畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌的三重微滴式數(shù)字PCR定量檢測方法的建立

程深偉 張克強 梁軍鋒 劉福元 郜興亮 杜連柱

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2. 新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000）

隨著步入“十四五”發(fā)展的新階段，為尋求農(nóng)業(yè)高質(zhì)量綠色發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖糞污資源化利用在我國受到了前所未有的關(guān)注。種養(yǎng)結(jié)合、糞污還田利用是其資源化利用的最主要方式之一，是解決養(yǎng)殖業(yè)污染問題的根本出路，也是踐行農(nóng)牧業(yè)綠色發(fā)展的重要舉措［1］。但由于各地養(yǎng)殖業(yè)糞污無害化處理技術(shù)的參差不齊，畜禽糞污作為多種微生物的主要載體，其內(nèi)含的致病菌不但會直接影響?zhàn)B殖動物的健康，也會通過各種渠道與人類接觸，造成公共衛(wèi)生安全的危害［2］。因此，快速檢測養(yǎng)殖糞污中的食源性致病菌，判斷其無害化處理效果，開發(fā)建立更為高效、靈敏的檢測方法尤為重要。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）是3種畜禽養(yǎng)殖糞污中常見的致病微生物。國家標準中對典型致病微生物的檢測采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，通過細菌選擇性培養(yǎng)基和生化試驗來鑒定、分離和計數(shù)樣品中的細菌數(shù)［3］。但傳統(tǒng)檢測方法存在著操作繁瑣、檢測時間長、準確度低等問題。

近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)（quantitative real-time PCR，qPCR）也被用于養(yǎng)殖糞污中致病菌的檢測。其運用PCR反應體系，利用熒光信號的采集對整個PCR系統(tǒng)進行實時監(jiān)測，最后通過繪制標準曲線對檢測樣品進行相對定量的分析［4］。此法大大縮減了檢測時間，準確度和靈敏度均有明顯提升，但也存在著對PCR反應體系要求高、只能進行相對定量值的測定等問題。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近年來迅速發(fā)展起來的一種定量分析技術(shù)。與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)不同，ddPCR不依賴擴增曲線的Ct值（循環(huán)閾值）進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用內(nèi)參基因和標準曲線，具有較好的準確度和重現(xiàn)性，得以實現(xiàn)絕對定量分析［5-6］。與qPCR相比，ddPCR對核酸含量較低的樣品檢測準確率和靈敏度都明顯較高［7-11］。魏詠新等［12］設計了大腸桿菌O157：H7特異性引物、探針，并比較了傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法、qPCR和ddPCR的定值效果。結(jié)果顯示，ddPCR檢測方法能夠有效提高病原菌檢出效率。Kelley等［13］使用ddPCR和qPCR對397個樣本進行金黃色葡萄球菌的定量檢測。結(jié)果表明，ddPCR的靈敏度高于qPCR。趙新等［14］建立了沙門氏菌數(shù)字PCR檢測方法，結(jié)果也證實了ddPCR檢測方法具有檢測快速、檢出率高和操作便捷等優(yōu)點。

ddPCR具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，其操作簡單，樣品消耗量少，在反應體系中提高了反應器的數(shù)量，可以將稀釋后的樣品溶液等分到幾十到幾十萬的微滴中，并保證微滴的均一性和表面穩(wěn)定性，大大提高了ddPCR的靈敏度。且由于其通道和包含在微滴中的樣品模板沒有直接接觸，也減少了反應中交叉污染及模板的損失［15］。ddPCR的技術(shù)優(yōu)勢關(guān)鍵在于實現(xiàn)了檢測的絕對定量，而對于目前廣為使用的多重定量PCR原理上亦屬于傳統(tǒng)的qPCR技術(shù)，因此不具備ddPCR的上述優(yōu)勢。目前相關(guān)ddPCR研究方法主要集中在食品中致病微生物的檢測，且均為單重檢測方法［16-19］，針對畜禽養(yǎng)殖廢棄物中典型致病微生物的多重ddPCR檢測方法鮮見報道。

研究采用數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)中的主要檢測應用方法—ddPCR技術(shù)，建立起畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌的三重微滴式數(shù)字PCR檢測方法，實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌以及腸炎沙門氏菌的絕對定量檢測，以期為畜禽養(yǎng)殖糞污無害化處理和安全利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）（APEXBIO，中國）；細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）；PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×（Quantabio，美國）；Fluorescein sodium salt（APEXBIO，中國）；Sapphire Chip（Stilla Technologies，法國）。

