亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞抗氧化和細(xì)胞周期蛋白的影響

萬(wàn)鷹昕，張 平，李 楠

(北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023)

【關(guān)鍵字】亞硒酸鈉；白藜蘆醇；抗氧化；周期蛋白

據(jù)研究表明，肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，其中，80%以上為非小細(xì)胞肺癌[2]。硒是一種對(duì)機(jī)體具有生物活性調(diào)節(jié)能力的基本元素，也是生物所必需的微量元素。硒通過(guò)自身或中間產(chǎn)物來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷[3-4]。亞硒酸鈉具有腫瘤預(yù)防、化療增敏和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[5-6]。亞硒酸鈉還具有抗氧化、消除體內(nèi)的氧自由基與過(guò)氧化物、抗炎反應(yīng)、抗高血壓、抗重金屬等藥理作用[7-8]。亞硒酸鈉是目前應(yīng)用最普遍的硒強(qiáng)化劑，但其安全濃度范圍非常窄，高劑量對(duì)生物體有毒害作用。

白藜蘆醇是一種普遍存在于自然界的多酚類(lèi)化合物，近年研究表明，白藜蘆醇對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用，其藥理作用主要是抗氧化、抗自由基等方面，從而預(yù)防癌癥和心血管疾病[9-11]。但白藜蘆醇價(jià)格高，且單獨(dú)作用于肺癌細(xì)胞相對(duì)于亞硒酸鈉效果不明顯[12]。為減輕硒作用于癌細(xì)胞時(shí)的毒副作用，張平等人研究了亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用于肺癌細(xì)胞，結(jié)果表明與亞硒酸鈉單獨(dú)作用于肺癌A549細(xì)胞相比，25 μmol/L白藜蘆醇和亞硒酸鈉的聯(lián)合使細(xì)胞的存活率更低，且當(dāng)亞硒酸鈉濃度≥5 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，肺癌細(xì)胞的存活率明顯降低[12]。但相關(guān)機(jī)制還不清楚。為此，本論文研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞抗氧化性和細(xì)胞周期蛋白的影響，以便進(jìn)一步理解亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。亞硒酸鈉、白藜蘆醇、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA與不含EDTA)、DMEM/F12培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞凋亡分析試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Genview公司；微量谷胱甘肽(glutathione，GSH)測(cè)試盒、細(xì)胞丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測(cè)試盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測(cè)試盒，購(gòu)于南京建成科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱，為美國(guó) Thermo公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，北京百劍空氣凈化設(shè)備廠(chǎng)；TE2000-M倒置顯微鏡，購(gòu)于日本Nikon公司；BS110S型電子天平，美國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在進(jìn)行傳代過(guò)程中，PBS緩慢沖洗1～3次，勿吹起細(xì)胞，用胰蛋白酶酶解細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，底壁上約80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓粒狀，細(xì)胞間連接將要分離時(shí)，迅速吸掉胰酶溶液，避免胰蛋白酶處理過(guò)度。然后向100 mm×20 mm培養(yǎng)皿內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液4 mL，小心吹起皿底的細(xì)胞，盡量避免產(chǎn)生氣泡，再分裝。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組分為對(duì)照組、亞硒酸鈉組、白藜蘆醇組、亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用組。根據(jù)張平等人的研究[12]，本實(shí)驗(yàn)將亞硒酸鈉和白藜蘆醇的濃度定為2.0和25.0 μmol/L。對(duì)照組含A549細(xì)胞和無(wú)血清培養(yǎng)基。

1.3.3 四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)細(xì)胞活性A549細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，在96孔板中鋪板，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加配制好的受試物，處理24 h，吸棄廢液，添加MTT溶液處理4 h，再用DMSO處理10 min，最后用酶標(biāo)儀檢在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D(532)值,按下式計(jì)算A549細(xì)胞的存活率。

A549 細(xì)胞存活率=[D(532)實(shí)驗(yàn)組-D(532)空白組]/[D(532)對(duì)照組-D(532)空白組]

空白組為不含A549細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和活性氧將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成濃度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細(xì)胞懸液，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入受試物，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑盒進(jìn)行處理，最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；同樣，用檢測(cè)ROS的試劑盒進(jìn)行處理，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的ROS情況。

1.3.5 酶標(biāo)儀檢測(cè)谷胱甘肽、丙二醛的表達(dá)水平將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成濃度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細(xì)胞懸液，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入受試物，接著培養(yǎng)24 h。分別用檢測(cè)GSH、MDA試劑盒進(jìn)行處理，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)GSH、MDA的表達(dá)水平。

1.3.6 Western blot檢測(cè)P-Rb蛋白實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2，用藥物處理A549細(xì)胞后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，然后用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。上樣同樣質(zhì)量總蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗后，加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)P-Rb蛋白表達(dá)；用顯影儀掃描并拍照，對(duì)顯示的目的蛋白和相應(yīng)β-actin的條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶灰度的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)的形式表示，用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析判斷各處理組之間的差異顯著性，LSD Duncan法檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，并用Origin作圖軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對(duì)肺癌A549細(xì)胞存活率和凋亡率的影響

采用四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，2 μmol/L亞硒酸鈉單獨(dú)處理可使A549細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高(P＜0.01)；25 μmol/L白藜蘆醇單獨(dú)處理后細(xì)胞存活率和凋亡率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后，細(xì)胞的存活率降低至46.867%，且凋亡率上升至3.790%，相較于兩個(gè)單獨(dú)處理組，其存活率和凋亡率與對(duì)照組的差異性更為顯著(P均＜0.01)，這說(shuō)明聯(lián)用組能降低細(xì)胞的存活率，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

