人誘導多能干細胞分化為心肌細胞關(guān)鍵基因的生物信息學分析

涂思梅,曲鑫建,2*

(1.大連理工大學生命科學與藥學學院,中國遼寧 盤錦 124221;2.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院，中國廣西 南寧 530200)

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通過體細胞重編程技術(shù)獲得的具有類似胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)自我更新和多向分化潛能的細胞[1～2]。人類iPSCs在細胞治療、疾病建模和藥物開發(fā)等領(lǐng)域已經(jīng)扮演了重要的角色。在當今社會,心血管疾病已經(jīng)嚴重地威脅人類的生命健康,而治療心血管疾病的關(guān)鍵工具和重要因素是獲得正常生理功能的心肌細胞。由iPSCs分化而來的心肌細胞,在產(chǎn)生符合治療和研究心血管疾病的細胞模型方面具有巨大的優(yōu)勢。因此,應(yīng)用該細胞進行心血管疾病的補償替代性治療或開發(fā)新型藥物具有良好應(yīng)用前景和重要意義。

相關(guān)研究在探索人類多能干細胞(human pluripotent stem cells,hPSCs,包括 iPSCs和 ESCs)向心肌細胞誘導分化的分子機制中發(fā)現(xiàn),Wnt信號、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(bone morphogenetic proteins,BMPs)和Activin/Nodal等在hPSCs誘導中胚層細胞的產(chǎn)生中具有重要作用,其中,BMP4和Activin A是體外誘導中胚層產(chǎn)生最常用的因子[3];BMP2和成纖維細胞生長因子8(fibroblast growth factor 8,FGF8)可能會協(xié)同促進中胚層細胞向心肌細胞分化[4]。另有研究發(fā)現(xiàn),趨化因子及其受體也可以在多能干細胞中發(fā)揮重要的作用,其參與多能干細胞的增殖、分化以及多能性維持[5～7]。但是,目前尚沒有對誘導iPSCs向心肌細胞分化的重要基因進行系統(tǒng)性篩選與分析的報道。

高通量測序技術(shù)的應(yīng)用,產(chǎn)生了大量的iPSCs向心肌細胞分化的基因表達芯片數(shù)據(jù)。在本研究中,我們從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載了iPSCs向心肌細胞分化的高通量測序數(shù)據(jù)集,首先,應(yīng)用R包分析細胞分化過程中的差異表達基因,并對其進行基因本體論(Gene Ontology,GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析;其次,構(gòu)建差異表達基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò);隨后,利用R包加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)對共表達的基因進行聚類,并將其劃分為不同的基因模塊;最后,通過Cytoscape對重要基因模塊進行可視化和富集分析,以期預(yù)測并篩選出iPSCs向心肌細胞分化過程中的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 基因表達數(shù)據(jù)的準備

從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選并下載iPSCs向心肌細胞分化的基因表達譜(GSE137920),獲得iPSCs向心肌細胞分化的4個階段的數(shù)據(jù)集,分別是未分化的iPSCs(D0)樣品3例、中胚層細胞(D2)樣品3例、早期心肌細胞(D7)樣品3例、心肌細胞(D14)樣品3例[8]。

1.2 基因差異表達分析

對基因表達譜GSE137920進行ensembl數(shù)據(jù)整理,把ensembl ID轉(zhuǎn)換為基因的名稱。把Bioconductor 3.12中的 limma 3.46.0、edgeR 3.32.0和pheatmap 1.0.12安裝在R 4.0.3中,以識別D0和D2或D7或D14樣品之間的差異表達基因,然后進行熱圖的繪制。差異表達基因獲取的標準:錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜0.05 和|log2(FC)|≥2(FC:fold change),FDR表示矯正后的P值,log2(FC)表示實驗組與對照組樣品表達量的比值。

