花椒精油亞臨界流體萃取工藝優(yōu)化及GC-MS分析

馬 鈐，郭川川，張峰軼，楊壹芳，熊 偉

（1.四川天味食品集團(tuán)股份有限公司，四川 成都 610200；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬（ZanthoxylumL.）植物的果皮。花椒被譽(yù)為中國(guó)八大味之一，是我國(guó)人民常用的香辛料[1]?；ń肪褪腔ń返脑创紊x物質(zhì)，也是花椒香氣的主要來(lái)源。目前關(guān)于花椒精油的提取方法主要有CO2超臨界萃取[2-3]、水蒸氣蒸餾萃取（steam distillation extraction，SDE）[4-5]、溶劑提取[6-7]、冷榨法[8]、亞臨界流體萃取法（subcritical fluid extraction，SFE）[9]及一些超聲、微波、酶解等輔助方法[10-12]。超臨界CO2提取法作為一種綠色的工業(yè)級(jí)精油生產(chǎn)方法，除有無(wú)化學(xué)污染的優(yōu)勢(shì)外，還有提取率高，操作溫度較低，能防止熱敏性物質(zhì)的功能性被破壞的優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備昂貴，能耗較高，產(chǎn)能較小等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了其大規(guī)模的工業(yè)推廣。水蒸氣蒸餾法提取花椒精油，有保持花椒香氣濃郁的優(yōu)勢(shì)，但很難提取出花椒酰胺、崖椒酰胺等滋味物質(zhì)，并且提取得率較低，設(shè)備運(yùn)行成本昂貴。溶劑提取法提取的花椒精油有提取滋味物質(zhì)完整，香氣均勻，口感飽滿的優(yōu)點(diǎn)，但化學(xué)物質(zhì)易殘留而降低精油的食品安全性。冷榨法提取的花椒精油顏色較好，香氣濃郁且麻味素含量較高，但是顏色不穩(wěn)定且?guī)в锌辔?。超聲波、微波、酶解等輔助方法能加速植物細(xì)胞壁破裂，有效成分的溶出，縮短提取時(shí)間，增加提取效率，但一般不單獨(dú)使用[13]。亞臨界流體萃取作為一種新型提取技術(shù)，使用常溫萃取，低溫脫溶生產(chǎn)工藝，能有效防止粕和油中的熱敏性物質(zhì)的分解；投資小、成本低、規(guī)模大，并且生產(chǎn)中無(wú)“三廢污染”，屬環(huán)保工程，近幾年受到廣泛的推崇[14]。

為了提高花椒精油的萃取效率，本研究以甘肅武都大紅袍花椒為原料，采用水蒸氣蒸餾萃取法（SDE）及亞臨界流體萃取法（SFE）提取花椒精油。以花椒精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化花椒精油的萃取工藝。通過(guò)固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技術(shù)對(duì)比分析SFE及SDE提取花椒精油揮發(fā)性成分，以期為亞臨界流體萃取法工業(yè)化生產(chǎn)花椒精油提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干大紅袍花椒：甘肅武都；CO2（純度＞99.9%）、氦氣（He）（純度＞99.99%）：成都科源氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3P多功能熱泵干燥車(chē)間裝置：廣東凱能電器科技有限公司；WFJ-60食品香料粉碎機(jī)：江陰市普友粉體設(shè)備有限公司；CBE-5L型亞臨界流體萃取裝置：河南亞臨界生物技術(shù)有限公司；Agilent 9000氣相色譜儀、5977B質(zhì)譜儀：美國(guó)安捷倫公司；THT-4揮發(fā)油提取縮罐冷凝裝置：北京國(guó)衛(wèi)和教醫(yī)藥設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒精油的萃取

干大紅袍花椒置于多功能熱泵干燥車(chē)間中，設(shè)置溫度60 ℃連續(xù)干燥，調(diào)節(jié)水分約至8%。采用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)30目篩，備用。

花椒精油亞臨界流體萃取：稱取一定量的大紅袍花椒粉于亞臨界的萃取罐中，排除空氣，加入萃取溶劑丁烷。在設(shè)置的萃取條件下進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)蒸發(fā)系統(tǒng)蒸發(fā)掉溶劑后制得紅花椒毛油，將毛油2 000 r/min離心20 min。室溫靜置2～4 h后，得到大紅袍花椒精油[15]。

