TMPRSS2重組蛋白阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染

潘 婷,彭倩文,杜艷蕓,王晨輝,2,3*

(1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,中國湖北 武漢 430074;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點實驗室,中國四川 成都 610031;3.電子科技大學(xué),中國四川 成都 611731)

2019年底出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在國內(nèi)和國際上的快速傳播導(dǎo)致了全球衛(wèi)生緊急事件。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)入侵宿主細(xì)胞首先依賴于病毒刺突蛋白S(spike glycoprotein)與細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)的結(jié)合,隨后宿主細(xì)胞蛋白酶對S蛋白進(jìn)行切割激活,進(jìn)而促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜融合,ACE2與宿主細(xì)胞蛋白酶在病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1]。Glowacka等[2]曾報道,Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TMPRSS2)的分布與SARS-CoV在肺部的感染相關(guān),該蛋白酶可以有效地激活冠狀病毒的S蛋白,在細(xì)胞表面誘導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合。

1997年,TMPRSS2基因通過系統(tǒng)外顯子捕獲實驗在人類21號染色體上首次被發(fā)現(xiàn)。其全長cDNA編碼由492個氨基酸組成的蛋白質(zhì)[3],該蛋白質(zhì)固定在質(zhì)膜上,屬于TTSPs家族(Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶)。TTSPs的特征是包含一個短的細(xì)胞內(nèi)N端結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個大的胞外結(jié)構(gòu)域,其中胞外結(jié)構(gòu)域由一個可變莖區(qū)和一個糜蛋白酶S1折疊的C端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[4～5]。根據(jù)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的莖區(qū)組成和系統(tǒng)發(fā)育分析,TTSPs被分為人氣道胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(human airway trypsin-like protease,HAT)、蛋白質(zhì)裂解酶(matriptase)、跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSSs)和絲氨酸酶4個亞家族[6]。

SARS-CoV-2是一種主要通過呼吸途徑傳播的急性傳染病的病原體。盡管ACE2存在于所有器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞中,但SARS-CoV和SARSCoV-2僅在肺部具有高致病性[7～8]。此外,雖然在Ⅰ型和Ⅱ型肺細(xì)胞中均有ACE2的表達(dá)[9],但SARSCoV-2的細(xì)胞向性與ACE2的表達(dá)并不嚴(yán)格相關(guān),這表明COVID-19的發(fā)病機(jī)制還需要其他因素來解釋[9]。TMPRSS2在人肺的上皮細(xì)胞中高度表達(dá)[10]。已知各種蛋白酶,如胰蛋白酶、類胰蛋白酶、人氣道胰蛋白酶和TMPRSS2,都能夠裂解甲型流感病毒血凝素的糖蛋白,并且TMPRSS2是病毒和宿主細(xì)胞膜融合的先決條件[11]。許多病毒,如人類免疫缺陷病毒(HIV)和尼帕病毒,在感染細(xì)胞過程中由細(xì)胞蛋白酶(如弗林蛋白酶或組織蛋白酶)切割病毒糖蛋白,從而分離病毒的受體結(jié)合亞基和膜融合亞基,并將糖蛋白前體轉(zhuǎn)化為融合狀態(tài)[12]。對于埃博拉病毒和SARS冠狀病毒,病毒糖蛋白被內(nèi)吞體蛋白酶裂解,在病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中,誘導(dǎo)受體結(jié)合或內(nèi)吞作用導(dǎo)致的構(gòu)象變化[13]。有3種蛋白酶,即胰蛋白酶、組織蛋白酶L和彈性蛋白酶,曾被報道能夠激活SARS冠狀病毒的S蛋白[14～16]。在細(xì)胞表面缺乏上述蛋白酶的情況下,SARS冠狀病毒通過內(nèi)吞體途徑進(jìn)入細(xì)胞,S蛋白被內(nèi)吞體中的組織蛋白酶L激活[17～18]。相反,在細(xì)胞表面存在上述蛋白酶(如胰蛋白酶和彈性蛋白酶)時,附著在宿主細(xì)胞表面受體上的病毒S蛋白會被這些蛋白酶激活,誘導(dǎo)包膜-質(zhì)膜融合,隨后介導(dǎo)SARS冠狀病毒直接進(jìn)入細(xì)胞[19]。后一種情況下的病毒復(fù)制效率更高,比內(nèi)吞體途徑的復(fù)制效率高100倍[19],這表明,SARS冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥可能是蛋白酶介導(dǎo)的病毒直接進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致的復(fù)制增強(qiáng)。