1.3 差異表達基因的功能及信號通路分析

GO是從分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細胞組分(cellular component,CC)3個方面注釋基因及其產(chǎn)物的功能。利用GO分析可以找到富集差異基因的GO分類條目,從而找出不同樣品中差異基因的生物學功能。KEGG是一個集成了化學、基因組和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫,能夠把基因及表達信息作為一個整體的網(wǎng)絡(luò)進行研究,通常被用于細胞信號轉(zhuǎn)導通路的分析。本文首先在R中利用org.Hs.eg.db 3.12.0把基因的名稱轉(zhuǎn)換為基因ID,再利用clusterProfiler v3.0.4實現(xiàn) D0和 D2樣品、D0和D7樣品以及D0和D14樣品差異表達基因的GO功能和KEGG信號通路富集分析,最后利用enrichplot 1.10.1和ggplot 2 3.3.2把輸出結(jié)果進行可視化。

1.4 共同差異表達基因的獲取

利用在線工具Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制 D2、D7和D14三個樣品中差異表達基因的Venn圖,分析得到3個樣品中共同差異表達基因。

1.5 共同差異表達基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同差異表達的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)[9],獲得其所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建標準:相互作用分數(shù)(interaction score)≥0.9。利用Cytoscape 3.7.2中的cytoHubba插件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,篩選關(guān)鍵基因。

1.6 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

WGCNA[10]是根據(jù)基因表達模式的不同,挖掘出相似表達模式的基因,通常稱為模塊(module)。把每個模塊與其他模塊或外部樣本特征進行關(guān)聯(lián),可用來篩選模塊中的核心基因,而核心基因基本是位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的基因,是值得我們優(yōu)先深入研究和挖掘的對象。本文把iPSCs向心肌細胞分化的4個階段(D0、D2、D7和D14)的基因表達矩陣作為輸入數(shù)據(jù),在R中把基因表達量均值大于總體均值的基因作為高表達基因進行WGCNA分析,使用動態(tài)剪切樹的方法將基因聚類并劃分模塊,設(shè)定最小模塊大小的參數(shù)為30,將距離較近的模塊合并成新的模塊,選取剪切值(height)為0.25,將相似性大于0.75的模塊合并。最后,使用Cytoscape 3.7.2里的cytoHubba插件把重要基因模塊進行可視化,篩選出模塊中的核心基因。

1.7 共同差異表達基因和重要模塊的通路富集分析

在Cytoscape 3.7.2中安裝上Reactome FIPlugIn插件,分析共同差異表達基因和重要模塊中基因的相關(guān)通路,設(shè)定分析的標準為P≤0.01、FDR≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 iPSCs向心肌細胞分化中差異表達的基因

使用FDR＜0.05和|log2(FC)|≥2作為差異基因的篩選標準,獲取D0、D2、D7和D14樣品之間的差異表達基因。結(jié)果顯示:與D0樣品相比,D2樣品中鑒定出了2 723個差異表達基因(包括959個表達上調(diào)和1 764個表達下調(diào)的基因);D7樣品中鑒定出了5 155個差異表達基因(包括2 707個表達上調(diào)和2 448個表達下調(diào)的基因);D14樣品中鑒定出了6 777個差異表達基因(包括3 871個表達上調(diào)和2 906個表達下調(diào)的基因)。圖1給出了D2、D7和D14樣品中前20個表達上調(diào)或下調(diào)的差異基因的熱圖。

圖1 前20個表達上調(diào)或下調(diào)的差異基因的熱圖(A)D2樣品中的差異表達基因;(B)D7樣品中的差異表達基因;(C)D14樣品中的差異表達基因。橫坐標為樣品,D0樣品為未分化的iPSCs(綠框),D2、D7和D14樣品分別為中胚層細胞、早期心肌細胞和心肌細胞(紅框)。縱坐標表示基因,藍色表示下調(diào)基因,紅色表示上調(diào)基因。Fig.1 Heatmap of top 20 differential genes with up-or down-regulated expression(A)Differentially expressed genes in D2 samples;(B)Differentially expressed genes in D7 samples;(C)Differentially expressed genes in D14 samples.The sample names are listed on the abscissa.D0 samples are undifferentiated iPSCs(green box),D2,D7 and D14 samples are mesoderm cells,early cardiomyocytes and cardiomyocytes(red box),respectively.The genes are shown on the ordinate.Blue represents down-regulated genes,and red represents up-regulated genes.

