沙門氏菌中主要毒力因子的研究進展

劉理慧 儲錦華 隋雨欣 陳楊 程古月，2

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（武漢），武漢 430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室（HZAU）農(nóng)業(yè)部食品獸藥殘留檢測重點實驗室，武漢 430070）

沙門氏菌作為重要的致病菌之一，可以通過污染多種食物感染包括人類在內(nèi)的多種宿主。其血清型眾多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2 600多種血清型。沙門氏菌（Salmonella）的血清型分為邦戈爾沙門氏菌（S.bongori）和腸道沙門氏菌（S. enterica）兩個種，后者包括6 個亞種，除enterica亞種分離自溫血動物以外，其他亞種（salamae、arizonae、diarizonae、houtenae和indica）一般來自于冷血動物和環(huán)境。不同血清型的沙門氏菌對人和動物的致病性不同。沙門氏菌的致病性是由于大量毒力相關(guān)因子相互作用的結(jié)果，主要有毒力島毒力因子、質(zhì)粒毒力因子、結(jié)構(gòu)性毒力因子（包括菌毛和鞭毛）、腸毒素毒力因子等。本文綜述了沙門氏菌主要的毒力因子以及各自編碼的分泌系統(tǒng)和/或毒力基因及其功能，并討論了全基因組測序（WGS）預(yù)測沙門氏菌毒力的可行性，有助于了解沙門氏菌中各種毒力因子及相關(guān)基因在致病性中的分子特征和作用，便于從源頭上控制沙門氏菌病。

1 沙門氏菌毒力島毒力因子

沙門氏菌毒力島（Salmonella pathogenicity island，SPI）是一段含有毒力相關(guān)基因的、不穩(wěn)定的位于染色體上的DNA片段。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24 個SPI，研究最廣的為SPI-1-SPI-6以及SPI-19（表1）。其中，參與腸道感染階段的毒力基因位于SPI-1和SPI-2中，其余的SPI參與沙門氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活、菌毛表達、鎂和鐵攝取、多重抗生素耐藥性和全身感染發(fā)展等生理學(xué)過程［1］。

1.1 SPI-1

SPI-1大小為43 kb，含有47個基因，分別為invABCEFGHIJ、spaOPQRS、sicAP、iacBP、iagB、sitABCD、sprAB、prgHIJK、orgABC、avrA、sipABCD、sptP、sopABDD2EE2以及hilACD。其中有31個基因編碼一種III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）T3SS1，包括19個T3SS結(jié)構(gòu)基因（spaOPQRS、invACGJI、prgHIJK、sipBCD、orgAB）和 12 個 T3SS效應(yīng)基因（avrA、sipABCD、sptP和sopABDD2EE2）。調(diào)節(jié)SPI-1的基因有的位于SPI-1內(nèi)（如hilACD和invF）， 有 的 位 于 SPI-1外（ 如 rtsA、barA、sirA、csrA、leuO和fliZ等）。目前在與沙門氏菌致病力的相關(guān)性方面研究最多且最為清楚的基因有avrA、iacB、invB、sicA、sicP、sipABC、sptP，它們通過參與細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞，引發(fā)腸道炎癥及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的過程來影響沙門氏菌的毒力（表1）。

表1 沙門氏菌毒力島及其編碼的分泌系統(tǒng)、主要基因以及基因功能Table 1 Salmonella pathogenicity island and encoded secretion system，major gene，and gene function