1.1.2 儀器與設備 Naica?全自動微滴芯片數(shù)字PCR系 統(tǒng)（Stilla Technologies， 法 國 ）；Sapphire Chip（Stilla Technologies，法國）；微量分光光度計（Titertek-Berthold，德國）；生物安全柜（BIOBASE，中國）；電子天平（Sartorius，中國）；高壓滅菌鍋（SHENAN，中國）；超低溫冰箱（海爾，中國）；4℃高速離心機器（2-16 PKsigma，德國）；迷你水平電泳槽（BG-subMINI cell，中國）；紫外凝膠成像（Bio-Rad Gel Doc XR+ Bio-Rad，美國）；電泳儀（Power-pac-Bio-Rad，美國）。

1.1.3 實驗菌株 共有13株，其中沙門氏菌1株、金黃色葡萄球菌1株、大腸埃希氏菌（O157：H7）1株（詳見表1）、非目標菌株10株，既有購買于標準菌株保藏中心的標準菌株，也有本實驗室自己從樣品中檢出的陽性菌株。

表1 3種典型致病菌具體信息Table 1 Specific information on three typical pathogenic bacteria

1.1.4 引物探針 參考文獻［16，19-20］中目標菌株核酸的多對引物探針，進行單重熒光PCR擴增比較，篩選最佳引物探針。最佳引物、探針參考文獻及序列見表2，引物和探針由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表2 三重數(shù)字PCR檢測3種致病菌的特異性引物Table 2 Specific primers for detecting three pathogens by triple droplet digital PCR

1.2 方法

1.2.1 致病菌基因組DNA提取 純菌DNA提?。壕N按1∶50（體積比）比例接種至5 mL NB，37℃培養(yǎng)24 h后，再次按1∶50接種，37℃培養(yǎng)8 h，取1 mL菌懸液做10倍梯度稀釋，各取1 mL使用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取基因組DNA，測定DNA濃度，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單重ddPCR的擴增 分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌的基因組DNA為模板進行單重ddPCR擴增，無菌超純水為空白對照。本研究所選的3組引物探針的退火溫度均為60℃，3種TaqMan探針的熒光基團選用吸光度分段差異較大的FAM、HEX和CY5，以利于建立多重微滴數(shù)字PCR反應體系。單重ddPCR反應體系 ：PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×5 μL，F(xiàn)luorescein sodium salt（1 μmol/L）2.5 μL，10 μmol/L引物上下游各 1 μL，探針 0.5 μL，模板 DNA 5 μL，dd H2O補足25 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45 個循環(huán)。

1.2.3 多重ddPCR的建立與優(yōu)化 對3種目標菌株的引物、探針和擴增酶的使用量進行篩選和優(yōu)化，將3組目標菌株的引物與探針組合進行ddPCR擴增，確定彼此間不會互相干擾。再對3組多重ddPCR體系的引物探針添加量進行篩選，經(jīng)過確認后對25μL體系中擴增酶的使用量進行比較，確認最優(yōu)多重ddPCR反應體系。

1.2.4 多重ddPCR特異性實驗 選取3種目標菌株的混合基因組DNA為陽性對照，10株非目標菌的DNA作為陰性對照，進行三重ddPCR特異性檢測，并設立空白對照作為質(zhì)量控制。

1.2.5 多重ddPCR靈敏度試驗 將含有3種目標菌株的基因組DNA進行1∶1∶1混合，進行10倍梯度稀釋，稀釋至106倍。使用6個梯度稀釋樣本進行三重微滴數(shù)字PCR靈敏度檢測，確定其檢出限。

1.2.6 畜禽養(yǎng)殖廢棄物中3種致病菌的檢測 在天津市某養(yǎng)豬場和某養(yǎng)雞場采集廢棄物樣本，共16份。稱取3 g樣本，按照糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）提取DNA，測定A260/A280、A260/A230、DNA濃度。隨后采用本研究所建立的三重ddPCP檢測方法對畜禽養(yǎng)殖廢棄物中3種典型致病菌進行定量檢測。

2 結(jié)果

2.1 單重ddPCR擴增結(jié)果

3種典型致病菌的單重ddPCR擴增效果良好，空白對照未出現(xiàn)陽性微滴。3對引物探針的退火溫度一致，適合構(gòu)建多重ddPCR反應體系，見圖1-圖3。

圖1 腸炎沙門氏菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 1 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of S. enteritidis

圖3 大腸埃希氏菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 3 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of E.coli

2.2 多重dPCR的優(yōu)化

通過體系優(yōu)化與實驗比較，3組引物探針之間不會產(chǎn)生非特異性擴增，3種發(fā)光基團不會互相干擾或者干擾很少，單重ddPCR擴增所得拷貝數(shù)與多重ddPCR擴增拷貝數(shù)相近，可構(gòu)建三重ddPCR反應體系。

圖2 金黃色葡萄球菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 2 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of S. aureus