2.2 差異表達基因的GO功能分析

GO分析結(jié)果顯示,D2樣品中的差異表達基因有 999個 GO_BP項、58個 GO_CC項、94個GO_MF項(P＜0.05),其中前10項主要包括胚胎器官發(fā)育(GO_BP)、含膠原的細胞外基質(zhì)(GO_CC)和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合(GO_MF)等(圖2A);D7樣品中的差異表達基因有1 677個GO_BP項、106個GO_CC項、144個GO_MF項(P＜0.05),其中前10項包括心臟形態(tài)發(fā)生(GO_BP)、跨膜轉(zhuǎn)運復(fù)合體(GO_CC)和受體配體活性(GO_MF)等(圖2B);D14樣品中的差異表達基因有1 886個GO_BP項、123個GO_CC項、173個GO_MF項(P＜0.05),其中前10項包括心肌組織發(fā)育(GO_BP)、離子通道復(fù)合物(GO_CC)和信號受體激活劑的活性(GO_MF)等(圖 2C)。

圖2 差異表達基因的前10個GO功能分析(A)D2樣品中差異表達基因的GO功能分析;(B)D7樣品中差異表達基因的GO功能分析;(C)D14樣品中差異表達基因的GO功能分析。圓的大小表示GO功能富集的基因數(shù)量,與圓的大小正相關(guān)。同樣,GO功能中基因富集的顯著性與圓的顏色深度正相關(guān)。Qvalue表示用FDR方法校正后的P值。Fig.2 Analysis of top 10 GO functions of differentially expressed genes(A)GO function analysis of differentially expressed genes in D2 samples;(B)GO function analysis of differentially expressed genes in D7 samples;(C)GO function analysis of differentially expressed genes in D14 samples.The circle size represents the number of genes enriched in GO function,which is positively related to the circle size.Similarly,the significance of gene enrichment in GO function is positively related to the color depth of the circle.Qvalue represents the P-value corrected by the FDR method.

2.3 差異表達基因的KEGG信號通路分析

基于KEGG信號通路的分析,D2樣品中的差異表達基因在20條信號通路富集(P＜0.05),包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、趨化因子信號通路和TGF-β信號通路等。在圖3A顯示的前20條信號通路中,神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號通路富集最為顯著,有68個差異表達基因富集到此信號通路。D7樣品中的差異表達基因在57條信號通路富集(P＜0.05),包括PI3K-Akt信號通路、cGMP-PKG信號通路、心肌細胞中的腎上腺素信號轉(zhuǎn)導、心肌收縮和cAMP信號通路等。在圖3B顯示的前20條信號通路中,神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號通路同樣富集得最為顯著,有113個差異表達基因富集到此信號通路。在D14樣品中,差異表達基因在77條信號通路富集(P＜0.05),包括Ras信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、肥厚型心肌病、MAPK信號通路和擴張型心肌病等。圖3C顯示了其中的前20條信號通路,還是以神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號通路富集最為顯著,有138個差異表達基因富集到此信號通路。

圖3 差異表達基因的前20條KEGG信號通路分析(A)D2樣品中差異表達基因的KEGG信號通路分析;(B)D7樣品中差異表達基因的KEGG信號通路分析;(C)D14樣品中差異表達基因的KEGG信號通路分析?？v軸表示信號通路,橫軸表示信號通路中富集的基因數(shù)量,顏色表示富集的顯著性,Qvalue表示用FDR方法校正后的P值。Fig.3 Analysis of top 20 KEGG signaling pathways of differentially expressed genes(A)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D2 samples;(B)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D7 samples;(C)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D14 samples.The signaling pathways are listed on the vertical axis,and the numbers of genes enriched in the signaling pathway are on the horizontal axis.The color represents the significance of enrichment.Qvalue represents the P-value corrected by the FDR method.

