煙曲霉A-16產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化及酶學(xué)特性

張開平 劉燕麗 涂綿亮 李繼偉 吳文標(biāo)

（1. 百色學(xué)院，百色 533000；2. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716）

盡管經(jīng)濟(jì)在快速發(fā)展和社會(huì)在不斷進(jìn)步，但是全球仍然面臨著能源危機(jī)、糧食短缺和環(huán)境惡化等嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，采用適當(dāng)?shù)纳锎呋瘎⒕G色、可持續(xù)、可再生且尚未利用的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)［1］。纖維素是由β-1,4葡萄糖苷鍵連接而成的線性多聚糖［2］，是自然界中分布最廣［3］、含量最多、最清潔的可再生資源［4］，具有很高的利用價(jià)值［5］。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征［6］使纖維素分子的生物降解效率低［7］；目前其大多用于燃燒或直接廢棄，這造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。如果能通過纖維素酶將纖維素進(jìn)行高效降解得到可進(jìn)一步開發(fā)利用的產(chǎn)品，則對(duì)緩解全球面臨的能源與糧食危機(jī)、環(huán)境污染等問題具有重要的意義。

相對(duì)于具有成本昂貴、設(shè)備要求嚴(yán)格、產(chǎn)物提取困難和二次污染嚴(yán)重等缺陷［8］的化學(xué)降解法而言，纖維素酶降解法具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、糖化率高、成本低、副產(chǎn)物少且無污染等優(yōu)點(diǎn)［9-10］。雖然纖維素酶來源廣泛（例如細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌均可分泌纖維素酶［11-13］），但是目前國(guó)內(nèi)外研究最多的是絲狀真菌，如木霉屬、根霉屬、曲霉屬等［14-15］。然而在生產(chǎn)技術(shù)上仍然面臨纖維素酶活力低、熱穩(wěn)定性差、最適pH范圍較窄的難題，這嚴(yán)重限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用［16-18］。

本研究采用剛果紅染色法從土壤中篩選出一株性能優(yōu)良、高產(chǎn)纖維素酶的真菌煙曲霉，對(duì)該菌發(fā)酵稻草秸稈生產(chǎn)纖維素酶的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)所產(chǎn)纖維素酶的特性進(jìn)行了研究，旨在為纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物的開發(fā)利用提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從百色市大王嶺自然保護(hù)區(qū)常年堆積的腐敗木質(zhì)下的土壤中采集土樣，保存在4℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)［19-20］，作綜合調(diào)整。

（1）富集培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 20.00、KH2PO41.00、Na2CO30.50、MgSO4·7H2O 0.20、FeSO40.05、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、牛肉膏 10.00，pH自然。

（2） 篩 選 培 養(yǎng) 基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05、瓊脂 15.00，pH自然。

（3）種子培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 20.00、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO40.50，pH自然。

（4）復(fù)篩液體培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05，pH自然。

（5）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：稻草粉5.00、蔗糖5.00、蛋白胨10.00、酵母膏3.00、吐溫-80 2.00 mL、KH2PO41.00、MgSO4·7H2O 0.20、MnSO40.05、（NH4）2SO40.50、CaCl20.40、FeSO40.05，pH 自然。

（6）斜面保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器 剛果紅、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純，稻草粉（經(jīng)清洗、干燥、粉碎、過120目篩，待用）；ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402） 和 dNTP Mix（R0192）購(gòu)至Thermo公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）和Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（B518259）購(gòu)至上海生工。

DNA電泳槽（H6-1），上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；穩(wěn)壓電泳儀（DYY-8），上海琪特分析儀器有限公司；電子分析天平（BSll0S），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡（YS 100），日本Nikon；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2700），日本島津；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D），上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；凝膠成像儀（SC850），上海山富科學(xué)儀器有限公司；PCR儀（2720 thermal cycler），美國(guó) Applied Biosystems公司；可控恒溫?fù)u床（HZQ-F160），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱（SPX-300B），上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)（YXJ-2），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；測(cè)序儀（3730XL），美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選 富集培養(yǎng)：取5.0 g土樣置于45 mL生理鹽水中，加入無菌玻璃珠充分振蕩混勻，用濾紙過濾除去固體雜質(zhì)得樣品液。取每種樣品液1.0 mL加入盛有30 mL富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于45℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 d，得到第一代菌群。取1.0 mL一代菌液轉(zhuǎn)入30 mL新鮮富集培養(yǎng)基中，在45℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d，得到第二代菌群；相同條件下重復(fù)富集培養(yǎng)8輪，得到熱穩(wěn)定性纖維素酶產(chǎn)生菌群。

