甘蔗渣固定化酵母釀造百香果果酒的研究

虞珂娜，劉昭明*，張定宇，黃翠姬，盧宏皓

（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.柳州市質(zhì)量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州 545000）

果酒是以水果汁（漿）為原料利用酵母菌的發(fā)酵作用產(chǎn)生乙醇和二氧化碳后得到的含酒精飲料。百香果果實中含有豐富的可溶性糖、有機酸和維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)以及揮發(fā)性物質(zhì)，香氣濃郁，甜酸怡人，具有良好的加工食用價值[1]。由于近年來百香果種植面積擴大，導(dǎo)致百香果價格降低，市場滯銷現(xiàn)象時有發(fā)生[2]。而百香果果酒作為百香果深加工產(chǎn)品之一，具有豐富的保健功效[3]，能夠增加百香果鮮果的附加值。目前，百香果果酒的釀造大多采用游離酵母發(fā)酵方式，如程宏楨等[4]以紫皮百香果為原料，采用游離發(fā)酵方式對百香果全果進行發(fā)酵，并優(yōu)化了發(fā)酵工藝。胡來麗等[5]為提升百香果果酒品質(zhì)，以百香果全果和果汁為原料進行百香果果酒的釀制，發(fā)現(xiàn)全果發(fā)酵得到的果酒風(fēng)味更為突出。

隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的進步，將酵母菌固定在載體上（即酵母固定化）進行酒精發(fā)酵的方式受到廣泛關(guān)注，有關(guān)固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)各種酒類（如香檳、葡萄酒等）的報道也不斷增多[6-8]。固定化酵母發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)點有很多，如能夠增加細(xì)胞的穩(wěn)定性和活力、提高發(fā)酵的生產(chǎn)效率、細(xì)胞能夠重復(fù)回收利用和改善發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量等。酵母細(xì)胞的固定化首先要解決固定化載體的選擇問題。一般地，對應(yīng)用于果酒生產(chǎn)的酵母細(xì)胞的固定化載體的要求是惰性且衛(wèi)生無毒的材料，同時也要求載體材料來源豐富，價格低廉等[9]。甘蔗渣是甘蔗制糖產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)生的廢棄產(chǎn)物，在南方地區(qū)來源豐富，使用成本低。而且，甘蔗渣中的纖維素含量豐富、結(jié)晶度高[10]，已有研究將甘蔗渣作為固定化載體吸附細(xì)胞進行發(fā)酵，如發(fā)酵葡萄酒[11]、發(fā)酵桑葚果酒[12]、雪蓮果-西番蓮果酒[13]等。但目前利用甘蔗渣固定化釀酒酵母發(fā)酵制備百香果果酒的研究較少。

為了考察甘蔗渣固定化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）應(yīng)用于百香果果酒的酒精發(fā)酵的可行性，本研究以甘蔗渣為載體吸附固定釀酒酵母YJSF190制備固定化釀酒酵母，并以游離釀酒酵母YJSF190作為對照，采用固定化釀酒酵母釀造百香果果酒，采用氣相色譜法和液相色譜法等方法測定果酒中的乙醇、殘?zhí)恰⒂袡C酸和乙酸乙酯的含量，考察甘蔗渣固定化釀酒酵母重復(fù)6個批次發(fā)酵百香果果漿的效果，為固定化酵母發(fā)酵百香果果酒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

甘蔗渣：甘蔗去皮后經(jīng)壓榨裝置除去甘蔗汁而得的普通蔗渣，從售賣甘蔗汁的小攤販處獲得；百香果果漿（初始糖度16.3°Bx，蔗糖70.44 g/L，葡萄糖42.27 g/L，果糖42.19 g/L，pH 2.83）：廣西銪熠果業(yè)有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YJSF1909：本實驗室從自然發(fā)酵的百香果果酒中分離純化、鑒定得到，保存于甘油管中。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：英國Oxiod公司；瓊脂（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；焦亞硫酸鉀（分析純）：浙江一諾生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：廣東西隴科學(xué)股份有限公司。3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水葡萄糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1 000 mL，115 ℃條件下滅菌20 min。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，水1 000 mL，115 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Hitachi SU8100電子顯微鏡、Hitachi L 2000高效液相色譜儀：日立制作所株式會社；Scion 456-GC氣相色譜：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；PHS-25CW pH計：上海般特儀器制造有限公司；LS-B100L-1型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TDL-5離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；HWY-2112智能恒溫培養(yǎng)搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；SWCJ-TB標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；WYT-4手持糖度計：山東桑澤儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備

