG可以作為誘餌受體取代RANK并與RANKL結(jié)合，從而抑制成熟破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。C-X-C趨化因子配體12(CXCL12)主要來源于BMSCs，可與破骨細(xì)胞前體表面的C-X-C趨化因子受體4(CXCR4)結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞向骨吸收位點(diǎn)遷移[16]。這些與各自信號通路相關(guān)的生物分子，可能是調(diào)控破骨細(xì)胞形成和功能的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，DMM可上調(diào)OA早期Wnt5a的表達(dá)，協(xié)同增加RANKL的蛋白水平和破骨細(xì)胞形成相關(guān)的基因表達(dá)水平，包括TRAP和CTSK，而ZOL可以抑制這種效應(yīng)。這可能是由于ZOL抑制破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收，改變了軟骨下骨中的酸性微環(huán)境，間接抑制了RANKL的表達(dá)和Wnt5a介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成基因。

本研究中仍存在一些局限性。首先，本研究設(shè)置了四個時間點(diǎn)觀察OA早期軟骨下骨量的丟失和晚期OA的進(jìn)展，盡管如此，仍可能錯過OA進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵事件。其次，由于技術(shù)限制沒有追蹤同一個樣本的發(fā)展變化，如對活體樣本進(jìn)行μCT檢測，這也可以節(jié)約研究的樣本量。第三，缺少針對軟骨下骨中與骨吸收相關(guān)的特定效應(yīng)細(xì)胞的深入研究，包括細(xì)胞水平和Wnt5a信號分子水平，還需要今后進(jìn)一步完善此項(xiàng)工作。