初篩培養(yǎng)：梯度稀釋富集后的培養(yǎng)液10-5-10-7倍，分別取0.1 mL涂布于平板篩選培養(yǎng)基，45℃培養(yǎng)4-5 d后，用剛果紅染色法［20］判斷纖維素酶產(chǎn)量，挑取透明圈較大且生長(zhǎng)迅速的菌落劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)，編號(hào)，保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩培養(yǎng)：將初篩獲得的單菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，在45℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，制得一級(jí)種子液，然后按1%的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，于45℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)5 d。

1.2.2 纖維素酶活的測(cè)定 粗酶液的制備：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液于12 000 r/min、4℃條件下離心15 min，收集上清液得粗酶液。葡萄糖含量的測(cè)定：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定。羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）及濾紙酶（filter paper activities，F(xiàn)PA）活性的測(cè)定分別參照文獻(xiàn)［3，21］。酶活力單位的定義：在45℃條件下，每分鐘催化底物水解釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即為1個(gè)酶活力單位（U），以U/mL表示。

1.2.3 菌種鑒定 （1）菌株形態(tài)觀察：將目標(biāo)菌株點(diǎn)種至篩選培養(yǎng)基平板上，于45℃條件培養(yǎng)3 d后，觀察其菌落形態(tài)，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《中國(guó)真菌志》等進(jìn)行分類鑒定。

（2）分子鑒定：從菌株的形態(tài)學(xué)特征，初步判斷該菌株為真菌。①DNA提?。河肊zup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取A-16菌株基因組DNA，置-20℃冰箱保存。②PCR擴(kuò)增：以提取的DNA為模板，選用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件參照ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402）試劑說明書進(jìn)行，擴(kuò)增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物于4℃冰箱保存。③PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。④PCR產(chǎn)物純化：用上海生工的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）進(jìn)行純化回收。⑤測(cè)序：純化的目的片段與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并獲得陽性克隆子［21］。擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物股份有限公司，用BigDyeTr v3.1 Cycle Seq Kit（4336921）對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。⑥構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹：將測(cè)得的18S rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性高的微生物序列，用Clustal W 2.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，用MEGA 7.0軟件中的N-J鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 煙曲霉發(fā)酵稻草粉生產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化 以CMCase和FPA酶活力為指標(biāo)，依次研究不同產(chǎn)酶條件［稻草粉添加量（2、4、6、8、10、12 g/100 mL）、產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、發(fā)酵溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃）和發(fā)酵時(shí)間（2、3、4、5、6、7、8 d）］對(duì)纖維素酶活力的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以稻草粉添加量、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為變量，以CMCase酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較用LSD法，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design - Expert 10.0 Trial軟件通過Box-Benhnken組合法進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酶工藝參數(shù)。

1.2.6 纖維素酶酶學(xué)特性初步測(cè)定 酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性：分別在30℃-90℃條件下測(cè)定CMCase和FPA酶活力，確定最適反應(yīng)溫度；其中以酶活力最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度為參照，設(shè)定該溫度下的酶活力為相對(duì)酶活100%。然后將酶液分別置于不同溫度（30℃-90℃）的恒溫水浴鍋中保溫90 min，保溫結(jié)束后快速冷卻，在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定CMCase和FPA酶的殘余酶活；以未經(jīng)處理的酶液作對(duì)照。

酶反應(yīng)的最適pH和pH穩(wěn)定性：以不同pH的緩沖液［檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0-6.0）、磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH 7.0-8.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0-11.0）］配制1% CMC-Na溶液或?yàn)V紙條溶液作為反應(yīng)底物，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定CMCase和FPA的酶活力，確定CMCase和FPA酶的最佳作用pH，其中以酶活最高時(shí)所加的緩沖液pH為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定該pH條件下酶活力為100%。然后將酶液與不同pH（3.0-11.0）緩沖液等體積混合，4℃冰箱保存24 h，于45℃保溫2 h，再將酶液調(diào)回到最適pH值；在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定CMCase和FPA酶的殘余酶活力，用未經(jīng)處理的酶液作對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

對(duì)從土壤中初篩得到20余菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，復(fù)選出D/d值最大的8菌株，其CMCase和FPA酶活力見表1。由表1可知，菌株A-16產(chǎn)的CMCase和FPA酶活力分別為2 516.24 U/mL和686.48 U/mL，總活力均高于其它菌株，基本可以確定A-16菌株產(chǎn)的纖維素酶能力是最強(qiáng)的。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇A-16菌株作為出發(fā)菌株，開展其發(fā)酵稻草粉生產(chǎn)纖維素酶工藝條件研究及對(duì)所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。

