荊防顆粒對異丙腎上腺素誘導大鼠急性心肌梗死的保護作用研究

董利洋，程國良，姚景春，曹天佑，李小鵬，屈會化，孔 慧*，趙 琰*，張貴民

荊防顆粒對異丙腎上腺素誘導大鼠急性心肌梗死的保護作用研究

董利洋1，程國良1，姚景春2，曹天佑3，李小鵬1，屈會化4，孔 慧1*，趙 琰1*，張貴民2

1. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029 2. 魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276000 3. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029 4. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，北京 100029

探究荊防顆粒對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導大鼠急性心肌梗死的保護作用。SD大鼠隨機分為對照組、模型組、普萘洛爾（10 mg/kg）組和荊防顆粒高、低劑量（32、16 g/kg）組，每組8只。各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)14 d；第13天給藥2 h后，除對照組外，其余組大鼠皮下多點注射ISO（85 mg/kg），對照組sc等體積的生理鹽水，連續(xù)2 d。心電圖觀察大鼠ST段的變化；超聲心動檢查大鼠左心室射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）；取心臟，計算心臟指數(shù)（heart weight index，HWI）；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理變化；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorinated，TTC）法檢測心肌梗死面積；采用全自動生化分析儀檢測血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）活性及總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平；采用試劑盒檢測大鼠心肌組織中超氧化歧物酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原性谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用TUNEL染色法觀察大鼠心肌細胞凋亡情況；采用Western blotting檢測心肌組織中核因子紅細胞2相關(guān)因子2（nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達。與對照組比較，模型組大鼠心電圖II導聯(lián)ST段弓背向上抬高（＜0.01），提示急性心肌梗死模型構(gòu)建成功；EF和FS顯著降低（＜0.01）；血清中LDH、AST、CK-MB活性及TC、TG、LDL-C水平顯著升高（＜0.01）；心肌組織中SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性和GSH水平顯著降低（＜0.01），MDA和ROS水平顯著升高（＜0.01）；心肌組織出現(xiàn)顯著的病理性改變，心肌梗死面積增加（＜0.01），心肌細胞凋亡數(shù)量顯著增加（＜0.01）；心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，荊防顆粒組大鼠EF和FS顯著升高（＜0.05、0.01）；血清中LDH、AST、CK-MB活性及TC、TG、LDL-C水平顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織中SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性和GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01），MDA和ROS水平顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織病理性改變得到顯著改善，心肌梗死面積和細胞凋亡數(shù)量顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。荊防顆粒通過抑制心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷從而發(fā)揮心臟保護作用。

荊防顆粒；異丙腎上腺素；急性心肌梗死；氧化應(yīng)激；細胞凋亡；核因子紅細胞2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），為心肌組織血液供求失衡而導致的心肌缺血性損傷，由于冠狀動脈閉塞而導致局部心肌發(fā)生壞死，大量心肌細胞凋亡[1-2]。AMI發(fā)生時，患者會發(fā)生劇烈的胸骨后疼痛，心肌酶異常升高，嚴重者常發(fā)生心力衰竭而危及生命[3-4]。異丙腎上腺素是一種β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor，β-AR）激動劑，大劑量注射異丙腎上腺素可引起心肌過度收縮，心率加快，冠脈痙攣而導致心肌持續(xù)缺血缺氧，繼而發(fā)生AMI[5-7]。