續(xù)表（Continued）

目前，還有少數(shù)SPI-1基因的功能不太清楚。Lerminiaux等［19］發(fā)現(xiàn)SPI-1 TS33的效應(yīng)蛋白SopD影響多種信號和蛋白質(zhì)相互作用，并有助于沙門氏菌對宿主的感染以及胃腸炎的發(fā)展。此外，對SPI-1外的調(diào)節(jié)因子的研究也取得一定進展。人們發(fā)現(xiàn)SPI-1外的正調(diào)節(jié)因子loiA對負(fù)調(diào)節(jié)因子lon的抑制利于鼠傷寒沙門氏菌對小鼠腸上皮細(xì)胞的入侵和毒性的發(fā)揮［20］。谷氨酰胺合成酶基因glnA通過上調(diào)fliZ、hilA和 hilD 水平改善 SPI-1 相關(guān)效應(yīng)基因的表達，如sopA、sopB、sopD和 invF［21］。同時已發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物對SPI-1的調(diào)節(jié)有影響。氯化血根堿是一種假定的 SPI-1 抑制劑，可抑制沙門氏菌對宿主細(xì)胞的侵襲［22］。甲硫腺苷通過抑制 invF 和 sipB的表達降低沙門氏菌的毒力［23］。生物素 a 是紅三葉、卷心菜、苜蓿和其他一些草藥膳食補充劑中發(fā)現(xiàn)的主要異黃酮成分，可抑制sipA、sipB、sipC、hilA和hilD 的表達，并通過下調(diào) SPI-1 表達逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞極化［24］。這些化合物和藥物可能對沙門氏菌感染的宿主細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用并調(diào)節(jié)其殺菌活性，是有前景的新型抗沙門氏菌藥物。

1.2 SPI-2

SPI-2大小為40 kb，含有72個基因［25］，分別為 ssaBCDEGHIJKLMNOPQRSTUV、ssrAB、sscAB、sseABCDEFGHIJK1K2K3、pipBB2、steABCDE、sifAB、slrP、srgE、cigR、sspH1H2、srfJ、gtgAE、gogB、sopDD2、spiC、spvBCD、ttrABCRS以 及 7 個 功 能未知的開放閱讀框 orf32、orf48、orf70、orf242、orf245、orf319、orf408。其中有54個基因編碼另一個III型分泌系統(tǒng)T3SS2［26］，包括20個T3SS結(jié)構(gòu)基因（ssaBCDEGHIJKLMNOPQRSTUV），32個 T3SS效 應(yīng) 基 因（sseFGHIJK1K2K3、pipBB2、steABCDE、sifAB、slrP、srgE、cigR、sspH1H2、srfJ、gtgAE、gogB、sopDD2、spiC、spvBCD），2 個 T3SS 調(diào)節(jié)基因（ssrAB）。目前在與沙門氏菌致病力的相關(guān)性方面研究最多的基因為ssaBE、sscAB、sseLFG、ttr，它們與細(xì)菌引發(fā)宿主全身性感染和在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活及復(fù)制有關(guān)。最新研究表明，在發(fā)生氧化應(yīng)激的沙門氏菌中誘導(dǎo) SPI-2 基因有助于巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體對抗 NOX2 黃素血蛋白的抗菌活性，其依賴于DksA、DnaJ和 DnaK 蛋白的協(xié)調(diào)調(diào)控［27］。

以往的研究表明，沙門氏菌致病力的強弱和SPI-2中的sseL基因密切相關(guān)，致死率高的沙門氏菌均攜帶sseL基因，而致病力相對較弱的沙門氏菌則沒有檢出該基因［14］。由于基因存在水平轉(zhuǎn)移，細(xì)菌的致病性開始進化，Pérez-Morales等［28］證實SPI-2編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ssrB在細(xì)胞內(nèi)感染階段抑制SPI-1的表達，這有助于沙門氏菌向細(xì)胞內(nèi)生活方式的轉(zhuǎn)變。2020年，Jiang等［29］揭示了SPI-2外一種新的調(diào)節(jié)因子pagR，它可以通過上調(diào)SPI-2內(nèi)的調(diào)節(jié)因子slyA的表達而增強鼠傷寒沙門氏菌的系統(tǒng)毒性。