將釀酒酵母YJSF1909接種在YPD固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化48 h；取兩環(huán)活化后的酵母菌接種至裝液量為5 mL/25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，得到一級種子液。將5 mL一級種子液接種至裝液量為200 mL/500 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，得到二級種子液，備用。

1.3.2 甘蔗渣的預(yù)處理

為提高甘蔗渣與酵母細(xì)胞的結(jié)合力，參照SURENDHIRAN D 等[14]的方法，甘蔗渣需先經(jīng)堿液預(yù)處理以除去甘蔗渣中的纖維素，再應(yīng)用于酵母的吸附固定。具體方法為：將甘蔗渣切成0.5 cm×0.5 cm大小的甘蔗渣片，放入裝有適量蒸餾水的燒杯中煮沸30 min，使殘余糖分滲出，取出甘蔗渣片并將其浸泡于0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中12 h后取出，用清水洗滌甘蔗渣片至水洗液pH值為中性，接著在真空烘箱中70 ℃條件下烘干，最后在121 ℃滅菌15 min。

1.3.3 甘蔗渣固定化酵母的制備

分別取200 mL酵母細(xì)胞二級種子液置于編號為A、B的500 mL錐形瓶中，在A瓶中加入1 g經(jīng)預(yù)處理后的甘蔗渣，然后將A、B兩份種子液均在4 ℃條件下放置24 h，使A瓶中的蔗渣充分吸附酵母菌。然后，晃動A、B兩個錐形瓶使酵母菌分布均勻后，用移液槍取樣，采用血球計數(shù)板測定A、B兩瓶中的游離酵母菌數(shù)量。B瓶的酵母菌計數(shù)減去A瓶的酵母菌計數(shù)即得到吸附于蔗渣上的酵母菌數(shù)量。將A瓶中的發(fā)酵液傾倒除去發(fā)酵液中未固定的酵母細(xì)胞，并用滅菌生理鹽水輕輕沖洗兩次，得到含固定化酵母的蔗渣片[12]。將含有固定化酵母的蔗渣片送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行電子顯微鏡掃描。

1.3.4 百香果果酒的制備

用白砂糖將百香果果漿的糖度調(diào)至20°Bx，同時加入焦亞硫酸鉀（50 mg/L），以防止雜菌污染。然后分別采用1.3.3制得的含固定化酵母的蔗渣片對百香果果漿進行重復(fù)6個批次酒精發(fā)酵，同時以游離態(tài)酵母發(fā)酵百香果果漿為對照組。具體方法如下：

固定化酵母發(fā)酵：取200 mL百香果果漿于錐形瓶中，接入1.3.3所制得的含固定化酵母的蔗渣片（酵母菌數(shù)量約為6.45×109個/g蔗渣），置于搖床中進行酒精發(fā)酵，發(fā)酵溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。每隔8 h用糖度計測定糖濃度，當(dāng)糖濃度穩(wěn)定不變時，視為酒精發(fā)酵結(jié)束，記錄發(fā)酵時間。為了考察甘蔗渣固定化酵母的發(fā)酵穩(wěn)定性，固定化發(fā)酵重復(fù)6個批次。每次發(fā)酵結(jié)束后，取出含固定化酵母的蔗渣片，用滅菌生理鹽水洗滌兩次后，重復(fù)利用于下一批次的發(fā)酵中。每次發(fā)酵使用的百香果果漿量和發(fā)酵的條件均相同。

游離酵母發(fā)酵（對照組）：接入與蔗渣片所固定的酵母相同數(shù)量（酵母菌數(shù)量約為6.45×109個/g蔗渣）的游離酵母于200 mL百香果果漿中，在與固定化發(fā)酵相同條件下進行游離酵母發(fā)酵。

1.3.5 分析檢測

（1）乙醇含量的測定

采用氣相色譜法測定乙醇含量[15]。取2 mL 酒精發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵漿液離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，稀釋10倍后取適量稀釋液裝入進樣瓶中進行乙醇含量測定。氣相色譜檢測條件為：火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）：進樣口溫度150 ℃；檢測器溫度180 ℃；進樣量0.5 μL；毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；氮氣（N2）流速25 mL/min；氫氣（H2）流速30.0 mL/min；空氣流速300.0 mL/min。程序升溫：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min增加到100 ℃保持2 min。分流比為20∶1。

（2）有機酸的測定

采用高效液相色譜法測定[16]。取2 mL 發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵漿液離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，稀釋10倍后取適量稀釋液裝入進樣瓶中進行有機酸含量測定。高效液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；空氣流速2.0 L/min。