花椒精油水蒸氣蒸餾萃?。喝?50 g花椒加入500 mL濃縮罐中，以300 mL蒸餾水為溶劑，浸泡1 h后通入冷凝水，加熱回流4 h，停止加熱，自然冷卻至室溫。從揮發(fā)油提取裝置中收集花椒精油。

花椒精油得率計(jì)算公式如下：

1.3.2 亞臨界流體萃取工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

固定花椒精油的亞臨界流體萃取基本條件為液料比（1.0∶2.5）（g∶mL）、萃取3次、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間60 min，分別考察萃取次數(shù)（1、2、3、4、5次）、萃取溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃）、萃取時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、料液比（1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5、1.0∶3.0（g∶mL））對(duì)大紅袍花椒精油得率的影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以花椒精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察4個(gè)因素（萃取次數(shù)、萃取溫度、萃取時(shí)間和料液比）對(duì)花椒精油得率的影響。采用L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝。

1.3.3 花椒精油揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析

（1）SPME萃取條件

萃取頭：二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷；老化溫度：220 ℃；老化時(shí)間：30 min；樣品量：3 mL；頂空瓶：10 mL；萃取溫度：55 ℃；萃取時(shí)間：30 min。

（2）GC-MS檢測(cè)條件

GC條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m）；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；流速1.4 mL/min；分流比33∶1；氣化室溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，升溫速率5 ℃/min，升溫至250 ℃，保持20 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～350 m/z。

（3）定性定量分析

將檢測(cè)到的物質(zhì)與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology,NIST）11譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)樣品均有3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞臨界流體萃取花椒精油工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 萃取次數(shù)對(duì)花椒精油得率的影響

萃取次數(shù)對(duì)花椒精油得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，萃取次數(shù)在1～5次范圍內(nèi)的增加，花椒精油得率總體有先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)萃取次數(shù)在1～3次時(shí)，花椒精油得率顯著增加（P＜0.05）；繼續(xù)增加萃取次數(shù)，萃取率的增加幅度趨于平緩。因此，綜合考慮萃取效率、生產(chǎn)成本等因素，選擇3次為最佳萃取次數(shù)。

圖1 萃取次數(shù)對(duì)精油得率的影響Fig.1 Effect of extraction times on essential oil yield

2.1.2 萃取溫度對(duì)花椒精油得率的影響

萃取溫度可以加速溶劑和溶質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)，增加溶質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散速率，從而提高萃取效率，但萃取溫度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致一些熱敏性成分被分解破壞[16]。亞臨界萃取溫度對(duì)花椒精油得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著萃取溫度在35～45 ℃范圍內(nèi)的升高，花椒精油得率隨之迅速上升（P＜0.05）；當(dāng)萃取溫度為45 ℃時(shí)，精油得率最高，為14.71%；當(dāng)萃取溫度高于45 ℃之后，隨著萃取溫度繼續(xù)升高，精油得率隨之呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)能耗。因此，綜合考慮，選擇45 ℃為最佳萃取溫度。

圖2 萃取溫度對(duì)精油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on essential oil yield

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)花椒精油得率的影響

油脂在亞臨界流體中達(dá)到溶解平緩需要一定的時(shí)間，但過(guò)長(zhǎng)的萃取時(shí)間會(huì)增加能耗[17]。亞臨界萃取時(shí)間對(duì)花椒精油得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著萃取時(shí)間在20～40 min范圍內(nèi)的增加，花椒精油得率隨之顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)萃取時(shí)間在40 min時(shí)，花椒精油得率最高，為14.73%；當(dāng)萃取時(shí)間＞40 min之后，花椒精油得率不再有顯著變化（P＞0.05）。因此，選擇40 min為最佳萃取時(shí)間。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)精油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on essential oil yield