2.4 共同差異表達基因的分析

通過Venn圖分析,從3個樣品中總共得到917個共同的差異表達基因,包括331個上調(diào)差異表達基因(圖4A)和586個下調(diào)差異表達基因(圖4B)。3個樣品中的差異表達基因都是與D0樣品比較得到的。

圖4 Venn圖分析得到共同差異表達的基因(A)3個樣品中上調(diào)差異表達基因的Venn圖分析;(B)3個樣品中下調(diào)差異表達基因的Venn圖分析。Fig.4 Common differentially expressed genes obtained by Venn diagram analysis(A)Venn diagram analysis of up-regulated differentially expressed genes in three samples;(B)Venn diagram analysis of downregulated differentially expressed genes in three samples.

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫對3個樣品中共同差異表達的基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5A),然后通過Cytoscape 3.7.2中的cytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10個基因(圖5B),分別為FPR2、ADCY2、CXCR2、CXCR4、PF4、GALR1、GAL、CXCL5、CXCL6和HCAR3。

圖5 共同差異表達基因的PPI分析(A)共同差異表達基因的PPI網(wǎng)絡(luò),紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào);(B)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的前10個基因,其中圓形代表下調(diào)基因,菱形代表上調(diào)基因,紅色、橙色、橘黃色和黃色代表基因連接程度依次遞減。Fig.5 PPI analysis of common differentially expressed genes(A)PPI network of common differentially expressed genes.Red represents up-regulation and green represents down-regulation;(B)The top 10 genes screened out in the PPI network.Circles represent down-regulated genes,and diamonds represent up-regulated genes.The colors red,orange,jacinth and yellow represent the decreasing connectivity of genes.

2.6 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

把所有樣品中表達量較低的基因過濾后,選取9 006個基因進行WGCNA分析,將相似性大于0.75的模塊合并后最終得到了9個基因模塊(圖6)。不同的顏色代表不同的模塊,樹圖中每個葉節(jié)點代表一個基因,其中密集連接的分支代表接近的基因。表1列出了不同顏色模塊所包含的基因數(shù)量。其中,綠色基因模塊(Green)聚類最顯著,包含的基因數(shù)目為2 175個;暗綠色基因模塊(Darkturquoise)包含的基因數(shù)目最少,為133個。

圖6 高表達基因的聚類樹和模塊劃分Height為剪切值;Cluster dendrogram為聚類樹;Dynamic tree cut為最初得到的模塊;Merged dynamic為合并后最終得到的模塊。Fig.6 Cluster dendrogram and module division of high expression genesHeight is the cut value;Cluster dendrogram is the cluster tree;Dynamic tree cut is the initial module;Merged dynamic is the final module after the merger.

表1 不同模塊中包含的基因數(shù)量Table 1 The number of genes contained in different modules

通過WGCNA分析,我們可得到每個模塊中直接相互作用的基因。文中選取聚類最顯著的綠色基因模塊(Green)進行Cytoscape的可視化分析,篩選模塊中相互作用的基因(weight＞0.695),結(jié)果顯示:綠色基因模塊(Green)中篩選到399組相互作用的基因。進一步利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件對模塊中相互作用最多的前50個基因進行可視化,結(jié)果顯示:在綠色基因模塊(Green)中,與其他基因相互作用最多的基因是BMP5(圖7)。與其他基因相互作用越多,表明該基因在模塊中越接近核心地位。

圖7 綠色基因模塊中基因的相互作用關(guān)系紅色表示與其他基因相互作用最多的基因。Fig.7 Interaction between genes in green gene moduleRed indicates the gene that interacts most with other genes.