（3）果糖、葡萄糖、蔗糖的測定

采用高效液相色譜法測定[17]。取2 mL 發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵漿液離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，稀釋10倍后取適量稀釋液裝入進樣瓶中進行糖類物質(zhì)的含量測定。高效液相色譜條件：氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相為乙腈∶超純水=75∶25（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；示差折光檢測器（refractive index detector，RID）；溫度30 ℃。

（4）總殘?zhí)堑臏y定

總殘?zhí)呛客ㄟ^3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定[18]，將0.1 mL樣品和3.9 mL去離子水在試管中混合，然后將0.08 mL 12 mol/L HCl添加到混合物中。在90 ℃水解15 min，并用0.2 mL 5 mol/L NaOH中和后，取樣品和不同質(zhì)量濃度（0、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加入DNS溶液2 mL，置沸水浴中煮2 min進行顯色，迅速冷卻，定容至25 mL。在波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.193 4x+0.016 7（相關(guān)系數(shù)R2＞0.99），并按照回歸方程計算樣品中總殘?zhí)橇俊?/p>

（5）乙酸乙酯的測定

采用氣相色譜法測定乙酸乙酯[19]。取2 mL發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵漿液離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，裝入進樣瓶中進行乙酸乙酯含量測定。氣相色譜條件為：火焰離子化檢測器（FID），進樣口溫度210 ℃，檢測器溫度230 ℃，進樣量0.5 μL，毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），氮氣（N2）（純度99.999%）流速25 mL/min；氫氣（H2）流速30.0 mL/min；空氣流速300.0 mL/min。程序升溫：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至80 ℃保持2 min，再以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min。分流比為20∶1。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

對每個實驗都進行3次平行測定，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用Microsoft Office Excel 2016、Origin 9.0、SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗渣固定化酵母的制備

酵母細(xì)胞固定化的方式主要有吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法、交聯(lián)法四種[20]。本研究中采用蔗渣為載體通過吸附的方法對酵母細(xì)胞進行固定化。酵母細(xì)胞吸附于蔗渣上的掃描電鏡結(jié)果見圖1。

圖1 蔗渣固定化酵母的電鏡掃描結(jié)果Fig.1 Electron microscope scanning results of immobilized yeast with bagasse

由圖1可知，酵母菌能夠被吸附于蔗渣的薄壁組織上。酵母細(xì)胞的吸附主要依賴于蔗渣和帶電荷的細(xì)胞表面之間的靜電作用，以及甘蔗渣多孔結(jié)構(gòu)的自然誘捕，這兩種方式使得酵母細(xì)胞與甘蔗渣表面保持密切接觸，使得酵母細(xì)胞牢牢的吸附在甘蔗渣上并進行繁殖。有研究證實了一些植物材料如玉米顆粒、葡萄皮和西瓜皮等均能夠吸附酵母菌并應(yīng)用于酒精發(fā)酵中[21-22]。通過對吸附于蔗渣上的酵母菌的數(shù)量的測定，采用蔗渣吸附酵母菌能力數(shù)量達(dá)到了6.45×109個/g蔗渣，效果要優(yōu)于之前研究的其他植物材料，如有報道稱玉米顆粒吸附酵母菌的數(shù)量為3.4×107個/g玉米粒[23]。

2.2 兩種酵母酒精發(fā)酵的乙醇產(chǎn)出

相比于游離發(fā)酵，固定化發(fā)酵的優(yōu)點之一是酵母細(xì)胞可以重復(fù)回收利用，因此利用固定化酵母發(fā)酵時，固定化酵母的重復(fù)發(fā)酵穩(wěn)定性及其對產(chǎn)品品質(zhì)的影響是需要考察的重點方面。ARGYRIS T等[24]采用葡萄渣固定化酵母釀造葡萄酒，并重復(fù)使用固定化酵母連續(xù)發(fā)酵10批次。KOURKOUTAS Y等[25]通過將酵母固定在蘋果皮上進行連續(xù)批次發(fā)酵葡萄酒，并進行了5個批次發(fā)酵。綜合考慮固定化酵母能夠重復(fù)利用的特點，本研究中以游離酵母發(fā)酵為對照，采用甘蔗渣固定化釀酒酵母進行6批次連續(xù)發(fā)酵百香果果漿，每批次發(fā)酵結(jié)束后，將固定有酵母細(xì)胞的甘蔗渣用滅菌生理鹽水進行清洗后應(yīng)用于下一次的重復(fù)使用。兩種酵母酒精發(fā)酵的乙醇產(chǎn)出情況見表1。

表1 固定化酵母和游離酵母釀造百香果果酒的乙醇產(chǎn)出比較Table 1 Comparison of ethanol production of passion fruit wine brewed by immobilized yeast and free yeast