TMPRSS2在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。類似地,人偏肺病毒(human metapenumovirus,HMPV)的融合蛋白F是作為單一表面糖蛋白合成的,需要被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解才能使病毒繁殖[20]。這種病毒主要在幼兒中引起嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎和肺炎。既往研究表明,TMPRSS2是HMPV F蛋白的有效激活劑[21]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),除了組織蛋白酶L外,TMPRSS2也能激活SARS-CoV的刺突蛋白S[22]。TMPRSS2對S蛋白的切割促進(jìn)了SARS冠狀病毒從細(xì)胞表面直接進(jìn)入宿主細(xì)胞,而不依賴于內(nèi)吞體途徑中組織蛋白酶L的活性[23]。之前的一項研究發(fā)現(xiàn),非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat處理后,SARS冠狀病毒對Calu3細(xì)胞的感染相比較未處理的對照組降低了90%[24]。

基于以上信息,我們推測TMPRSS2可能成為抗SARS-CoV-2感染的潛在靶點。我們前期通過研究TMPRSS2蛋白酶存在的幾種形式,發(fā)現(xiàn)TMPRSS2會通過自剪切發(fā)揮酶活,并且確認(rèn)了野生型TMPRSS2在具有酶活的狀態(tài)下仍然錨定在膜上,提示TMPRSS2可以作為一種阻斷病毒進(jìn)入的細(xì)胞表面靶點。因此,我們純化了酶活位點和剪切位點雙突變的TMPRSS2重組蛋白,該重組蛋白通過與Calu3細(xì)胞表面具有酶活性的TMPRSS2競爭性結(jié)合SARS-CoV-2的S蛋白,抑制宿主細(xì)胞表面的TMPRSS2對病毒S蛋白的裂解激活,從而阻斷病毒與宿主細(xì)胞的膜融合,進(jìn)而阻斷SARS-CoV-2的感染。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人胚腎細(xì)胞系HEK293T購自武漢普建生物科技有限公司,在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)基中。人肺腺癌細(xì)胞系Calu3購于上海富衡細(xì)胞庫,在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖 MEM(Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)基中。HeLa細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC),在 37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco2購自ATCC,在37℃、5%的CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素、10%胎牛血清和1%丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基中。人胚腎懸浮細(xì)胞FreeStyleTM293F購于賽默飛世爾科技公司,利用緩沖底三角培養(yǎng)瓶,在37℃、5%的CO2、120 r/min懸浮培養(yǎng)箱條件下,傳代于FreeStyleTM293F表達(dá)培養(yǎng)基中。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

PLVX-FLAG-TMPRSS2-Puro購自武漢淼靈生物科技有限公司,在它的基礎(chǔ)上將255位氨基酸AGG點突變?yōu)镃AG,得到PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q-Puro質(zhì)粒,在此突變的基礎(chǔ)上將441位氨基酸AGT點突變?yōu)镚CT,得到PLVXFLAG-TMPRSS2-R255Q+S441A-Puro。隨后,以雙突變的PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q+S441APuro為模板,使用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ(GAGCTC)和Xho Ⅰ(CTCGAG),將雙突變的TMPRSS2構(gòu)建到pINFUSE-hIgG2-FC蛋白表達(dá)載體(購自Invivo-GEN公司)上。所需引物見表1。

表1 主要引物信息Table 1 The sequences of primers in this study

1.3 TMPRSS2重組蛋白的表達(dá)和純化

為制備TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-FC蛋白,將293F細(xì)胞擴(kuò)培至300 mL,當(dāng)密度達(dá)到2×106mL-1時平均分到兩個搖瓶中,每個搖瓶中150 mL,向每個搖瓶中各補(bǔ)120 mL新鮮培養(yǎng)基至270 mL的終體積。隨后,使用轉(zhuǎn)染試劑Polyplus FectoPRO(購自法國Polyplus Transfection公司),按照如下條件:轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒(μg)∶總培養(yǎng)基(mL)=1∶2;轉(zhuǎn)染試劑(μL)∶質(zhì)粒(μg)=1.5∶1;輔助轉(zhuǎn)染試劑Booster在培養(yǎng)基中的用量為0.45 μL/mL,瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pINFUSE-TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-hIgG2-FC(含該蛋白質(zhì)編碼序列)。處理3 d后,檢測細(xì)胞活率,收集部分上清液,初步檢測蛋白質(zhì)在上清中的表達(dá);6 d后,收集上清液,用Protein G柱(GE Healthcare)經(jīng)親和層析純化可溶性蛋白。