表1 產(chǎn)纖維素酶菌株酶活性Table 1 Enzymatic activity of the cellulase-producing strains

2.2 菌株鑒定

將菌株A-16接種到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，菌落呈綠色，菌絲體產(chǎn)生大量分生孢子梗，頂端膨大為近似球形的頂囊，表面長(zhǎng)滿單層或雙層的小梗；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落變?yōu)槟G色（圖1）；根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡觀察，再結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《中國(guó)真菌志》的比對(duì)，初步判斷該菌株是曲霉屬真菌。為了進(jìn)一步確定該菌的類別，采用通用引物ITS1、ITS4對(duì)菌株A-16基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR產(chǎn)物只得到一條在500-600 bp之間有明亮的條帶，將PCR回收純化后產(chǎn)物送到上海生工進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果得到擴(kuò)增的A-16菌株ITS序列片段大小為569 bp。將測(cè)得的18S rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)（登錄號(hào)：MH846230），挑選其中5株模式菌株的ITS序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。A-16菌株的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中煙曲霉（Aspergillus fumigatus）MT529449在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)99%以上，再結(jié)合形態(tài)特征可以初步鑒定該菌為煙曲霉，命名為Aspergillus fumigatus A-16。

圖1 菌株A-16菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the strain A-16

圖2 菌株A-16基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain A-16 based on 18S rDNA

2.3 煙曲霉發(fā)酵稻草粉生產(chǎn)纖維素酶單因素試驗(yàn)

2.3.1 稻草粉添加量對(duì)纖維素酶活性的影響 由圖3可知，隨著稻草粉添加量的增加，CMCase和FPA酶活力先上升后下降，不同稻草粉添加量對(duì)纖維素酶活性的影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)?shù)静莘厶砑恿繛? g/100 mL時(shí)，纖維素酶活性最強(qiáng)。繼續(xù)增加稻草粉濃度，反而降低了介質(zhì)的孔隙率，溶氧不足，菌體生長(zhǎng)受限，使得纖維素酶的活性降低。由多重比較得出，稻草粉添加量為8 g/100 mL時(shí)產(chǎn)酶能力（以所產(chǎn)纖維素酶的活性計(jì)）與其它稻草粉添加量時(shí)的相比差異顯著（P＜0.05）。因此，稻草粉添加量為8 g/100 mL時(shí)最佳。

圖3 稻草粉添加量對(duì)A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.3 Effects of straw powder on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.2 pH對(duì)產(chǎn)纖維素酶活性的影響 由圖4可知，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH對(duì)A-16菌株產(chǎn)纖維素酶活性影響顯著（P＜0.05）。隨著pH升高，CMCase和FPA酶活力變化趨勢(shì)基本一致，均呈現(xiàn)先增大后減小。由LSD法多重比較可知，初始pH 6.0時(shí)，CMCase和FPA酶活力最高，且明顯高于其它初始pH時(shí)菌株所產(chǎn)的纖維素酶活力（P＜0.05），說明A. fumigatus A-16菌株在中性偏酸性條件下能分泌較高的纖維素酶量，在堿性條件下不利于產(chǎn)酶。因此，選擇最佳培養(yǎng)基初始pH為6.0。

圖4 初始pH對(duì)A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.4 Effects of initial pH on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.3 溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶活性的影響 在其它條件恒定的情況下，不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖5，菌株A-16生長(zhǎng)溫度較寬且具有較強(qiáng)的高溫耐受性，隨著溫度升高，CMCase和FPA的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度過高時(shí)，加快菌體老化，不利于纖維素酶的代謝積累，并且酶的穩(wěn)定性顯著下降。當(dāng)溫度為65℃時(shí)，CMCase活力達(dá)到最大值，為2 714.6 U/mL，顯著高于其它培養(yǎng)溫度下的菌株產(chǎn)纖維素酶活力（P＜0.05），是25℃培養(yǎng)條件下酶活力的1.95倍。然而，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，F(xiàn)PA的酶活力達(dá)到最高，為902.8 U/mL，由LSD法多重比較可知，55℃培養(yǎng)條件下產(chǎn)的FPA活力較其它培養(yǎng)溫度的顯著增大（P＜0.05）。因此，A.s fumigatus A-16產(chǎn)纖維素酶的適宜培養(yǎng)溫度范圍為55℃-65℃。