相比于游離酵母發(fā)酵，使用固定化酵母連續(xù)六批次發(fā)酵結(jié)束時乙醇產(chǎn)量均比游離酵母發(fā)酵高，差值為1.86～28.01 g/L，且從第三批次開始，甘蔗渣固定化酵母完成發(fā)酵所需的時間約縮短8 h。這可能是酵母細(xì)胞固定化后其對乙醇和酸性的耐受性提高，因此固定化酵母發(fā)酵比游離酵母發(fā)酵活性更好的緣故[26]。游離酵母釀造百香果果酒乙醇產(chǎn)量為96.36 g/L、乙醇產(chǎn)出速率為2.01 g/（L·h）、總殘?zhí)菫?.14 g/L，固定化酵母釀造百香果果酒乙醇產(chǎn)量為98.22～124.37 g/L，乙醇產(chǎn)出速率為2.05～3.11g/（L·h），總殘?zhí)菫?.62～4.09 g/L。結(jié)果表明固定化酵母發(fā)酵對糖類物質(zhì)利用更加徹底。

綜上，固定化酵母釀造百香果果酒的乙醇產(chǎn)量和乙醇產(chǎn)出速率優(yōu)于游離酵母。

2.3 兩種酵母酒精發(fā)酵的殘?zhí)菢?gòu)成

對發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量進行測定，結(jié)果見表2。

百香果果漿中蔗糖70.44 g/L，葡萄糖42.27 g/L，果糖42.19 g/L。由表2可知，兩種發(fā)酵方式的發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵漿液中蔗糖、葡萄糖和果糖的質(zhì)量濃度都較低，固定化酵母發(fā)酵蔗糖和葡萄糖最低分別可降至0.07 g/L、0.19 g/L，而果糖能夠得到完全消耗。游離酵母發(fā)酵蔗糖、葡萄糖和果糖質(zhì)量濃度分別降至1.27 g/L、0.43 g/L、0.46 g/L。說明兩種發(fā)酵方式都能很好地利用底物中的糖類物質(zhì)。

表2 固定化酵母和游離酵母釀造百香果果酒殘?zhí)墙M成比較Table 2 Comparison of residual sugar composition of passion fruit wine brewed by immobilized yeast and free yeast

固定化酵母發(fā)酵對蔗糖的消耗量平均值為98.79%，對葡萄糖的消耗量平均值為99.14%，對果糖的消耗量平均值為99.32%。游離酵母發(fā)酵對蔗糖的消耗量為98.20%，對葡萄糖的消耗量為98.98%，對果糖的消耗量為98.91%。

綜上，可以看出，固定化酵母發(fā)酵對蔗糖、葡萄糖和果糖的消耗利用率稍高于游離發(fā)酵，這種情況與利用葡萄皮固定化酵母細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵葡萄酒的結(jié)果相似[26]。

2.4 兩種酵母酒精發(fā)酵的有機酸含量

果酒中有機酸主要有草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，主要來源于發(fā)酵的果汁中和發(fā)酵過程中的酵母代謝[27]。對發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中部分有機酸含量進行測定，結(jié)果見表3。

表3 固定化酵母和游離酵母釀造百香果果酒的有機酸含量比較Table 3 Comparison of organic acid contents of passion fruit wine brewed by immobilized yeast and free yeast

草酸是一種二元酸，有酸的口感，但并沒有香氣[28]。由表3可知，草酸含量經(jīng)過兩種方式發(fā)酵后均有所下降，固定化酵母發(fā)酵草酸含量下降至0.29～0.44 g/L，游離酵母發(fā)酵草酸含量下降至0.48 g/L，說明固定化酵母發(fā)酵能夠更有效的降低草酸含量。

酒石酸對酒體口感以及穩(wěn)定性影響較大，酒石酸含量過高，會使酒體口感有澀味[29]。百香果果漿經(jīng)過固定化發(fā)酵后，酒石酸含量由1.36 g/L降低至0.78～0.96 g/L，而經(jīng)過游離發(fā)酵后，酒石酸含量降低至1.06 g/L，固定化酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒石酸與游離酵母發(fā)酵產(chǎn)生的有顯著性差異（P＜0.05）。

高含量的蘋果酸會讓酒體口感酸澀[30]。百香果果漿中蘋果酸的含量為7.37 g/L，經(jīng)過固定化發(fā)酵后，蘋果酸含量降低至2.61～3.80 g/L，6個批次發(fā)酵的平均值為3.34 g/L。游離酵母發(fā)酵后，蘋果酸含量降至3.56 g/L，固定化酵母發(fā)酵與游離酵母發(fā)酵相比，固定化酵母發(fā)酵能有效降低蘋果酸含量。