1.4 免疫印跡

向瞬時轉(zhuǎn)染了TMPRSS2三種突變體的HEK-293T細(xì)胞中加入IP-Buffer裂解液(本實驗室配制),冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min,取上清液到新的EP管中,棄沉淀,加適量的5×上樣緩沖液(本實驗室配制),95℃加熱5 min,通過SDSPAGE將蛋白質(zhì)條帶分離開來。將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到甲醇激活的PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜完成后分別使用脫脂牛奶封閉1 h,采用特異性的一抗(圖1A中的一抗為購自日本GNI公司的anti-Flag monoclonal antibody;圖1B中的一抗為購自武漢普建生物科技有限公司的anti-mouse IgGFC antibody),按照1∶1 000的比例用脫脂牛奶配制后于4℃孵育過夜,利用對應(yīng)的二抗(圖1中的二抗都是購自賽默飛世爾科技公司的goat antimouse IgG(H+L)secondary antibody,HRP),按照1∶2 000的比例用脫脂牛奶配制后在常溫孵育2 h,隨后使用化學(xué)發(fā)光顯影液,將PVDF膜置于ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光,結(jié)果圖片使用Image Lab進(jìn)行分析。

1.5 免疫熒光顯微技術(shù)

將HeLa細(xì)胞種至直徑1.5 cm的孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到40%～50%時,用pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,再用0.5%Triton X-100溶液處理細(xì)胞20 min,然后加入5%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)作為阻斷緩沖液,室溫封閉1 h。加入用5%BSA溶液稀釋的一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜,吸棄一抗后,加入帶熒光的二抗FITC。實驗所用的一抗為AbclonalhTMPRSS2 Ab,相應(yīng)的FITC標(biāo)記的二抗(1∶500)購自Beyotime Biotechnology。細(xì)胞核使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)于室溫下避光染色15 min,然后在OLYMPUS FV3000共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 SARS-CoV-2假病毒的包裝

SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的[25]。在轉(zhuǎn)染前一天,制備HEK293T細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1,其中15 mL轉(zhuǎn)入T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%的CO2條件培養(yǎng)箱中孵育過夜。當(dāng)過夜培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到70%～90%的密度時,將表達(dá)刺突蛋白S的DNA質(zhì)粒(購自北京義翹神州科技有限公司)與psPAX2(購自Addgene公司)、pLenti-Luc2(購自武漢淼靈生物科技有限公司)按照1∶1∶2的質(zhì)量比進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6 h后,用新鮮的含有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基替換,再孵育36 h,收集含有假病毒的培養(yǎng)上清液,離心后過濾(孔徑為0.45 μm),并在-80℃下保存待用。

1.7 感染程度的測定

在假病毒的包裝過程中,我們將熒光素酶的序列加入到系統(tǒng),故該假病毒也可以表達(dá)熒光素酶,該熒光素酶可以與熒光素酶的底物反應(yīng),通過熒光強(qiáng)度顯示病毒感染細(xì)胞的效率。假病毒感染前24 h,將HEK293T、Calu3或Caco2細(xì)胞接種于96孔板(JET BIOFIL),每孔1×104個細(xì)胞。待第2天細(xì)胞貼壁后,將包裝好的假病毒上清每孔100 μL加入到種好細(xì)胞的96孔板內(nèi),細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后,吸棄上清,再向96孔板中每孔加入30 μL的細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,隨后收集裂解液到1.5 mL EP管中,12 000 r/min離心5 min,取5 μL上清液與熒光素酶底物20 μL混合,15 s內(nèi)用LUMINOMETER機(jī)器檢測混合物的熒光。