AMI可歸屬于中醫(yī)學的“胸痹”“真心痛”范疇，中醫(yī)認為“胸痹”的病因多為“胸陽不振，氣滯血瘀”，治療多以“溫經(jīng)通陽，行氣活血”為大法[8-9]。荊防顆粒是由古方荊防敗毒散采用現(xiàn)代工藝制備而成的中成藥，方中荊芥、防風可宣氣機于外，柴胡、川芎可暢氣機于內(nèi)；枳殼、桔梗升降相因；茯苓、川芎血水同治；甘草、茯苓可扶益正氣，諸藥相伍可疏通氣血，改善心臟供血功能，調(diào)整心臟缺氧狀態(tài)。荊防顆粒對AMI的影響尚未見報道，本研究通過sc異丙腎上腺素建立大鼠AMI模型，觀察荊防顆粒對AMI的保護作用，以期為臨床上荊防顆粒防治AMI提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，9周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號SYXK（京）2020-0033。實驗期間動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃，濕度55%～65%，12 h光暗循環(huán)，自由進食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2022040802-2009）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號80022202002）由魯南制藥集團股份有限公司提供；鹽酸異丙腎上腺素（批號901E021）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；鹽酸普萘洛爾（批號C12151281）購自北京正程生物科技有限公司；大鼠Na+, K+-ATP酶ELISA試劑盒（批號22061600）、Ca2+, Mg2+-ATP酶ELISA試劑盒（批號22061696）購自賽譜銳思（北京）科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20220607）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20220606）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號20220629）、還原性谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH）試劑盒（批號20220701）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒（批號20220606）購自南京建成生物工程研究所；二甲苯（批號10023418）購自國藥集團化學有限公司；TUNEL試劑盒（批號11684817910）購自Roche公司；抗熒光淬滅封片劑（批號B0007）；兔源核因子紅細胞2相關(guān)因子2（nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2，Nrf2）抗體（批號ab137536）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號ab13238）、β-actin抗體（批號ab8206）；羊抗兔二抗（批號150016）購自英國Abcam公司；生理鹽水（批號2202252008）購自石家莊四藥有限公司。

1.3 儀器

FX-7200型全自動三通道六導聯(lián)心電圖機（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）；Vevo 2100型小動物超聲儀（Visuai Souics公司）；AU480型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；HC-2518R型離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；DY-2000型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；mμlISKANMK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；H-4000型免疫組化筆（上海鑫樂生物科技有限公司）；DS-U3型正置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、普萘洛爾（10 mg/kg）組和荊防顆粒低、高劑量（16、32 g/kg）組，每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。第13天給藥2 h后，模型組和各給藥組大鼠sc鹽酸異丙腎上腺素（85 mg/kg），對照組sc等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)2 d，以心電圖ST段顯著弓背抬高代表造模成功[10]。

2.2 心臟超聲檢測

大鼠ip 10%水合氯醛麻醉后備皮固定，通過配備10 MHz線性陣列超聲換能器的Visual Sonics Vevo 2100超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)對大鼠進行超聲心動圖檢查。分別測量左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic internal diameter，LVESD）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic internal diameter，LVEDD），計算左心室射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。

2.3 心臟指數(shù)分析

實驗結(jié)束后，麻醉大鼠，取血并分離血清；迅速取出心臟，用冰冷的生理鹽水洗去殘留血液，剪去大血管及結(jié)締組織，用濾紙吸干后稱定質(zhì)量，于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，計算心臟指數(shù)。

心臟指數(shù)＝心臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 心肌組織病理學觀察

各組大鼠心臟于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠心臟組織的病理變化。

2.5 心肌梗死率測定

取各組大鼠心臟，垂直于心臟長軸方向?qū)⒆笮氖覚M斷切成5片，置入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorinated，TTC）溶液中，37 ℃避光孵育15 min?；野咨珵楣Ｋ绤^(qū)（infarcted areas，IS），紅色為非梗死區(qū)（non-infarcted areas，NIS），計算心肌梗死率。

心肌梗死率＝梗死區(qū)域面積/左心室面積

2.6 血清心肌酶活性和血脂水平的檢測

各組大鼠麻醉后，腹主動脈取血，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）活性及總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。

2.7 心肌組織中氧化應(yīng)激指標和Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的檢測

取各組大鼠心肌組織，勻漿后取上清液，按照試劑盒說明書測定SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性及MDA、GSH、ROS水平。

2.8 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡

取各組大鼠心肌組織，于4%多聚甲醛中固定，雙蒸水沖洗，石蠟包埋，制備厚度為2～3 μm的切片，滴加TUNEL反應(yīng)液孵育60 min，滴加DAPI覆蓋細胞以復染核，滴加抗熒光淬滅劑封片，于顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞，并計算凋亡率。

