脂肪源性干細胞在小鼠膝關節(jié)骨關節(jié)炎中的作用研究

白 冰，孫銘霞

(河北省承德市中心醫(yī)院骨科，河北 承德 067000)

傳統(tǒng)上，骨關節(jié)炎(OA)被認為是作為關節(jié)軟骨的逐漸磨損和撕裂。然而，最近的證據(jù)表明它是整個滑膜關節(jié)的炎癥性疾病，不僅包括機械退化關節(jié)軟骨，但也伴隨結構和整個關節(jié)的功能變化，包括滑膜、半月板(膝部)、關節(jié)周圍韌帶和軟骨下骨[1]。膝關節(jié)骨關節(jié)炎(KOA)是導致老年人殘疾的最常見的退行性疾病之一。流行病學研究表明，大約30%的成年人有OA的放射學跡象；8.9%的成年人有臨床意義的膝關節(jié)OA。另一項研究還表明，OA的可能性隨著年齡的增長而增加。中國的一項全國人口研究顯示，癥狀性KOA的總發(fā)病率為8.1%，并且KOA的患病率隨著年齡的增長而增加。KOA的治療可分為非手術治療或手術治療。非手術治療包括非藥物治療和藥物治療，非藥物治療包括所有OA患者的核心一線治療，包括教育、自我管理、運動和減肥。KOA的其他主要非藥物治療包括手杖和生物力學干預措施。藥物治療可能包括使用撲熱息痛、局部或口服非甾體抗炎藥(NSAID)或關節(jié)內皮質類固醇。外科手術是終末期KOA的最后手段，其中最有效的類型是全膝關節(jié)置換術和康復治療。由于OA病理過程得到了很好的描述，其中包括功能性軟骨細胞的喪失，幾種基于細胞的治療方法已經(jīng)成功開發(fā)包括骨髓刺激、自體骨軟骨移植物或同種異體移植物的植入(ACI)，和移植擴增的自體軟骨細胞或擴增的間充質干細胞(MSC)，均有助于恢復關節(jié)軟骨?；褐嘘P節(jié)內注射MSC一直是主要的基于細胞的方法，已經(jīng)證明了臨床有效性，并探索了再生和免疫抑制活性[2]。由于其非凡的治療能力，它仍然是研究和臨床開發(fā)的重要途徑。然而，多能MSC直接分化為軟骨細胞譜系的細胞導致了多種實驗策略來研究組織特異性MSC是否優(yōu)先用于關節(jié)軟骨的再生和維持。長期耐久性、增加的組織整合和比活性首先取決于更好的移植存活率和對惡劣環(huán)境的更好適應，這仍然是一個挑戰(zhàn)。迄今為止，尚缺乏供體樣本用于治療和修復退行性關節(jié)的MSC方面更有效。皮下脂肪組織是最容易獲得的來源。然而，在關節(jié)置換假體實施后，通常切除髕上和髕下脂肪墊，構成合適的自體脂肪組織來源的MSC，稱之為脂肪源性干細胞(ASC)。髕下脂肪墊或Hoffa脂肪墊是一種囊內但位于滑膜外的結構，位于膝關節(jié)髕骨下方、髕腱、股骨髁和脛骨平臺之間。髕上脂肪墊或股四頭肌脂肪墊位于關節(jié)囊和滑膜之間，排列在關節(jié)腔內，呈三角形并延伸穿過髕骨底部。研究已經(jīng)表明，源自OA模型中髕下墊的ASC的潛在再生能力[3]，與從皮下脂肪組織中獲得的細胞相比，免疫表型陽性基質細胞的百分比更高。然而，尚缺乏關于髕上組織再生能力的數(shù)據(jù)報道。此外，最近的報道還關注了Hoffa衍生細胞的作用，如炎癥細胞釋放或誘導釋放炎癥介質，表明髕下脂肪墊在KOA的發(fā)生和發(fā)展屬于活躍的連接組織[4～6]。脂肪源性干細胞(ASC)移植已被證明可以恢復退化的軟骨。本研究旨在探討髕上源性ASC自體移植對小鼠KOA模型中膝關節(jié)炎癥和軟骨退行性等級的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1ASC的分離及培養(yǎng):該研究納入了24名年齡在50至80歲之間且需要完全關節(jié)置換的患者。本試驗已得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會的批準，且患者均知情同意。留取外周血并分離血清。分離髕上或髕下區(qū)域的脂肪組織并存放至4℃無菌溶液中的密封容器中。脂肪組織在PBS和抗生素中多次洗滌以清潔組織并去除殘留的血液，每10g脂肪組織放置于含有溶液的培養(yǎng)皿中，溶液中含有PBS、100U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素、IA型膠原酶(0.07%，Sigma C9891 CA，美國)和中性蛋白酶I(0.2mM，Sigma)。使用無菌手術剪將組織切成小塊，移至密閉細胞燒瓶中并在37℃、20% O2、5% CO2的振蕩器中消化過夜。第2天，收集消化的脂肪組織，并用PBS和抗生素洗滌多次。細胞分為兩組，在含10%人血清的培養(yǎng)基或10%胎牛血清中生長(DMEM中含有2mM L-谷氨酰胺、30% Lglucose、100U/mL的青霉素和100ug/mL的鏈霉素)，孵育過夜。第2天，除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換，使附著的細胞生長至接近融合，然后進行細胞分化測定。