1.8 中和實驗測試

在假病毒感染前,每孔1×104個Calu3細(xì)胞接種于96孔板(JET BIOFIL)。將TMPRSS2重組蛋白按照30 μg/mL的量加入Calu3細(xì)胞中。37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒加入混合物中孵育36 h。取熒光素酶底物(20 μL/孔)至1.5 mL EP管中,再向EP管中加5 μL細(xì)胞裂解上清。混勻后將EP管轉(zhuǎn)移到LUMINOMETER中,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,顯著性水平為P＜0.05。采用Prism計算機(jī)軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS2突變體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化

報道顯示,TMPRSS2的實際裂解位點是Arg-255-Ile-256鍵,如果蛋白酶活性結(jié)構(gòu)域催化三聯(lián)體中的第441位絲氨酸突變?yōu)楸彼?S441A),則TMPRSS2失去蛋白酶活性[26]。

基于這一報道,我們構(gòu)建了TMPRSS2突變體重組蛋白。該重組蛋白不具有蛋白酶活性,也不會發(fā)生自剪切,是TMPRSS2全長的胞外段。我們在HEK293T中分別過表達(dá)野生型和突變型的TMPRSS2,結(jié)果顯示,在野生型的TMPRSS2(WTTMPRSS2)中明顯觀察到細(xì)胞相關(guān)的C端切割片段,但在TMPRSS2的R255Q(剪切位點)突變體和S441A(酶活位點)突變體以及二者的雙突變體中只能觀察到很少的切割(圖1A),這證實了TTSPTMPRSS2的剪切形式確實是通過自催化活性產(chǎn)生的。我們在HEK293T中過表達(dá)R255Q、S441A和R255Q+S441A這3種TMPRSS2突變體蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)這3種蛋白質(zhì)大多數(shù)都作為全長70 kD的酶原形式存在(圖1A)。該結(jié)果與之前的報道相一致,TTSPs是作為非活性的單鏈原酶(酶原)合成的,在運輸?shù)郊?xì)胞表面期間或之后發(fā)生自裂解,形成活性形式[26～27]。

隨后,我們在真核細(xì)胞293F中表達(dá)雙突變體的TMPRSS2蛋白,轉(zhuǎn)染6 d后收集細(xì)胞上清,發(fā)現(xiàn)雙突變的TMPRSS2重組蛋白能正常表達(dá),并且以全長二聚體的形式分泌到上清中(圖1B)。

圖1 TMPRSS2突變體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化(A)TMPRSS2的自剪切形式。將野生型TMPRSS2及3種突變體瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞冰上裂解,Western-blot技術(shù)分析帶FLAG標(biāo)簽的幾種TMPRSS2突變體蛋白質(zhì)條帶的位置,最右側(cè)條帶為蛋白質(zhì)marker;(B)TMPRSS2重組蛋白的純化。將構(gòu)建成功的(從左到右)WT-TMPRSS2-FC、TMPRSS2-R255Q-FC、TMPRSS2-S441A-FC和TMPRSS2-R225Q+S441A-FC的pINFUSE表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中,6 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,提純蛋白質(zhì)后進(jìn)行Westernblot分析,最右側(cè)條帶為蛋白質(zhì)marker。Fig.1 Construction and protein purification of TMPRSS2 mutant(A)Self-shearing form of TMPRSS2.The wild-type TMPRSS2 and three mutants were transiently transfected into HEK293T cells.The cells were collected for ice lysis 48 h later.The TMPRSS2 mutants labeled with FLAG were analyzed by Westernblot.The rightmost lane is the protein marker;(B)Purification of TMPRSS2 recombinant protein.The constructed pINFUSE plasmids expressing WT-TMPRSS2-FC,TMPRSS2-R255Q-FC,TMPRSS2-S441A-FC and TMPRSS2-R225Q+S441A-FC were transfected into 293F cells.Six days later,the purified proteins were collected from the supernatants of cell cultures and analyzed by Western-blot.The right most lane is the protein marker.

