自噬和外泌體在肝纖維化中的研究進展

畢炯炯，馬英杰

(1.河南中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450003 2.河南中醫(yī)藥大學人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

肝纖維化被認為是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。在各種致病因素作用下，肝內(nèi)靜止的星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，形成纖維性疤痕，最終進展為肝硬化甚至肝癌，直接影響患者預后。因該過程具有可逆性，早期逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程對慢性肝病的治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，各種癌癥、慢性肝病、神經(jīng)退行性疾病、代謝相關(guān)疾病和免疫疾病的發(fā)病機制與自噬功能障礙或過度的自噬相關(guān)。自噬通量的增加可減緩肝纖維化進程，但二者間的作用關(guān)系仍存在爭議。同樣，在急性或慢性肝病的病理生理學過程中外泌體也發(fā)揮重要作用。外泌體可與自噬相互協(xié)調(diào)，通過溶酶體降解或直接釋放到細胞外來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在酒精性肝病動物模型中發(fā)現(xiàn)，自噬抑制以及自噬體和溶酶體功能受損與外泌體生成增多有關(guān)。同樣，外泌體有與自噬通量合作感知細胞穩(wěn)態(tài)的能力。因此，外泌體和自噬之間通過相互關(guān)聯(lián)來支持細胞存活，而這種關(guān)聯(lián)過程是維持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)，但其中的相關(guān)機制尚未被闡明。

1 HSCs與肝纖維化

肝纖維化主要是由于ECM過度沉積，其中HSCs激活是關(guān)鍵。生理狀態(tài)下，HSCs呈靜止狀態(tài)，位于肝竇周Disse間隙內(nèi)，是維生素A的主要儲存場所。肝損傷后，鄰近肝細胞通過旁分泌釋放大量細胞因子(如TGF-β、PDGF、IL-1β等)作用于HSCs，使其向肌成纖維母細胞樣表型轉(zhuǎn)化，導致HSCs增殖和激活,產(chǎn)生大量的ECM。同時，其自身還伴有TGF-β、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原、MMPs、TIMPs等細胞因子分泌的增加，促使HSCs在體內(nèi)持續(xù)激活，并通過其分泌的TIMPs抑制ECM的分解,從而促進肝纖維化，進一步加重肝損傷[1]?；罨腍SCs具有促炎和促纖維化特性。此外，HSCs激活后，其分泌的MMPs及其內(nèi)源性抑制劑TIMPs表達的不平衡也可影響肝纖維化進程。MMP家族負責ECM所有成分的逆轉(zhuǎn)和降解。其中MMP-12、MMP-19能促進纖維化，MMP-1、MMP-8、MMP-13具有抗纖維化特性，表達上調(diào)能促進肝細胞增殖，減輕纖維化。在肝纖維化過程中，HSCs的活化過程除了通過各種細胞因子誘導外，還與損傷刺激下誘導的各種信號通路有關(guān)，如TGF-β/Smads信號通路、NF-κB信號通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、Hedgehog信號通路等。深入了解影響HSCs活化的因素是肝纖維化防治的重要策略。

2 自噬與肝纖維化

自噬是一種存在于所有有核細胞中的分解代謝過程，具有高度的保守性，主要通過溶酶體降解細胞內(nèi)的大分子和細胞器，對細胞的生存、分化、生長及內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要意義。在肝纖維化過程中，自噬參與HSCs活化的機制逐漸被認識，其對HSCs可能具有雙重作用。

2.1通過參與脂滴降解，促進肝纖維化:自噬通過參與脂滴降解，為激活HSCs提供能量，增加ECM釋放，直接促進肝纖維化。在肝纖維化小鼠模型中，脂多糖誘導的自噬通過介導AKT-MTOR和AMPK-ULK1途徑，促使HSCs中自噬體形成和自噬通量增加，誘導脂滴消化，降低視黃醇水解成游離脂肪酸，進一步氧化，為激活HSCs提供能量，并下調(diào)Bambi的表達，增加HSCs對TGF-β的纖維化反應的敏感性[2]，促進纖維化。相反的，蝦青素被發(fā)現(xiàn)能抑制自噬，通過向下調(diào)控NF-κB的表達和翻譯，抑制HSCs能量供應，緩解肝纖維化[3]。因此，激活HSCs自噬可促進纖維化。

2.2通過抗炎作用，抑制肝纖維化:自噬也能負向調(diào)控HSCs的激活，通過抗炎作用，抑制肝纖維化。在CCl4誘導的肝纖維化模型中，自噬抑制劑3-MA可抑制NF-κB易位入核，降低炎癥細胞的浸潤和膠原的沉積，改善肝纖維化[4]。自噬與肝纖維化之間的作用關(guān)系仍存在爭議。此外，在肝纖維化進程中，因細胞類型的差異，自噬具有不同的特性。肝竇狀內(nèi)皮細胞(liver endothelial cells，LSECs)中自噬基因Atg7缺失導致細胞功能障礙，使其抗氧化應激能力下降，加重纖維化，但過度的自噬激活可導致caveolin-1降解，損傷LSECs的防御功能，最終促進纖維化化[5]。因此，LSECs中任何自噬失調(diào)都可能加重肝纖維化。自噬在肝纖維化過程中可能發(fā)揮促纖維化和抗纖維化雙重作用，選擇性調(diào)控纖維化細胞的自噬可能是未來抗纖維化治療新方法。