1.2ASC增殖分析:在每個樣品(髕上和髕下)的第3代，在10%人血清或10%胎牛血清培養(yǎng)基存在下，將104個細胞接種在24孔板中。

1.3ASC定向分化:第4代或之后的ASC進行定向分化、誘導脂肪生成、成骨和軟骨生成。所有定向分化培養(yǎng)基均來自Lonza(Lonza Co.，Switzerland)。

1.3.1脂肪細胞生成ASC:以10,000個細胞/cm2的細胞密度接種，當ASC融合>90%時，將生長培養(yǎng)基替換為含有胰島素、地塞米松、IBMX(3-異丁基-甲基-黃嘌呤)和吲哚美辛的分化培養(yǎng)基(脂肪干細胞基礎培養(yǎng)基；Lonza Co.)。然后將細胞在標準細胞培養(yǎng)條件下孵育12d。經(jīng)油紅O染色法鑒定脂肪形成。

1.3.2成骨ASC:以10,000個細胞/cm2的細胞密度接種在含有0.1uM地塞米松、50uM Asc2P和10mMμ-甘油磷酸(成骨基礎培養(yǎng)基；Lonza Co.)及10%人血清。ASC培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基中維持4周(每3天更換一次培養(yǎng)基)。經(jīng)茜素紅染色法鑒定成骨形成。

1.3.3軟骨形成在存在:TGF-β1和3(10ng/mL)、ASC的情況下，從最小體積(1×105個細胞/100μL)的高濃度細胞開始，從細胞“Micromass”進行ASC培養(yǎng)2P(50uM)和胰島素(6.25ug/mL)(Chondro BulletKit;Lonza Co.)4周，培養(yǎng)基每3天更改一次。經(jīng)阿爾辛藍染色法鑒定成軟骨形成。

1.4OA小鼠模型和細胞移植:12周齡的成年雄性C57BL6小鼠，單次注射含13U膠原酶II的5mM CaCl2溶液6μL，誘導雙膝出現(xiàn)嚴重OA。5d后，當誘發(fā)嚴重軟骨損傷的OA時，將所有動物分為4組(每組n=6)。對照組注射生長細胞培養(yǎng)液6μL;含105個細胞的6μL SVF或hASC(來自髕上脂肪墊)分別注射到SVF或hASC組。在PRP組中注射6μL混合富人血小板血漿(PRP)。所有關節(jié)內注射均通過使用連接至遠程輸注/撤回泵11 Elite nanomite可編程注射泵(Harvard Apparatus)的30G Hamilton注射器以6μL/min輸注速率進行。PRP是從所有患者的檸檬酸鹽管中收集的血液中分離出來的，并按照標準化方法制備。1個月處死所有動物，并收集膝關節(jié)。所有動物實驗均得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。小鼠腿在股骨干中部和脛腓骨中部分離并截骨以獲得整個關節(jié)。大多數(shù)附著在膝蓋周圍的結締組織，包括肌肉、韌帶和肌腱，都被移除，以防止對軟骨造成任何損傷。膝蓋組織用于組織學分析和定量糖胺聚糖(GAG)。上述過程未發(fā)現(xiàn)種屬排異反應。為了評估髕上來源的MSC在體外顯示的增加的細胞增殖和細胞分化特性是否在軟骨再生中具有功能上的有效性，在嚴重的OA小鼠模型中進行了體內細胞移植試驗。對于髕上衍生的人類ASC(hASC)的治療功效測試，通過在12周齡成年雄性C57BL6小鼠的雙膝關節(jié)內單次注射膠原酶II (13U)誘發(fā)嚴重OA。小鼠分為對照組、SVF、PRP和hASC組，注射5d后，發(fā)生軟骨破壞，將105 hASC或SVF或生長培養(yǎng)基(對照)注射到關節(jié)內腔內。已經(jīng)表明，越來越多地在常規(guī)臨床實踐中實施的PRP浸潤可以減輕疼痛并改善關節(jié)功能，顯著改善患者的生活質量[7,8]。因此，還向另一組動物注射PRP，以比較細胞移植與生長因子浸潤的再生效果。OA小鼠治療1周后，膝蓋的體積使用自動卡尺測量。