1.3 SPI-3

SPI-3大小為17 kb，包含sugR、rhuM、rmbA、misL、fidL、marT、slsA、cigR、mgtB和mgtC 10個基因，目前在與沙門氏菌致病力的相關(guān)性方面研究最多且最為清楚的基因為misL和mgtBC，它們與沙門氏菌在宿主的腸道定殖以及細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)。misL 過表達增加了鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成，misL缺失降低了細(xì)菌對 HeLa 細(xì)胞的黏附和侵襲能力，但不影響細(xì)菌毒力［30］。研究表明，毒力蛋白MgtC介導(dǎo)的磷酸轉(zhuǎn)運途徑是沙門氏菌正常發(fā)病機制所必需的，去除MgtC對磷酸轉(zhuǎn)運能力的影響會使沙門氏菌具有高致病性［31］。

1.4 SPI-4

SPI-4大小為27 kb，包含siiABCDEF 6個基因。目前的研究集中于siiE基因，它與沙門氏菌對宿主上皮細(xì)胞的黏附和侵襲有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)一些相關(guān)的臨床應(yīng)用價值，如siiE減毒缺陷型沙門氏菌可誘導(dǎo)特異性IgG的高持久滴度并可作為有效疫苗使用［32］。SPI-4可能攜帶參與毒素分泌的Ⅰ型分泌系統(tǒng)（Type I Secretion System，T1SS），當(dāng)其缺失時，鼠傷寒沙門氏菌對腸炎小鼠的口服毒力減弱［33］。

1.5 SPI-5

SPI-5大小為7.6 kb，包含pipABCD、sopB、sig-DE等基因，它們與沙門氏菌在宿主的腸道定殖有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)pipA可以通過T3SS非依賴性機制誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌系統(tǒng)感染階段的細(xì)菌傳播［34］。sopB基因是SPI-5上重要的毒力基因，其編碼的SopB蛋白可以特異性地阻止ASC寡聚，并抑制炎癥小體的產(chǎn)生［35］，同時介導(dǎo)Rho-GTPases向細(xì)菌入侵位點募集［36］。作為效應(yīng)蛋白SopB的同源物，SigD可以激活原癌基因akt，從而調(diào)控沙門氏菌在宿主細(xì)胞中的增殖和存活［37］。

1.6 SPI-6、SPI-19以及T6SS

SPI-6大小為59 kb，目前對編碼菌毛的saf和tcf基因的研究最多，它們有助于沙門氏菌在宿主中的成功定殖。SPI-19位于沙門氏菌染色體上，大小為45 kb，目前還沒有人對SPI-19上的基因進行系統(tǒng)研究。另外，SPI-6和SPI-19與Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥ secretion system，T6SS）密切相關(guān)，T6SS由13 個核心結(jié)構(gòu)蛋白（TssABCEFGJKLM、VgrG、Hcp及ClpV）組成［38］。到目前為止，編碼T6SS的5個SPI（SPI-6、SPI-19、SPI-20、SPI-21 和 SPI-22） 已經(jīng)差異分布在2 600多個沙門氏菌血清型中［39］。其中，鼠傷寒沙門氏菌需要以SPI-6/T6SS依賴的方式殺死共生細(xì)菌才能在腸道中成功定殖［40］，解除SPI-6/T6SS中H-NS組蛋白的沉默，將利于鼠傷寒沙門氏菌成功感染宿主［41］。此外，SPI-6 鼠傷寒沙門氏菌 VirG 樣蛋白（STV）作為LTxxQ應(yīng)激蛋白家族的一員通過協(xié)助病原體在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，在沙門氏菌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［42］。SPI-19多存在于雞白痢沙門氏菌血清變種中，含有SPI-19的雞白痢沙門氏菌在雞腸道的定殖增多［43］，這是由于SPI-19/T6SS參與介導(dǎo)宿主Th1和Th2免疫應(yīng)答的抑制，導(dǎo)致該菌的持續(xù)定殖。

2 其他毒力因子

除了SPI，沙門氏菌的毒力相關(guān)基因還分布在毒力質(zhì)粒、菌毛、鞭毛以及腸毒素中（表2），這些毒力基因也在宿主中發(fā)揮廣泛的生理作用。

表2 沙門氏菌其他毒力因子中主要的基因及功能Table 2 Major genes and functions in other virulence factors of Salmonella