2.2 假病毒感染宿主細(xì)胞體系的建立

為了研究純化的TMPRSS2突變體重組蛋白對SARS-CoV-2的抑制活性,我們在體外構(gòu)建了假病毒感染細(xì)胞的體系:構(gòu)建SARS-CoV-2 S蛋白攜帶水皰性口炎病毒(ΔG-VSV/熒光素酶)假病毒用作細(xì)胞感染。VSVG(皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G)是一種包膜蛋白,因為這種抗原在很多細(xì)胞表面都能找到對應(yīng)的受體,所以這個包膜蛋白具有廣泛的宿主范圍。病毒通過包膜蛋白與宿主細(xì)胞識別后,繼而通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。因此,本研究使用VSVG作為病毒能夠感染進(jìn)宿主細(xì)胞的陽性對照。

用包裝好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒分別感染HEK293T細(xì)胞系、Calu3細(xì)胞系和Caco2細(xì)胞系。曾有文獻(xiàn)報道,ACE2的融合蛋白對病毒感染具有顯著的阻斷效果[28]。因此我們使用純化的人的ACE2融合蛋白作為阻斷病毒感染的陽性對照。圖2的結(jié)果顯示:在HEK293T細(xì)胞系和Calu3細(xì)胞系中,病毒感染率較高,且感染能被ACE2融合蛋白顯著阻斷。相關(guān)文獻(xiàn)報道,Calu3細(xì)胞系中有內(nèi)源性的TMPRSS2穩(wěn)定表達(dá),而HEK239T中沒有TMPRSS2的表達(dá)[1];在本研究中,圖2的結(jié)果顯示,假病毒感染Caco2細(xì)胞的效率較低。因此,我們最終選定Calu3細(xì)胞系作為TMPRSS2研究的主要細(xì)胞載體,并使用目前的病毒感染體系用于后續(xù)的研究。

圖2 假病毒感染宿主細(xì)胞體系的建立SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的[25]。用包裝好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒依次感染HEK293T、Calu3和Caco2這3種細(xì)胞系,將hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加入宿主細(xì)胞以阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染,vector和VSVG分別用作病毒感染進(jìn)細(xì)胞的陰性和陽性對照(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1)。Fig.2 Establishment of host cell system infected with pseudovirusSARS-CoV-2 pseudovirus was produced using VSV pseudovirus system[25].The HEK293T,Calu3 and Caco2 cell lines were infected with packaged VSVG and SARS-CoV-2 pseudovirus successively.The hACE2-Fc fusion protein was added into host cells at a concentration of 30 μg/mL to block the infection of SARS-CoV-2 pseudovirus.The vector and VSVG were used as negative and positive controls,respectively,for virus infection of cells(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1).

2.3 TMPRSS2重組蛋白能夠阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染

相關(guān)研究報道,非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat處理,可使SARS冠狀病毒對Calu3細(xì)胞的感染相比較未處理的對照組降低90%[24]。這在我們的實驗結(jié)果中也得到了證實:camostat抑制劑能夠顯著阻斷SARS-CoV-2假病毒感染細(xì)胞(圖3A)。圖3B顯示,我們純化的人的R255Q和S441A雙突變TMPRSS2重組蛋白(hTMPRS-S2-Fc)也能抑制SARS-CoV-2病毒的感染,但是其抑制效果并不像camostat抑制劑那樣顯著,其原因可能是:在病毒感染的過程中,S蛋白的激活除了依賴TMPRSS2蛋白酶,還有可能依賴其他的蛋白酶,例如組織蛋白酶B/L(已有文獻(xiàn)報道,組織蛋白酶B/L的抑制劑也能有效阻斷SARS-CoV-2病毒的感染)[16]。綜上所述,TMPRSS2在病毒感染過程中發(fā)揮了重要的作用,很有可能成為阻斷病毒感染的潛在靶點。

圖3 TMPRSS2重組蛋白阻斷假病毒的感染(A)TMPRSS2抑制劑阻斷SARS-CoV-2假病毒感染的效果。將TMPRSS2抑制劑camostat按照2 μmol/L、10 μmol/L和50μmol/L的梯度加到鋪有Calu3細(xì)胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)TMPRSS2重組蛋白阻斷SARS-CoV-2假病毒感染的效果。將TMPRSS2雙突變重組蛋白和hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加到鋪有Calu3細(xì)胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。**:P＜0.01,****:P＜0.000 1。Fig.3 Prevention of pseudovirus infection by TMPRSS2-Fc protein(A)The blocking effect of TMPRSS2 inhibitors on pseudovirus infection.Camostat,a TMPRSS2 inhibitor,was added into the 96-well plate of Calu3 cells at a gradient level(2 μmol/L,10 μmol/L and 50 μmol/L).After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)The blocking effect of TMPRSS2-Fc protein on pseudovirus infection.The double mutanted TMPRSS2 recombinant protein and hACE2-Fc fusion protein were added into the 96-well plate of Calu3 cells at a concentration of 30 μg/mL.After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.**:P＜0.01,****:P＜0.000 1.