2.1.4 料液比對(duì)花椒精油得率的影響

料液比對(duì)花椒精油得率的影響見(jiàn)圖4。當(dāng)料液比在1.0∶1.0～1.0∶2.0（g∶mL）時(shí)，花椒精油得率隨之顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)料液比為1.0∶2.0（g∶mL），精油得率達(dá)到14.68%，再繼續(xù)增加萃取溶劑用量，精油得率基本平穩(wěn)。綜合考慮后續(xù)溶劑回收的問(wèn)題，萃取溶劑使用過(guò)多，會(huì)增加溶劑使用成本及整體生產(chǎn)能耗。因此，選擇1.0∶2.0（g∶mL）為最佳料液比。

圖4 料液比對(duì)精油得率的影響Fig.4 Effect of solid and liquid ratio on essential oil yield

2.2 亞臨界流體萃取花椒精油工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察萃取次數(shù)（A）、萃取溫度（B）、萃取時(shí)間（C）和料液比（D）對(duì)花椒精油得率的影響，設(shè)置L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 亞臨界流體萃取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for subcritical fluid extraction process optimization

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal tests results

由表1可知，對(duì)結(jié)果影響由大到小順序?yàn)檩腿〈螖?shù)＞料液比＞萃取時(shí)間＞萃取溫度，最優(yōu)萃取工藝組合為A2B1C2D2（A2B2C2D2），即萃取次數(shù)3次、萃取溫度40 ℃（45 ℃）、萃取時(shí)間40 min、料液比1.0∶2.0（g∶mL）。為保留精油的風(fēng)味物質(zhì)，選擇A2B1C2D2。在此最佳萃取工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，花椒精油平均得率為15.11%[18]，且在此條件下花椒精油的提取率高于正交試驗(yàn)方案中的最高值（14.99%），說(shuō)明該優(yōu)化方案是可行的[19-21]。由表2可知，萃取次數(shù)對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），萃取溫度、萃取時(shí)間及料液比對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 花椒精油揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

2.3.1 總離子流色譜圖

采用水蒸氣蒸餾萃取法（SDE）及亞臨界流體萃取法（SFE）提取花椒精油，花椒精油揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 水蒸氣蒸餾萃?。╝）及亞臨界流體萃取（b）花椒精油中揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of volatile flavour components in Zanthoxylum bungeanum essential oil extracted by steam distillation extraction (a) and subcritical fluid extraction (b) analyzed by GC-MS

2.3.2 花椒精油揮發(fā)成分分析

用水蒸氣蒸餾萃取法（SDE）及亞臨界流體萃取法（SFE）提取花椒精油，兩種不同方法提取花椒精油揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 花椒精油揮發(fā)成分測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of volatile components of Zanthoxylum bungeanum essential oil

續(xù)表

2.3.3 花椒精油揮發(fā)性化合物種類及含量

水蒸氣蒸餾萃取花椒精油樣品中共檢出37種化合物，包括烯類16種、酯類7種、醇類7種、醛類2種、芳香烴類1種、呋喃類1種、酮類1種、萜類1種和酸類1種。其中相對(duì)豐度＞1%的化合物有：芳樟醇（15.01%）、（+）-檸檬烯（13.74%）、桉葉油醇（10.51%）、β-蒎烯（10.19%）、檜烯（9.86%）、3-蒈烯（9.66%）、乙酸芳樟酯（6.19%）、4-萜烯醇（4.94%）、3,6,6-三甲基-雙環(huán)（3.1.1）庚-2-烯（4.91%）、間-異丙基甲苯（3.22%）、乙酸香葉酯（1.93%）、左旋-β-蒎烯（1.78%）、月桂烯（1.33%）、α-松油醇（1.26%）、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）（1.09%）、2-蒎烯（1.03%）共計(jì)16種，與王娟等[22]研究結(jié)果相似。