表1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇鈉對(duì)A549細(xì)胞存活和凋亡的影響

圖1 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞GSH和MDA表達(dá)水平的影響

2.2 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞GSH和MDA表達(dá)水平的影響

用酶標(biāo)儀檢測(cè)A549細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖1。亞硒酸鈉與白藜蘆醇單獨(dú)處理組GSH表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組較對(duì)照組和單獨(dú)處理組的GSH表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。

亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨(dú)處理組MDA表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組MDA表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)。結(jié)果表明，亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用后對(duì)細(xì)胞造成了一定的氧化損傷。

2.3 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞ROS水平的影響

亞硒酸鈉和白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞ROS水平的影響見(jiàn)圖2和表2。與對(duì)照組相比，亞硒酸鈉單獨(dú)處理可顯著增加A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05)，白藜蘆醇單獨(dú)處理可顯著降低A549內(nèi)ROS水平(P＜0.05)，而亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平與對(duì)照組和白藜蘆醇單獨(dú)處理組相比顯著升高(P＜0.05)，與亞硒酸鈉單獨(dú)處理組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用能導(dǎo)致ROS水平升高。

表2 不同組別A549細(xì)胞ROS和周期蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞周期蛋白P-Rb的影響

Rb是一種抑癌基因表達(dá)的蛋白，可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期G1期的檢驗(yàn)點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。Western blot檢測(cè)P-Rb蛋白的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖3和表2。與對(duì)照組相比，亞硒酸鈉組A549細(xì)胞的P-Rb蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，白藜蘆醇組A549細(xì)胞的P-Rb的表達(dá)水平與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組p-Rb的水平較對(duì)照組、亞硒酸鈉組和白藜蘆醇組單獨(dú)處理組均顯著降低(P＜0.05)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組別A549細(xì)胞ROS水平

圖3 Western blot檢測(cè)結(jié)果條帶

3 討論

亞硒酸鈉是一種對(duì)機(jī)體細(xì)胞有一定毒性作用的無(wú)機(jī)硒化合物，白藜蘆醇是從植物體內(nèi)提取出來(lái)的天然活性成分且在一定范圍內(nèi)對(duì)機(jī)體細(xì)胞無(wú)毒副作用。亞硒酸鈉(2 μmol/L)和白藜蘆醇(25 μmol/L)單獨(dú)處理A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率分別為77.43%和111.67%，但兩者聯(lián)合處理后，細(xì)胞存活率為46.87%。生物體供能的主要來(lái)源和合成ATP激素及許多生理活性所不可缺少的物質(zhì)都是氧。但機(jī)體在利用氧的同時(shí)，氧自身也發(fā)生了一系列反應(yīng)，生成包括超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等氧自由基或活性氧簇的ROS。而ROS生成后一般會(huì)被一些特定的酶類(lèi)清除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自由基生成過(guò)量或抗氧化防御系統(tǒng)受損時(shí)，ROS的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，導(dǎo)致ROS水平升高。ROS的大量堆積會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激或脂質(zhì)過(guò)氧化等，最終使細(xì)胞凋亡或死亡[13]。機(jī)體參與抗氧化作用的酶主要包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等。若這一機(jī)制受到損傷，則多余氧自由基就會(huì)直接作用于機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體損傷。當(dāng)各種致癌因素使氧自由基產(chǎn)生過(guò)量、機(jī)體抗氧化和修復(fù)機(jī)制受損時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的損傷，并導(dǎo)致各種腫瘤的產(chǎn)生。捕捉和清除自由基、保護(hù)DNA蛋白質(zhì)等生物大分子免受活性氧損害，才能抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的自由基清除劑，可以與細(xì)胞內(nèi)的自由基或超氧離子反應(yīng)，拮抗細(xì)胞的氧化損傷。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平的測(cè)定，可以反映出細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞內(nèi)MDA的表達(dá)水平了解細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而間接了解細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度。本研究結(jié)果顯示，亞硒酸鈉單獨(dú)處理后，A549細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平有所降低，MDA表達(dá)水平和ROS表達(dá)水平有所升高。白藜蘆醇單獨(dú)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平降低，而GSH和MDA表達(dá)水平的活力均無(wú)顯著性變化。亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后與亞硒酸鈉單獨(dú)處理相比，ROS表達(dá)水平有所上升，GSH表達(dá)水平降低和MDA表達(dá)水平升高。ROS在細(xì)胞中具有雙重的功能，其既能通過(guò)DNA損傷和線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也能通過(guò)激活其它信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存或死亡狀態(tài)。

細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞增殖和凋亡中起重要的作用。張平等[12]在研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺癌細(xì)胞的協(xié)同作用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用能夠阻滯肺癌A549細(xì)胞于細(xì)胞周期的G0/G1期。聯(lián)用組肺癌A549細(xì)胞P-Rb蛋白的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05)，這可能可以解釋聯(lián)用使肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞周期處于G0/G1期，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致肺癌A549細(xì)胞凋亡。

本研究分析和評(píng)價(jià)了亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨(dú)處理和聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞拮抗的效果，通過(guò)比較單獨(dú)處理和聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞存活和凋亡、GSH、MDA、ROS的檢測(cè)得出如下結(jié)論：與對(duì)照組相比，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)合降低了肺癌A549細(xì)胞的存活率，促進(jìn)其凋亡；同時(shí)，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)合應(yīng)用降低GSH的表達(dá)水平，增加MDA和ROS的表達(dá)水平。降低周期蛋白P-Rb的表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞于細(xì)胞S期。通過(guò)研究亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞的抗氧化性研究可以得出，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用。其機(jī)制可能與增加氧化損傷及降低P-Rb蛋白表達(dá)有關(guān)。