3 外泌體分泌與肝纖維化

外泌體是由晚期核內(nèi)體或多囊泡體的膜向內(nèi)出芽形成，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNAs、miRNAs和lncRNAs等多種載體，這些生物活性物質(zhì)能從供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞，從而調(diào)控受體細胞的生物學功能，并介導細胞間通訊。由外泌體介導的蛋白質(zhì)和miRNAs轉(zhuǎn)運是肝纖維化進程中的關(guān)鍵機制。在肝纖維化過程中，外泌體可介導并促進相鄰的HSCs、LSECs、Kupffer細胞和肝細胞之間細胞間通信的分泌功能，從而誘導HSCs的激活和遷移。外泌體的數(shù)量及種類會受到肝臟微環(huán)境改變的影響。大量研究證實HSCs可作為外泌體的受體細胞發(fā)揮作用。如：肝細胞外泌體miR-27a負向調(diào)控PINK1介導的線粒體自噬，促進HSCs的活化和增殖，從而加速代謝相關(guān)脂肪性肝病的纖維化。巨噬細胞外泌體miR-103-3p可被鄰近的HSCs吸收，并通過抑制KLF4因子促進HSCs的激活[6]。不同細胞來源的外泌體可通過調(diào)控自噬或者靶向調(diào)節(jié)信號通路等途徑，抑制HSCs活化，緩解肝纖維化。來自人骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來阻止HSCs的激活，降低α平滑肌肌動蛋白(SMA)和I型膠原蛋白的表達,減少膠原積累，抑制炎癥，增加肝細胞再生，從而改善肝功能，減緩肝纖維化[7]。脂肪源性間充質(zhì)干細胞的外泌體miR-181-5p通過抑制HSCs的活化，靶向作用于Stat3和Bcl2，從而增加自噬，減少TGF-β1誘導的肝纖維化進程[8]。NK細胞外泌體miR-223可以通過降低自噬基因Atg7水平，抑制自噬，從而阻止TGF-β1誘導的HSCs激活[9]。此外，HSCs也可作為外泌體的供體細胞。HSCs的外泌體miR-214可以穿梭于HSCs和肝細胞之間，調(diào)節(jié)小鼠原代肝細胞中的CCN2表達，而外泌體miRNA-199a-5p則靶向調(diào)節(jié)CCN2，抑制HSCs中纖維生成信號通路。目前關(guān)于HSCs作為外泌體供體細胞的作用以及這些外泌體對肝臟微環(huán)境影響的研究較少。

4 外泌體和自噬在肝纖維化中的關(guān)聯(lián)

自噬分子參與晚期核內(nèi)體的分布，外泌體的釋放以及核內(nèi)體轉(zhuǎn)運機制的組成也與自噬體的成熟有關(guān)。此外，外泌體不但可以通過封裝自噬蛋白作為載物來影響自噬水平，還可以通過介導相關(guān)信號通路，如mTOR信號通路、TGF-β1/Smads信號通路等參與自噬調(diào)控。同樣的，自噬通量增加會抑制外泌體的釋放并誘導其溶酶體降解。兩種途徑交叉調(diào)控，影響著各種疾病的發(fā)展，且環(huán)境依賴性是影響二者相關(guān)作用的關(guān)鍵因素。

4.1外泌體調(diào)控自噬：外泌體對自噬的影響取決于其親代細胞和刺激條件。二者可能協(xié)同作用來對抗細胞應激反應。在急性肝衰竭中應用人骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體可以顯著降低caspase-3和Bax的水平，并上調(diào)Bcl-2的表達，從而減輕肝細胞凋亡并促進自噬。脂肪源性間充質(zhì)干細胞外泌體可以通過激活自噬來改善肝纖維化。過表達的miR-29a可以通過降低LC3BII和p-ULK的水平來減輕自噬，從而減輕BDL小鼠的肝損傷和纖維化[10]。由此可見，外泌體可通過傳遞特定的miRNA調(diào)控靶細胞自噬，來促進疾病的病理生理學進程。目前尚未確定自噬受損的肝細胞是否會釋放特定的外泌體來影響肝纖維化進程。