2.1 毒力質(zhì)粒毒力因子

沙門氏菌毒力質(zhì)粒（Salmonella virulence plasmid）spv操縱子大小為6.8 kb，廣泛存在于臨床重要血清型沙門氏菌中，含有spvRABCD 5 個基因，主要與血清抗性、黏附與定居、沙門氏菌在腸外組織細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和生長等有關(guān)［55］。其中，spvB基因與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，可以干擾自噬和鐵穩(wěn)態(tài)［46］，還可以通過細(xì)胞旁途徑使細(xì)菌在宿主的腸上皮屏障中移位，促進沙門氏菌的系統(tǒng)傳播［44］。

2.2 結(jié)構(gòu)性毒力因子

在細(xì)菌感染過程中，菌毛對宿主的識別、定殖和生物膜的形成至關(guān)重要，被認(rèn)為是介導(dǎo)沙門氏菌與宿主腸上皮相互作用和黏附的主要細(xì)胞器，其主要包含agf、bfp、pil、fim等基因。

在腸道沙門氏菌用來定殖宿主組織的各種菌毛結(jié)構(gòu)中，Ⅰ型菌毛研究最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型菌毛表達水平的增加與沙門氏菌對腸上皮細(xì)胞黏附水平的提高直接相關(guān)［56］，其不僅表明Ⅰ型菌毛在沙門氏菌感染初期的重要性，還明確了其在感染過程中的確切作用。

沙門氏菌的鞭毛使其能在波動環(huán)境中前行［57］，其主要包含fliC、fljB、flpA等基因。Horstmann等［58］發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白甲基化后有助于鼠傷寒沙門氏菌黏附到宿主細(xì)胞表面進而定殖腸道引發(fā)宿主感染。

值得注意的是，鞭毛、菌毛和SPI-1 T3SS在細(xì)菌感染的各個階段是以嚴(yán)格定義的順序進行表達的。沙門氏菌經(jīng)口感染后，首先利用鞭毛移動到腸上皮細(xì)胞附近定殖腸腔，再利用菌毛進行細(xì)胞附著和腸黏膜定殖，最后利用SPI-1 T3SS進行入侵。

2.3 腸毒素

沙門氏菌的外毒素可分為細(xì)胞毒素和腸毒素兩種類型。其中stn基因是鼠傷寒沙門菌感染機制中一個較為重要的毒力因子，它可以通過調(diào)節(jié)OmpA膜的定位來維持細(xì)菌細(xì)胞膜的組成和完整性，從而增強菌株致病性［59］。當(dāng)菌株的stn基因發(fā)生突變時，小鼠的腸腔分泌能力明顯比野生菌株的弱［60］。

2.4 毒力基因與毒力的關(guān)系

毒力表示病原菌致病力的強弱，其最具實用性的測定方法是半數(shù)致死量（LD50）和半數(shù)感染量（ID50）。沙門氏菌的毒力主要是由于大量毒力因子相互作用的結(jié)果，諸多研究均證明了沙門氏菌的毒力與毒力基因存在一定聯(lián)系（表3）。不同國家、國內(nèi)不同省份（自治區(qū)，直轄市）的不同來源的沙門氏菌毒力基因攜帶情況具有差異，且一般菌株的致病性越強，其攜帶的毒力基因的種類和/或數(shù)量越多。

表3 國內(nèi)外沙門氏菌中毒力基因的流行情況及與毒力的關(guān)系Table 3 Prevalence of Salmonella virulence genes at home and abroad and their relationship with virulence

3 全基因組測序預(yù)測毒力

沙門氏菌的毒力主要是大量毒力因子相互作用的結(jié)果，由于不同的血清型在不同的位置包含不同的SPI集合，沙門氏菌基因組、血清型和毒力的高度多樣性從而增加了沙門氏菌感染的復(fù)雜性［69-70］。病原體的全基因組測序（WGS）已成為一種成本更低，更易于使用的基因分型工具，提供了許多基因分析的可能性。