乙酸作為果酒中不良有機酸，其較高含量會掩蓋果酒的香氣，使酒體口感不協(xié)調(diào)[31]。百香果果漿經(jīng)過兩種方式發(fā)酵后，乙酸含量都有所上升，這是由于乙酸可通過酵母菌參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生[32]。固定化酵母發(fā)酵的乙酸含量由10.07 g/L升至15.11～20.18 g/L，但低于游離酵母發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量（21.67 g/L），說明固定化酵母發(fā)酵的應(yīng)用可以減少乙酸對果酒香氣的影響。

檸檬酸的酸味溫和清爽，能夠賦予果酒適宜的酸度感受[33]。經(jīng)過固定化酵母發(fā)酵后，檸檬酸含量處于33.40～45.83 g/L的范圍，6個批次發(fā)酵的平均值為41.04 g/L，低于游離酵母發(fā)酵的檸檬酸含量44.54 g/L。

琥珀酸能夠影響酒體風(fēng)味的形成，是酒中最富于味覺反應(yīng)的一種酸[34]。琥珀酸含量在發(fā)酵之后升高，是由于酵母菌在三羧酸循環(huán)中代謝產(chǎn)生以及果汁中谷氨酸的轉(zhuǎn)化[35]。固定化酵母發(fā)酵使得琥珀酸由原來的1.05 g/L升至2.68 g/L，而游離酵母發(fā)酵升至3.16 g/L，固定化酵母發(fā)酵產(chǎn)生的琥珀酸明顯少于游離酵母發(fā)酵。

綜上，固定化酵母發(fā)酵的果酒中草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量都有所下降，乙酸和琥珀酸含量上升。相比較兩種發(fā)酵方式，固定化酵母發(fā)酵的果酒中有機酸含量除檸檬酸外均低于游離酵母發(fā)酵。

2.5 乙酸乙酯含量

乙酸乙酯是果酒中重要的揮發(fā)性化合物之一，它的存在對果酒感官特性有著積極的影響，少量的乙酸乙酯會令果酒產(chǎn)生花香和果香，但過多的乙酸乙酯會給果酒帶來苦澀的口感[36]。實驗中對發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中乙酸乙酯的含量進行了測定，結(jié)果見圖2。

圖2 固定化酵母和游離酵母釀造百香果果酒的乙酸乙酯含量比較Fig.2 Comparison of ethyl acetate contents of passion fruit wine brewed by immobilized yeast and free yeast

由圖2可知，固定化酵母發(fā)酵所得百香果果酒的乙酸乙酯含量為15.7～22.86 mg/L，而游離酵母發(fā)酵所得百香果果酒乙酸乙酯含量為14.3 mg/L，乙酸乙酯在發(fā)酵過程中由發(fā)酵液中的乙酸和乙醇通過酯化反應(yīng)而來[37]，結(jié)合表2中采用固定化發(fā)酵的樣品中乙酸含量較游離發(fā)酵低可知，乙酸的減少可能是參與了酯化反應(yīng)，因此固定化酵母發(fā)酵的樣品中乙酸乙酯含量均稍高于游離酵母發(fā)酵，證明固定化后酵母細(xì)胞活性較好。

綜上，固定化酵母發(fā)酵乙酸乙酯含量優(yōu)于游離發(fā)酵，為百香果果酒增加了果香。

3 結(jié)論

本實驗以游離酵母發(fā)酵作為對照，采用甘蔗渣固定化釀酒酵母連續(xù)重復(fù)6批次發(fā)酵百香果果漿，比較了各批次發(fā)酵結(jié)束后乙醇、殘?zhí)?、有機酸和乙酸乙酯的含量。結(jié)果顯示，甘蔗渣吸附固定酵母細(xì)胞的數(shù)量為6.45×109個/g蔗渣，電鏡觀察到酵母細(xì)胞能夠被吸附分布于甘蔗渣的表面。百香果果酒發(fā)酵過程中，固定化酵母發(fā)酵對糖類物質(zhì)的利用較徹底，乙醇產(chǎn)出量與產(chǎn)出速率要高，且增加了乙酸乙酯含量，對百香果果酒的口感與風(fēng)味可能有益。連續(xù)重復(fù)批次發(fā)酵的結(jié)果表明，固定化酵母在重復(fù)批次發(fā)酵的過程中具有較好的發(fā)酵穩(wěn)定性，具有一定的連續(xù)發(fā)酵百香果果酒的能力。因此，甘蔗渣固定化酵母應(yīng)用于百香果果酒的釀造是可行的。