2.7 共同差異表達基因和重要模塊的通路富集

應(yīng)用Cytoscape軟件中的Reactome FIPlugIn插件對共同差異表達基因和綠色模塊(Green)基因進行通路分析,結(jié)果顯示:綠色模塊(Green)的基因富集的通路總共有48條,其中5條為翻譯后蛋白質(zhì)修飾、膜轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)代謝、天冬酰胺N-連接糖基化和細胞對壓力的反應(yīng)(表2);共同差異表達基因的富集通路總共有10條,其中5條為GPCR配體結(jié)合、肽配體結(jié)合受體、RUNX2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多能干細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及趨化因子受體結(jié)合趨化因子(表 2)。

表2 綠色基因模塊和共同差異表達基因的通路富集Table 2 Pathway enrichment of green gene module and common differentially expressed genes

3 討論

目前,為探索心血管疾病的細胞治療途徑,獲得一種與人體生理狀態(tài)相接近的心肌細胞模型極其重要。與已建立的人源心肌細胞模型相比,從iPSCs中誘導分化的心肌細胞具有很大優(yōu)勢和前景[11～12]。因此,探究人iPSCs向心肌細胞分化的作用機制以及篩選關(guān)鍵調(diào)控基因非常有必要。

本研究在D2、D7和D14三個樣品中篩選出的共同差異表達基因有917個,其中包括331個上調(diào)基因和586個下調(diào)基因(圖4)。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中共同差異表達基因的連接程度,我們篩選得到10個關(guān)鍵基因:FPR2、ADCY2、CXCR2、CXCR4、PF4、GALR1、GAL、CXCL5、CXCL6 和 HCAR3(圖 5)。其中,FPR2、CXCR2、CXCR4 和 PF4 可能在 iPSCs向心肌細胞分化的過程中發(fā)揮重要作用[13～20]。

甲?；氖荏w(formyl peptide receptor,FPR)在人體中包括3個成員,分別為FPR1、FPR2和FPR3,它們是G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體家族的成員[13]。研究證實,FPR2和FPR1通過F-肌動蛋白聚合促進神經(jīng)干細胞遷移并且向神經(jīng)元分化[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),FPR2和FPR1在活性氧和PI3K-AKT信號通路的介導下,誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化[14]。FPR在骨髓間充質(zhì)干細胞中表達,而FPR1與N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)相互作用,會誘導人的骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[15]。在本研究中,GO和KEGG富集分析顯示,FPR2主要富集在第二信使介導的信號、調(diào)節(jié)細胞因子對生長因子刺激的反應(yīng)、調(diào)控細胞趨化作用以及調(diào)控ERK1和ERK2級聯(lián)反應(yīng)等,體現(xiàn)了FPR2可能在iPSCs向心肌細胞分化過程中發(fā)揮作用。CXC趨化因子受體2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)是一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn),在hPSCs中抑制CXCR2表達,會抑制細胞向外胚層分化,導致細胞向中胚層和內(nèi)胚層分化,隨后hPSCs的特性逐漸消失,這表明CXCR2在維持hPSCs的多能性和增殖分化中扮演重要的角色[7,16]。此外,CXCR2及其下游信號在間充質(zhì)干細胞誘導內(nèi)皮祖細胞遷移、血管形成等運動中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[17]。本研究的GO和KEGG富集分析顯示,CXCR2主要富集在心肌細胞凋亡、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、血管生成調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等,表明CXCR2可能在iPSCs向心肌細胞分化中發(fā)揮作用。CXCR4也是一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細胞利用SDF-1/CXCR4信號轉(zhuǎn)導可以誘導c-kit+心臟干細胞的分化以及增殖,該信號通路也可以控制神經(jīng)干細胞以維持它的干細胞特性,而且被激活的CXCR4能促進人ESCs向神經(jīng)干細胞分化[18]。在小鼠的iPSCs中增強CXCR4的表達可以提高細胞遷移,并且不改變細胞的干細胞特性[19]。本研究的GO和KEGG富集分析顯示,CXCR4主要富集在心臟過程、心臟收縮和調(diào)節(jié)生長發(fā)育等,說明CXCR4可能促進iPSCs向心肌細胞分化。血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是CXC趨化因子家族的成員,是iPSCs分化為心肌細胞的一種生物標志物。研究報道,PF4可以促進iPSCs向心臟分化,這可能與其調(diào)節(jié)FGF信號有關(guān)[20]。在本研究中,GO和KEGG富集分析顯示,PF4主要在血管發(fā)育調(diào)節(jié)、cAMP介導信號、造血正向調(diào)節(jié)和趨化因子的信號通路等富集,提示PF4可能參與iPSCs心肌細胞分化過程。綜合以上分析可知,FPR2、CXCR2和CXCR4都是趨化因子的受體,PF4是趨化因子的成員,它們都與細胞的趨化作用有著密切的關(guān)系,而且趨化因子的受體幾乎都是G蛋白偶聯(lián)受體,它們都在G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合的通路中富集。已有研究證明,趨化因子及其受體可以在多能干細胞的增殖、分化以及多能性維持中發(fā)揮重要作用[5～7]。例如:CXCL8(趨化因子)-CXCR2信號通路可以使hPSCs的分化能力提高;CXCL12(趨化因子)-CXCR4信號通路不僅參與hPSCs的遷移活動,還能夠增強細胞多能性[21]。因此,我們推測趨化因子及其受體在iPSCs向心肌細胞分化的過程中具有重要作用。