確定的最佳多重ddPCR反應體系為：PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×5 μL，F(xiàn)luorescein sodium salt（1 μmol/L）2.5 μL，10 μmol/L 引物上下游各 1 μL，探針 0.5 μL，模板 DNA 5 μL，dd H2O 補足25 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。多重ddPCR檢測結(jié)果見表3。已建立的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌三重微滴式數(shù)字PCR的檢測方法可用于后續(xù)樣品的檢測。

表3 單重及多重微滴數(shù)字PCR檢測樣本拷貝數(shù)結(jié)果Table 3 Copy number of samples detected by single and multiple droplet digital PCR

2.3 多重ddPCR的特異性的確定

通過多重ddPCR證實3種目標菌均有相應陽性微滴，同時，設置了陰性菌株和空白作為對照，結(jié)果顯示均無擴增，說明引物、探針的特異性較好，即非目標菌均無特異性擴增，3組引物探針具有良好的特異性，且不會產(chǎn)生交叉反應，多重dPCR特異性擴增結(jié)果見圖4。

圖4 三重ddPCR特異性檢測一維圖Fig. 4 One-dimensional map of specificity detected by triple ddPCR

2.4 三重ddPCR靈敏度的確定

將3種致病菌的基因組DNA混合后，進行10梯度稀釋、6個梯度樣本和3次技術(shù)重復，以檢測反應體系的靈敏度。微滴式數(shù)字PCR拷貝數(shù)濃度檢測結(jié)果如表4。由表4可知，三重微滴式數(shù)字PCR檢測3種致病菌的絕對定量檢測低限分別為腸炎沙門氏菌0.68 copies/μL，RSD為41.29%；金黃色葡萄球菌0.79 copies/μL，RSD為39.60%；大腸埃希氏菌1.02 copies/μL，RSD為25.26%。三重微滴數(shù)字PCR結(jié)果一維圖見圖5。

圖5 三重ddPCR靈敏度檢測一維圖Fig. 5 One-dimensional map of sensitivity detected by triple ddPCR

1）·μLCp E.coli/（菌氏希埃CR 腸大igital P果結(jié)測roplet d檢度敏μL-1）R靈重detection results b y triple d s/（C p·PC字數(shù)S. aureu滴 菌微 球萄4 三葡色黃表en sitivity金ble 4 S Ta μL-1）S. enteritidis /（C p·菌氏門沙炎腸釋稀本樣RSD/%SD G AV Repeat3 Repeat2 Repeat1 RSD/%SD VG Repeat3A epeat2 Repeat1R D/%RS SD VG Repeat3A epeat2 Repeat1R Sample dilution 5.37 6.04 43 3 8 117.3 8 460 02 7 5 90 8 3 4.16 8 044.33334.64 55 8 2 7 572 06 8 3 7240.892.95 8 154.6 8 326 7 814 8 324 A-10×DN 3.93.33 31 796.53 803.1 755.3 831.2 2.99 6.8 23 7.93 79 788.1 774.9 830.8 4.57 2 34.2 8.33 74 756.9 2.8 70 785.3 A-100×DN 5.88 4.58 77.87 76.6 73 84 9.78 7.92.97 80 69.8.8 85 87.3 9.84 7.33 74.47 83.8.9 65 73.7 A-1 000×DN 17.31 1.33 7.66 5.8 8.78 8.41.76 12 0.97 7.57 8.38 8.11 6.21 15.15 1.06 6.97 5.48 7.77 7.67 0×A-1000 DN 6 25.2 0.26 1.02 1.32 0.69 1.06 39.60 0.31 1.02 0.99 1.04 0.35 41.29 0.28 0.68 0.66 1.04 0.35×00 A-100 0 DN 1.42 14 0.82 0.58 0 1.75 0/0 0 0 0 0/0 0 0 0 0 A-1 000 000×DN

以反應體系中 DNA 模板稀釋倍數(shù)為橫坐標，以3個平行檢測拷貝數(shù)結(jié)果為縱坐標繪制線性范圍擬合曲線，如圖6所示，腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的拷貝

圖6 三重ddPCR靈敏度檢測線性范圍擬合曲線Fig. 6 Fitting curve of linear range for triple ddPCR sensitivity detection

數(shù)的對數(shù)值均與 DNA 模板稀釋倍數(shù)的負對數(shù)值呈現(xiàn)高度的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達到0.99以上。說明本實驗建立的微滴式數(shù)字PCR法具有良好的定量線性相關(guān)性，適用于腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的拷貝數(shù)濃度定量檢測。

2.5 畜禽養(yǎng)殖廢棄物中三種致病菌的檢測結(jié)果

使用糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）提取16份樣本（每份樣品3 g）。提取后檢測DNA濃度，檢測結(jié)果見表5，瓊脂糖凝膠電泳操作及結(jié)果見表6、圖7。