圖5 溫度對(duì)A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響 由圖6可知，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)CMCase和FPA的酶活力有顯著影響（P＜0.05）。發(fā)酵5 d時(shí)，CMCase和FPA的酶活力均達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，菌體開始老化，纖維素酶活緩慢下降。由LSD法多重比較可知，發(fā)酵到第5天時(shí)FPA酶活力雖然和第6-8天酶活力差異不顯著（P＞0.05），但綜合考慮時(shí)間成本、低耗能等因素，選擇最佳產(chǎn)酶時(shí)間為5 d。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.6 Effects of fermentation time on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3，根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)曲面圖見圖7。對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合后，得到回歸方程為：Y=2 916.68-215.88A-40.00B+29.83C-17.42D-9.15AB+50.10AC-56.46AD+154.38BC-59.47BD-35.82CD-301.240A2-301.57B2-334.09C2-254.14D2

圖7 響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface diagram

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and test results

由表3可知，模型極顯著（P＜0.0001），模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明模型選擇合適，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型的可決系數(shù)R2為0.905 8＞0.9，說明90.58%的CMCase活力的變化可以用該模型來解釋。離散系數(shù)（CV）為5.30%，其值較低，表明整個(gè)試驗(yàn)具有較好的精確性和可靠性，從而也說明該模型擬合度較好。

表3 響應(yīng)面模型及回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the response surface model and the regression equations

同時(shí)，模型中自變量一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì) CMCase活力的影響極顯著（P＜0.01），BC對(duì)CMCase活力的影響顯著（P＜0.05），其它因素交互作用均不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)CMCase活力的影響大小為：稻草粉添加量＞pH＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。對(duì)回歸方程進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為：稻草粉添加量7.28 g/100 mL，pH 5.94，發(fā)酵溫度65.03℃，發(fā)酵時(shí)間5.01 d。在此條件下預(yù)測(cè)最大CMCase活力為2 956.52 U/mL。為了方便實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝參數(shù)修正為：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，發(fā)酵溫度65℃，發(fā)酵時(shí)間5 d。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與實(shí)際情況是否吻合，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明CMCase活力平均值為2 954.76±2.33 U/mL，與模型預(yù)測(cè)值接近，說明該模型具有較高的可信度。

2.5 菌株A-16產(chǎn)纖維素酶的特性

2.5.1 酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性 粗酶液在不同溫度條件下測(cè)定CMCase和FPA酶活力，結(jié)果（圖8-A）表明，CMCase和FPA酶的適宜反應(yīng)溫度均為70℃，且在40℃-80℃范圍內(nèi)均有較強(qiáng)的酶活性，仍然保持在80%以上，說明所得纖維素酶屬于高溫酶。將酶液在不同溫度條件下分別保溫90 min，然后在70℃下測(cè)定CMCase和FPA酶的殘余酶活力，結(jié)果（圖8-B）表明，CMCase和FPA酶活力在80℃之內(nèi)穩(wěn)定性較好，處理90 min酶活力還保持在80%以上，繼續(xù)升高溫度至90℃保溫90 min，CMCase和FPA酶的相對(duì)酶活力均保持在70%以上。相比較CMCase，F(xiàn)PA的熱穩(wěn)定性更好一些，90℃溫度范圍內(nèi)隨溫度升高酶活力下降比較緩慢，90℃處理90 min后，仍然保持76.3%的酶活力，說明菌株A-16所產(chǎn)的纖維素酶具有良好的熱穩(wěn)定性，具有良好的開發(fā)價(jià)值。

圖8 菌株A-16產(chǎn)纖維素酶作用的最適溫度及其熱穩(wěn)定性Fig.8 Optimal temperature of cellulase activity of strain A-16 and and its thermo-stabilities

2.5.2 酶反應(yīng)的最適pH和pH穩(wěn)定性 粗酶液于不同pH條件下測(cè)定CMCase和FPA酶活力，結(jié)果（圖9-A）表明，CMCase和FPA酶的最適反應(yīng)pH均為6.0，且在pH 5.0-8.0范圍內(nèi)催化分解羧甲基纖維素和濾紙的效率高，可見菌株A-16所產(chǎn)纖維素酶的最佳反應(yīng)條件為中性偏酸性。pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9-B）表明，CMCase和FPA酶活力在pH 5.0-7.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，放置1 d后可保持70%以上的酶活力，尤其在pH 6.0時(shí)，CMCase活力可保持84.6%，F(xiàn)PA酶活力可保持86.9%；若反應(yīng)體系pH低于5.0或高于7.0時(shí)，CMCase和FPA酶活力快速喪失，說明該酶是一種中性偏酸性酶，對(duì)pH變化比較敏感。