2.4 野生型TMPRSS2定位在HeLa細(xì)胞表面

TMPRSS2是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,屬于TTSPs家族,表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上,其絲氨酸蛋白酶活性區(qū)域位于C端胞外段[3]。TMPRSS2作為一種膜蛋白,在病毒入侵宿主細(xì)胞時發(fā)揮酶活,切割并激活病毒的S蛋白。我們假設(shè)TMPRSS2作為一種膜蛋白,能夠成為宿主細(xì)胞表面阻斷病毒感染的靶點。因此,我們在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)野生型的TMPRSS2,并使用TMPRSS2的特異性一抗與HeLa細(xì)胞孵育,隨后用FITC綠色熒光二抗標(biāo)記TMPRSS2,最后在FV3000共聚焦顯微鏡下觀察TMPRSS2的細(xì)胞定位情況。我們發(fā)現(xiàn),野生型的TMPRSS2定位在細(xì)胞膜表面(圖4),證明TMPRSS2在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定表達(dá)確實能夠作為阻斷病毒入侵的潛在靶點,這為未來針對TMPRSS2的藥物研發(fā)提供了新的思路。

圖4 野生型TMPRSS2定位在HeLa細(xì)胞表面瞬時轉(zhuǎn)染PLVX-M2-FLAG到HeLa細(xì)胞,使用Abclonal-hTMPRSS2 Ab一抗及相應(yīng)的FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色,然后在FV3000共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。比例尺:5 μm。Fig.4 Wild-type TMPRSS2 localization on the surface of HeLa cellsPLVX-M2-FLAG was transiently transfected into HeLa cells.The primary antibody was Abclonal-hTMPRSS2 Ab,and the corresponding FITC-labeled secondary antibody was used for immunofluorescence staining.Then observation was performed under FV3000 confocal microscope.Scale bar:5 μm.

3 討論

本研究表明,TMPRSS2雙突變的重組蛋白能有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染Calu3細(xì)胞,這和非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat的功能基本一樣,二者都能夠有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染細(xì)胞。有報道稱,在TMPRSS2敲除的細(xì)胞中,SARS-CoV的S蛋白可以利用內(nèi)吞體半胱氨酸蛋白酶CatB/L啟動S蛋白[16]。然而,由TMPRSS2,而不是CatB/L,啟動的S蛋白是病毒通過受體進(jìn)入原代靶細(xì)胞感染宿主細(xì)胞的必要條件[1]。我們的研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2假病毒感染Calu3細(xì)胞能夠被TMPRSS2重組蛋白和camostat不同程度的抑制,但不能完全阻斷,這可能是因為除了TMPRSS2以外,CatB/L也可以激活SARSCoV-2的S蛋白,從而促進(jìn)SARS-CoV-2病毒的感染[16]?？偟膩碚f,根據(jù)已有的文獻(xiàn),TMPRSS2是一種宿主細(xì)胞因子,對包括甲型流感病毒和冠狀病毒在內(nèi)的幾種臨床相關(guān)病毒的傳播至關(guān)重要[29～30];相比之下,TMPRSS2對于宿主細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)并不是不可或缺的[31],因此,封閉或者干涉TMPRSS2的功能為抗新型冠狀病毒感染的研究提供了新的思路。雖然絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat可以阻斷TMPRSS2的活性,在日本也已被批準(zhǔn)用于人新型冠狀病毒感染治療的臨床試驗,但患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此,該化合物仍需進(jìn)行改構(gòu)以降低副作用,從而用于治療SARS-CoV-2感染患者[32]。相比較之下,TMPRSS2蛋白顯示出較好的阻斷效果。TMPRSS2重組蛋白的治療可能規(guī)避掉抑制劑化合物對人體造成的嚴(yán)重副作用。在未來,研究人員還可以篩選出TMPRSS2特異性的封閉抗體,從而阻斷病毒的感染?？傊?該研究為阻斷SARS-CoV-2感染的第一步——病毒進(jìn)入細(xì)胞提供了新的見解,并確定了TMPRSS2很有可能成為抗新型冠狀病毒干預(yù)的潛在靶點。