1.5GAG分析:稱重膝蓋組織，放置于2.5%木瓜蛋白酶溶液，65℃孵育過夜進行消解。將上清液與10% Alcian blue工作溶液孵育，該溶液中包含0.25% Triton X-100的18mM H2SO4，然后與解離溶液(包含4M鹽酸胍，0.375 Triton X-100的0.027M H2SO4溶液)孵育30min。將沉淀的GAG懸浮在8M鹽酸胍中，并在570nm處定量。平行制作硫酸軟骨素標準曲線。

1.6統(tǒng)計學方法:應用SPSS16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均值±標準差表示。多組間計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差(one way ANOVA)分析，兩組間比較采用SNK-p檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1髕上ASC成骨和軟骨形成體外實驗:為了進一步評估來自兩種脂肪組織來源(髕上脂肪墊和髕下脂肪墊)的干細胞特征，我們比較了兩種樣品之間的分化多能性。兩者都經(jīng)歷了誘導分化成脂肪細胞生成(圖1a)、成骨(圖1b)和軟骨(圖1c)生成。然而，分化的程度并不相同。與髕下衍生和髕下分化細胞相比，髕上衍生的ASC顯示出更高的成骨和軟骨形成潛力(圖1)。

圖1 髕上和髕下衍生的ASC的脂肪生成、成骨和軟骨

2.2髕上源性ASC顯著改善KOA小鼠的軟骨再生體內實驗:如圖2(a)所示，OA干預后所有四組的膝關節(jié)體積均顯著增加。然而，與對照組相比，hASC、SVF和PRP干預組在OA誘導后1個月均顯示出這種增加的體積顯著減少[圖2(a)]。該結果表明治療具有顯著的抗炎作用。然而，當我們通過量化GAG[圖2(b)]和OA損傷評分[圖2(c)]來檢查結構再生效果時，與對照組比較，當動物接受hASC治療時軟骨結構破壞后可再生，OA損傷評分降低。因此，PRP或SVF作為一種有效的抗炎劑，但干細胞的再生作用似乎不受PRP或SVF的影響。

圖2 功能性和結構性軟骨再生

3 討 論

基于ASC的療法已經(jīng)進行了安全性和有效性階段的測試[9]。然而，組織特異性干細胞將保證ASC修復能力的提高，例如提高軟骨修復的軟骨形成效率。在膝關節(jié)中，有兩個主要的ASC來源，即髕上脂肪墊和髕下脂肪墊。兩個脂肪墊通常在急性OA患者的膝關節(jié)置換術期間切除，并且是ASC的合適來源，用于其他受影響關節(jié)的自體治療。我們首次展示了OA小鼠模型中髕上源性ASC群體的再生能力。髕下墊衍生細胞被認為是膝關節(jié)OA發(fā)生和發(fā)展過程中的活躍關節(jié)組織，通過產(chǎn)生影響軟骨和滑膜代謝的炎癥介質來激活炎癥細胞。當我們在體外比較兩種衍生ASC的分化特性時，本研究顯示髕上衍生ASC的軟骨形成和成骨率有所提高，可有效解決關節(jié)退化的細胞治療[10]。這種差異的多能性使髕上脂肪墊成為軟骨組織修復的有希望的細胞來源。

本研究比較SVF和PRP治療動物的軟骨再生效率。有趣的是，治療組均表現(xiàn)出膝關節(jié)體積顯著減小。PRP含有多種生長因子，包括TGF-β、PDGF、IGF、bFGF、VEGF和EGF，具有合成代謝軟骨促進和軟骨保護特性[11]。大量的臨床前和臨床研究結果支持PRP是一種很有前途的軟骨修復和緩解癥狀的輔助治療方法，因為它對駐留細胞有合成代謝作用，并且具有抑制炎癥和緩解OA癥狀的潛力，并且具有臨床可接受的安全性[12]。PRP治療在骨缺損等其他相關組織的再生中顯示出額外的優(yōu)勢，表明PRP通過影響局部組織微環(huán)境，增強祖細胞募集和適當?shù)幕|沉積而發(fā)揮著至關重要的作用[13]。小鼠模型中，化學誘導的OA導致侵襲性關節(jié)退化。然而，即使在如此嚴重的情況下，ASC移植也降低了OA損傷評分并增加了軟骨樣組織，改變并挽救了關節(jié)內空間的功能解剖結構，為KOA的臨床研究提供了新的理論依據(jù)。