圖9 菌株A-16產(chǎn)纖維素酶作用的最適pH及其pH穩(wěn)定性Fig. 9 Optimal pH of cellulase activity of strain A-16 and its pH stabilities

3 討論

理想的產(chǎn)纖維素酶效率是微生物發(fā)酵法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵因素之一［13，22］。單因素和響應(yīng)面優(yōu)化建立的培養(yǎng)純化A. fumigatus A-16的條件組合具備高效生產(chǎn)纖維素酶的能力。本研究所得的優(yōu)化條件使A. fumigatus A-16發(fā)酵產(chǎn)品的總纖維素酶活力較優(yōu)化前提高了26.4%，優(yōu)化效果十分明顯。以所獲產(chǎn)品的纖維素酶活力為考察指標(biāo)進(jìn)行比較，A.fumigatus A-16菌株及其培養(yǎng)條件優(yōu)于已報(bào)道的A.fumigatus B-2-3菌株及其培養(yǎng)條件［23］。在優(yōu)化條件下，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis DX4）［24］和放 線 菌（Streptomyces azureus T23-B）［25］相 比，A.fumigatus A-16能得到更高總纖維素酶活力的發(fā)酵產(chǎn)品，菌株產(chǎn)酶活力高了34.35%以上。

與其它報(bào)道的產(chǎn)纖維素酶菌株相比，本研究分離純化出來的煙曲霉A-16所產(chǎn)纖維素酶的活力更高、耐熱和耐酸特性更優(yōu)異，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。在工業(yè)生產(chǎn)中，耐高溫纖維素酶有助于提高纖維素降解率。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了耐高溫纖維素酶生產(chǎn)菌，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［26］，嗜熱煙曲霉（A. fumigatus JCM 10253）［20］芽孢桿菌（Bacillus sp. BSC6-1）［18］，但這些耐高溫菌產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為45℃-60℃，熱穩(wěn)定性在50℃-70℃，而本研究篩選得到的A. fumigatus A-16菌株所產(chǎn)CMCase和FPA酶的適宜反應(yīng)溫度條件為70℃，在80℃熱處理90 min，酶活力還保持在80%以上，其中FPA酶在90℃保溫90 min仍然保持76.3%的酶活力。較其它已報(bào)道的菌株具有明顯優(yōu)勢(shì)，是一株性能優(yōu)良的耐高溫纖維素酶生產(chǎn)菌株。本研究篩選得到的煙曲霉A-16與蔣芳等［27］、金偉等［28］篩選出來的耐高溫真菌在最適反應(yīng)溫度（均為70℃）上相似，但其它條件均不相同。同時(shí)，A. fumigatus A-16菌株所產(chǎn)CMCase和FPA酶在pH 5.0-7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，放置1 d后可保持70%以上的酶活力。這一溫和的pH范圍有利于生產(chǎn)應(yīng)用。

本研究建立的培養(yǎng)純化A. fumigatus A-16的優(yōu)化條件組合中，使用稻草粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。我國(guó)有大量這種原料，價(jià)格低廉，生產(chǎn)成本低。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化利用目標(biāo)，減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。煙曲霉A-16是一株原始野生型菌，后續(xù)研究工作將通過誘變、菌種改良或蛋白質(zhì)工程技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)手段來構(gòu)建高效纖維素酶基因工程菌，優(yōu)化生產(chǎn)工藝提高纖維素酶產(chǎn)量和增強(qiáng)酶活穩(wěn)定性，旨在為耐高溫酸性纖維素酶的規(guī)?；a(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用提供優(yōu)良菌株。

4 結(jié)論

本研究從土壤中篩選到一株性能穩(wěn)定、高產(chǎn)纖維素酶的A. fumigatus A-16。通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化獲得最佳產(chǎn)酶條件：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，發(fā)酵溫度65℃，發(fā)酵時(shí)間5 d，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，CMCase活力達(dá)到2 954.76 U/mL，F(xiàn)PA酶活為1 086.37 U/mL，較優(yōu)化前提高了26.4%。該菌產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)條件為70℃，pH 6.0，具有較強(qiáng)的耐熱能力和較好的pH穩(wěn)定性，可作為耐高溫酸性纖維素酶生產(chǎn)的資源菌，具有纖維素酶制劑規(guī)模化生產(chǎn)和纖維素資源開發(fā)應(yīng)用的潛力。