通過對WGCNA的結(jié)果進行分析我們發(fā)現(xiàn),最顯著的基因模塊為綠色基因模塊(Green)(圖6),在該基因模塊中,BMP5與其他基因相互作用的程度最高(圖7)。BMP5是BMPs家族的成員,而BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族中的成員,它可以從細胞內(nèi)分泌到細胞間隙或者血漿中,從而和靶細胞相應(yīng)的抗體結(jié)合,發(fā)揮生物學作用[22]。BMPs及其受體被認為是胚胎發(fā)育和器官形成中的重要調(diào)節(jié)因子,對心血管結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)也具有重要作用[23]。其中,BMP4與FGF2協(xié)同作用誘導人ESCs向中胚層細胞分化[24],BMP2與FGF8相互作用可能會誘導中胚層向心肌細胞分化[4]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),BMP5參與許多生命活動,如細胞的增殖和凋亡、軟骨發(fā)育、人類干細胞的分化誘導、人體胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和預(yù)后[25]。BMP5/7不但可以在體外明顯地促進人iPSCs的分化能力,而且可以使神經(jīng)干細胞分化為中腦多巴胺神經(jīng)元的能力提高3倍[26]。另外,BMP5還可以調(diào)控心肌細胞分化相關(guān)基因的表達[27]。本研究發(fā)現(xiàn),BMP5在iPSCs分化為中胚層細胞、早期心肌細胞和心肌細胞的3個階段都差異表達,而且BMP5主要富集于心肌組織發(fā)育、胚胎器官發(fā)育、上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程以及TGF-β信號通路。因此,我們推測BMP5具有促進iPSCs向心肌細胞分化的功能。

文獻研究顯示,在本文預(yù)測的關(guān)鍵基因中,BMP5和CXCR4已經(jīng)被證明在干細胞向心肌細胞分化中起重要作用。譚金童[28]成功地利用BMP5重組腺病毒誘導間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),SDF-1(又稱CXCL12)/CXCR4信號通路調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[29]。VEGF可以促進iPSCs向心肌細胞分化[30],bFGF能促進ESCs來源心肌細胞的早期成熟[31]。另有研究證實,CXCL12-CXCR4信號通路還參與多種心血管的發(fā)育過程[32]。此外,有研究報道,SDF-1/CXCR4信號通路在BMP(BMP2或BMP9)介導的成骨分化中發(fā)揮重要的作用[33～35],說明趨化因子及其受體介導的信號通路與BMP可以相互作用,但它們是否在心肌細胞分化過程中發(fā)揮作用目前尚不清楚。

本文通過生物信息學分析,雖然篩選得到了參與人iPSCs向心肌細胞分化的幾個關(guān)鍵基因,但在該過程中起作用的基因不止于此。在被篩選出來的基因中,FPR2、CXCR2和PF4在iPSCs向心肌細胞分化的過程中可能會發(fā)揮重要作用,其中BMP5和CXCR4介導iPSCs向心肌細胞分化的可能性最大,雖然它們已經(jīng)被證明參與干細胞向心肌細胞分化,但仍需要用實驗來進一步證明它們是否參與iPSCs向心肌細胞分化的過程。