WGS結(jié)合其他基因組學(xué)方法在研究食源性疾病暴發(fā)中的毒力方面具有極好的潛力。Crouse等［71］用不同感染模型的細(xì)胞和組織中的沙門氏菌載量衡量毒力水平，通過結(jié)合WGS、系統(tǒng)發(fā)育和泛基因

組研究預(yù)測33株未知毒力沙門氏菌分離株毒力水平高低，結(jié)果與體內(nèi)、外模型的結(jié)果具有較高一致性。有學(xué)者結(jié)合WGS、電子生物信息學(xué)方法以及流行病學(xué)數(shù)據(jù)，分析了775個沙門氏菌完整基因組中的129個毒力基因，對巴西沙門氏菌毒力基因的分布情況進行了研究并揭示了巴西沙門氏菌中耶爾森氏菌高致病性島（HPI）的存在［72］。基于高通量測序（NGS）生成的75個與人類沙門氏菌病相關(guān)的血清型的80個全基因組，Gao等［73］開發(fā)了一種靶向AmpliSeq程序，可用于沙門氏菌各種血清型的致病性和食源性沙門氏菌病的風(fēng)險評估。WGS 可在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)捕獲整個基因組，有可能區(qū)分密切相關(guān)的暴發(fā)毒株，鑒定毒力/耐藥基因。這些研究表明了WGS方法應(yīng)用于沙門氏菌食品安全實踐和疫情預(yù)測的可行性。

5 總結(jié)與展望

目前的研究已涉及到沙門氏菌的24個毒力島及4個分泌系統(tǒng)。其中，T3SS主要與SPI-1和SPI-2相關(guān)，T1SS可能存在于SPI-4中，T6SS目前多與SPI-6 和SPI-19聯(lián)系，由于毒力島及分泌系統(tǒng)會發(fā)生進化來幫助沙門氏菌適應(yīng)不同的生活方式和環(huán)境條件，是否存在其他潛在毒力島以及分泌系統(tǒng)仍是我們關(guān)注的問題。已有學(xué)者總結(jié)了沙門氏菌的24個毒力島在血清型中的分布情況［2］，但不同血清型間優(yōu)勢毒力島差異性以及毒力機制還需要進一步研究。近期研究表明，全基因組測序（WGS）可用于沙門氏菌毒力預(yù)測具有較高的準(zhǔn)確率。

另外，人和動物源沙門氏菌的耐藥性呈上升趨勢，并且人源沙門氏菌和動物源沙門氏菌存在一定的相關(guān)性［74］。對其耐藥性的機制已有諸多研究［75-76］。以往的研究表明沙門氏菌不同血清型具有不同耐藥特征［77-78］，且部分毒力基因與細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生存在一定聯(lián)系［79］，但具體機制仍需要進一步的研究。

鑒于畜禽產(chǎn)品藥物殘留和多重耐藥基因介導(dǎo)耐藥菌株不斷增加，沙門氏菌的全球負(fù)擔(dān)仍然是一個令人擔(dān)憂的問題。正在開發(fā)的沙門氏菌疫苗方法是一個有希望的跡象，同時疫苗的免疫防控是發(fā)展研究的熱點。目前針對沙門氏菌研究的疫苗主要有減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和DNA疫苗。傳統(tǒng)滅活苗能起到一定的免疫保護，但其具有免疫效果差、接種免疫次數(shù)較多、免疫途徑復(fù)雜和生產(chǎn)成本較高的問題。而減毒活疫苗及亞單位疫苗具有滅毒不充分、免疫保護性低等缺點。所以研發(fā)一種新型的疫苗策略已迫在眉睫。疫苗的開發(fā)受到能夠引起感染的多種血清之間的抗原多樣性的阻礙。所以選擇合適的蛋白抗原是關(guān)鍵。值得注意的是，沙門氏菌也是表達異源抗原的理想載體，可以為開發(fā)針對其他病原體的疫苗提供一個靈活的平臺。