圖7 16份樣本瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 7 Agarose gel electrophoresis results of 16 samples

表5 16份樣本DNA濃度檢測結(jié)果Table 5 DNA concentration test results of 16 samples

表6 16份樣本DNA濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測表Table 6 Detection of DNA concentration in 16 samples by agarose gel electrophoresis

將上述樣本DNA樣本進行三重ddPCR檢測，確認樣本中是否含有相關(guān)致病菌。三重ddPCR一維圖結(jié)果如圖8，檢測結(jié)果如表7。

表7 16份樣本三重微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)檢測結(jié)果Table 7 Copy number detection results for 16 samples by triple droplet digital PCR

圖8 三重ddPCR檢測14樣本一維圖Fig. 8 One-dimensional diagram of detecting 14 samples by triple ddPCR

檢測結(jié)果表明，在16個樣本中，僅雞6檢出腸炎沙門氏菌；僅豬4檢測到金黃色葡萄球菌；豬1、豬4、豬5、豬7、雞4、雞6和雞7中都檢測到大腸埃希氏菌。

3 討論

在我們現(xiàn)場實地取樣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，各個取樣點的樣品均有不同程度的畜禽養(yǎng)殖糞污的典型致病菌污染。這也反映了我國目前即使在同一地區(qū)的不同區(qū)域內(nèi)，也存在著畜禽養(yǎng)殖無害化處理技術(shù)的參差不齊且整體水平有待提升的現(xiàn)狀。

國內(nèi)外對于3種典型致病菌的檢測方法進行了大量的研究和對比。國標法使用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式檢測典型致病菌，通過前增菌、選擇性增菌、目的菌株分離、生化試驗、革蘭氏染色和血清學鑒定等環(huán)節(jié)對病原菌進行鑒定計數(shù)［3］。但此方法的整個流程約耗費一周時間，且實驗中多種培養(yǎng)基的配制、復雜的操作流程，使之對待測樣品不能及時準確快速地檢測出結(jié)果。Malorny 等［21］建立了檢測肉和蛋中沙門氏菌的qPCR技術(shù)，Kawasaki 等［22］建立了檢測沙門氏菌、單增李斯特氏菌和大腸埃希氏菌的三重qPCR方法，其自動化程度高，最快檢測周期只需6 h，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法極大地提高了對病原菌的檢測效率和準確度［23］。ddPCR技術(shù)則在此基礎上實現(xiàn)了對3種典型致病菌的絕對定量測定，相較三重qPCR法具有更高的靈敏度和準確度的技術(shù)優(yōu)勢。

對于多重ddPCR技術(shù)，尚存幾個亟待解決的問題。ddPCR技術(shù)運用需依靠實驗室條件下的微滴式數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)，目前檢測花費較高且尚未開發(fā)出現(xiàn)場實時檢測設備，這成為該方法廣泛推廣的障礙性因素。ddPCR技術(shù)基于傳統(tǒng)PCR原理，因此假陽性、假陰性的現(xiàn)象不可避免。較好的檢測效果應是其線性、非散點式微滴縱向分布于陽性與陰性微滴的交接處，此次試驗就有較好的效果呈現(xiàn)，但今后仍需應注意諸多試驗方面的控制。例如，實測樣品盡可能好地進行樣品前處理，提取核酸前對待測菌進行有效的富集，避免其他成分因素的干擾；根據(jù)目標生物的不同核酸特性，應及時調(diào)整引物、模板、dNTP、Mg2+、緩沖液、DNA聚合酶的濃度，優(yōu)化反應體系和反應條件，減少非特異性擴增；當多種引物同時存在時，可適當?shù)貙σ镞M行前處理或通過提高退火溫度、延長退火時間以及添加5%的二甲基亞砜或甘油等輔助劑來盡可能地減少引物二聚體的形成，保持體系較好的擴增效率和檢測特異性；同時，整個實驗檢測環(huán)境應保持較好的負壓條件，減少人為操作引起的核酸氣溶膠污染。對于典型致病菌更好的三重ddPCR反應體系的配比選擇和反應系統(tǒng)的參數(shù)設置今后仍需繼續(xù)優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究建立了畜禽養(yǎng)殖糞污中3種典型致病菌的多重微滴數(shù)式數(shù)字PCR反應體系，確定了以FAM、HEX和CY5 的TaqMan探針熒光基團，以10 μmol/L引物上下游各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，3組引物探針的退火溫度均為60℃的25 μL定量反應體系。在該反應體系中，檢測腸炎沙門氏菌的絕對定量檢測低限為0.68 copies/μL；檢測金黃色葡萄球菌的絕對定量檢測低限為0.79 copies/μL；檢測大腸埃希氏菌的絕對定量檢測低限為1.02 copies/μL。