亞臨界流體萃取樣品中共檢出40種揮發(fā)性物質(zhì)，包括烯烴類16種、酯類7種、醇類8種、醛類2種、芳香烴類1種、呋喃類2種、酮類1種、萜類1種、酸類1種和萘類1種。其中相對(duì)豐度＞1%的化合物有：（+）-檸檬烯（22.92%）、乙酸芳樟酯（14.12%）、芳樟醇（12.71%）、β-蒎烯（7.57%）、檜烯（7.34%）、3-蒈烯（6.05%）、萜品油烯（5.25%）、桉葉油醇（4.54%）、3,6,6-三甲基-雙環(huán)（3.1.1）庚-2-烯（3.76%）、乙酸香葉酯（2.73%）、2-蒎烯（2.67%）、乙酸松油酯（2.04%）、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）（1.69%）、乙酸（1.15%）共計(jì)14種。曹雁平等[23]研究表明，超臨界萃取花椒精油的主要揮發(fā)性成分有芳樟醇（47.18%）、乙酸芳樟醇（12.11%）和D-檸檬酸（10.59%），和本實(shí)驗(yàn)樣品結(jié)果相似。

2.3.4 花椒精油風(fēng)味對(duì)比分析

兩種提取方式的紅花椒樣品中，共檢測(cè)出48種揮發(fā)性物質(zhì)，包括烯烴類20種、酯類8種、醇類8種、醛類3種、芳香烴類2種、呋喃類2種、酮類2種、萜類1種、酸類1種和萘類1種。

對(duì)比亞臨界流體萃取和水蒸氣蒸餾提取中相對(duì)豐度＞1%的19個(gè)主要揮發(fā)性化合物，結(jié)果表明亞臨界提取紅花椒精油和水蒸氣蒸餾的紅花椒精油中均含有（+）-檸檬烯、β-蒎烯、檜烯、3-蒈烯、萜品油烯、3,6,6-三甲基-雙環(huán)（3.1.1）庚-2-烯、2-蒎烯、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、桉葉油醇和乙酸16種物質(zhì)，這些物質(zhì)是紅花椒中常見(jiàn)的揮發(fā)性化合物[24]。亞臨界流體萃取樣品中的（+）-檸檬烯（檸檬氣味）、萜品油烯（檸檬氣味）、乙酸芳樟酯（類似香檸檬、薰衣草等果香和花香）、乙酸松油酯（類似香檸檬、薰衣草等果香和花香）、乙酸（酸味）的峰面積分別是水蒸氣蒸餾的2.0、74.0、2.66、3.1、2.3倍，這些物質(zhì)沸點(diǎn)較高，可能與亞臨界流體萃取香氣持久性有關(guān)；水蒸氣蒸餾樣品中新檢出左旋β-蒎烯（具有特有的松節(jié)油香氣、干燥木材和松脂氣味）、月桂烯（具有清淡的香脂香氣）、間-異丙基甲苯（具有芳香氣味及刺激性）等新化合物且4-萜烯醇（呈暖的胡椒香、較淡的泥土香和陳腐的木材氣息）、α-松油醇（具有丁香氣味）、桉葉油醇（樟腦氣息和清涼的草藥味道）分別是超臨界萃取的4.75、4.48、2.0倍，這些揮發(fā)性化合物及其香氣可能與水蒸氣蒸餾紅花椒精油的頭香香氣強(qiáng)有關(guān)，很好的解釋了水蒸氣蒸餾精油香氣較強(qiáng)但留香型差勁，亞臨界萃取不僅能很好的萃取香氣成分，還能萃取部分滋味物質(zhì)，對(duì)其香氣有一定的干擾，留香型較強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水蒸氣蒸餾的精油[25-26]。

3 結(jié)論

本研究采用亞臨界流體萃取裝置對(duì)花椒進(jìn)行萃取，以精油得率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出最佳的萃取條件為：萃取3次、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間40 min、料液比1.0∶2.0（g∶mL）。通過(guò)GC-MS對(duì)比分析亞臨界流體萃取法和水蒸氣蒸餾法制備的花椒精油中香氣成分，結(jié)果表明，兩種精油中主要含有（+）-檸檬烯、β-蒎烯、檜烯、3-蒈烯、萜品油烯、3,6,6-三甲基-雙環(huán)（3.1.1）庚-2-烯、2-蒎烯、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、桉葉油醇和乙酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，亞臨界流體萃取法精油得率及峰面積較水蒸氣蒸餾法高且留香型持久。亞臨界流體萃取法應(yīng)用于花椒精油的提取，效果更優(yōu)，為花椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。