4.2外泌體調(diào)控自噬相關(guān)信號通路

4.2.1mTOR信號通路：Zou[11]等發(fā)現(xiàn)mTOR作為mTOR信號通路的下游信號分子，直接負向調(diào)控細胞自噬的同時又能通過下調(diào)外泌體標記物來抑制肝細胞中的外泌體釋放。在不利條件下，mTOR通路受到抑制，外泌體與自噬均上調(diào)。Gao[12]等發(fā)現(xiàn)，PDGF及其下游信號分子SHP2能夠抑制mTOR內(nèi)源性抑制劑REDD1的表達，從而增強mTOR信號和外泌體釋放。相反，mTOR信號通過抑制自噬和激活ROCK1信號通路促進外泌體釋放。這些外泌體可誘導HSCs的遷移，導致促纖維化信號的放大。mTOR信號通路是抑制還是誘導外泌體分泌仍存在爭議，最終作用可能與靶細胞類型有關(guān)。此外，外泌體可以與自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子PI3K/Akt/mTOR或AMPK/mTOR通路相互作用，分別通過減少過度自噬或誘導自噬來促進細胞生存[13]。

4.2.2TGF-β1/Smads信號通路:TGF-β1是導致肝纖維化的重要細胞因子之一。外泌體可通過下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路來抑制自噬，改善肝纖維化。來自MSCs的外泌體miR-618通過負向調(diào)控Smad4來抑制肝纖維化的進展[14]。外泌體miR-122通過下調(diào)TGF-β1/Smad信號通路來抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[15]。過表達的miR-210能負向調(diào)節(jié)Smad4，增加缺氧/復氧誘導的原代肝細胞凋亡[16]。相反的，脂多糖處理的巨噬細胞外泌體中高表達的miR-500可靶向抑制MFN2，從而通過TGF-β/Smads信號通路促進HSC的增殖和活化，加速肝纖維化。血清外泌體miR-500可作為晚期肝纖維化診斷的生物標志物。

4.2.3Hedgehog信號通路:Hedgehog信號通路主要由Hh配體、蛋白受體Ptc與Smo、轉(zhuǎn)錄因子Gli組成[17]。由于自噬，凋亡的肝細胞可以釋放大量的Hh配體，這些配體與HSCs上的相關(guān)受體結(jié)合，最終激活Hh信號通路和HSCs，導致肝纖維化的發(fā)生。在原發(fā)性肝癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，Gli1誘導MIRLET7BHG轉(zhuǎn)錄的激活，上調(diào)Smo，并經(jīng)原發(fā)性肝癌來源的外泌體傳遞，介導hedgehog途徑激活HSCs，從而促進原發(fā)性肝癌的發(fā)生，為治療原發(fā)性肝癌提供了一條新的途徑[17]。

4.2.4其他信號通路：NF-κB信號通路多參與炎癥反應，而關(guān)于肝纖維化的研究較少?，F(xiàn)有研究認為下調(diào)NF-κB信號通路可抑制自噬，緩解肝纖維化。外泌體miR-378通過上調(diào)NF-κB通路促進肝纖維化的進展[18]。Wnt/β-catenin信號通路傳導與HSCs活化有關(guān)。在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，人類骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以通過Wnt/β-catenin信號通路抑制HSCs的活化，從而改善纖維化。外泌體miR-30a通過靶向Beclin-1信號通路抑制自噬，在心肌梗死和肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

4.2.5lncRNA/miRNA/自噬相關(guān)基因軸：外泌體lncRNAs可以通過lncRNA/miRNA/自噬相關(guān)基因軸或miRNA/自噬相關(guān)基因軸影響自噬水平，促進纖維化程度。Xie[19]等發(fā)現(xiàn)敲除原發(fā)性肝癌中高表達的lncRNA-SNHG7后，miR-29b表達下調(diào)，DN-MT3A表達上調(diào)，促進HSCs活化和自噬。這一結(jié)果提示lncRNA-SNHG7/miR-29b/DNMT3A軸參與了自噬誘導的肝纖維化。lncRNAs為肝纖維化的診斷和治療提供了更多的靶點。

5 小 結(jié)

在肝纖維化進程中，自噬和外泌體途徑都受到影響，不同肝細胞類型決定了自噬水平的上調(diào)或下調(diào)，從而表現(xiàn)出抗纖維化和促纖維化特性。同樣，外泌體介導的細胞通訊作用，也能夠通過激活受體細胞的不同信號通路改變其功能，影響HSCs的激活和遷移，調(diào)控炎癥反應、自噬以及氧化應激等，最終緩解肝纖維化的進展。兩者在纖維化過程中存在相互串擾和重疊，這種交叉調(diào)節(jié)關(guān)系仍存在爭議，而通過干預二者間共享的作用靶點，能否達到抗纖維化的放大效應尚未明了，有待繼續(xù)研究?，F(xiàn)階段關(guān)于外泌體調(diào)控自噬的研究，多集中在以miRNA調(diào)控自噬為主的基礎(chǔ)實驗上，深入研究發(fā)現(xiàn)lncRNA也可通過自噬影響肝纖維化進程，未來可繼續(xù)探討外泌體中其他生物活性物質(zhì)對自噬的調(diào)控作用，為肝纖維化的治療提供新的思路。