凋亡率＝TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)

2.9 Western blotting檢測心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達

取各組大鼠心肌組織，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入二抗，于37 ℃孵育120 min，TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光試劑顯色，使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

2.10 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒對AMI大鼠心電圖參數(shù)的影響

在麻醉狀態(tài)下對大鼠進行心電圖檢測，如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠ST段顯著升高（＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，各給藥組大鼠ST段均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒對AMI大鼠的心臟具有保護作用。

3.2 荊防顆粒對AMI大鼠心臟功能的影響

超聲心動是檢測大鼠心臟功能的重要指標。如圖2和表1所示，與對照組比較，模型組大鼠的EF和FS顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠EF和FS均顯著升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 荊防顆粒對AMI大鼠心臟功能的影響

表1 荊防顆粒對AMI大鼠心臟功能的影響(, n = 8)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.3 荊防顆粒對AMI大鼠心臟形態(tài)及心臟指數(shù)的影響

如圖3所示，對照組大鼠心臟外觀表面光滑，色澤紅潤；模型組大鼠顏色灰白，心尖區(qū)可見明顯的缺血灶；各給藥組大鼠心臟外觀紅潤光滑，表明荊防顆?？娠@著改善心肌缺血。與對照組比較，模型組大鼠心臟指數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心臟指數(shù)顯著降低（＜0.01）。

3.4 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖4所示，對照組大鼠心肌細胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密，未見炎性細胞浸潤和充血水腫；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，間質(zhì)水腫，可見大量炎性細胞浸潤和不同程度的心肌細胞壞死，且有明顯的膠原纖維和結(jié)締組織增生；普萘洛爾組大鼠心肌細胞排列較為有序，可看到較多的炎性細胞浸潤，間質(zhì)水腫變形；荊防顆粒高、低劑量組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，部分心肌細胞增大，有少量的炎性細胞浸潤，心肌纖維化較模型組明顯改善。表明荊防顆?？捎行Ц纳汽}酸異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌組織病理變化。

圖3 荊防顆粒對AMI大鼠心臟形態(tài)(A) 及心臟指數(shù)(B) 的影響(, n = 8)

圖4 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織病理變化的影響 (HE,×200)

3.5 荊防顆粒對AMI大鼠心肌梗死面積的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌梗死率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌梗死率均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖5 荊防顆粒對AMI大鼠心肌梗死率的影響(, n = 5)

3.6 荊防顆粒對AMI大鼠血清中LDH、AST、CK-MB活性及LDL、HDL、TC、TG水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒能在一定程度上減輕心肌損傷程度。

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中LDL-C、TC和TG水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01），表明造模后機體出現(xiàn)血脂異常狀態(tài)；與模型組比較，各給藥組血清中LDL-C、TC和TG水平均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平顯著升高（＜0.01）。表明荊防顆粒能有效減輕AMI大鼠血清中血脂異常狀態(tài)。

3.7 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平的影響

氧化應(yīng)激是AMI發(fā)病的重要機制之一，通過測定各組大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平來反映機體的氧化應(yīng)激程度。如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD、CAT活性及GSH水平顯著降低（＜0.01），表明機體過氧化程度加重。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD、CAT活性及GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠降低AMI大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激水平，提高機體抗氧化能力的水平。

3.8 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影響

Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶是維持細胞內(nèi)Ca2+濃度的重要酶，其含量的高低可間接反映心肌細胞的損傷程度。如表5所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均顯著升高（＜0.01）。表明荊防顆?？捎行Щ謴虯MI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性，減輕心肌損傷。

表2 荊防顆粒對AMI大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性的影響(, n = 8)

表3 荊防顆粒對AMI大鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC和TG水平的影響(, n = 8)

表4 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平的影響(, n = 8)

表5 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影響(, n = 8)

3.9 荊防顆粒對AMI大鼠心肌細胞凋亡的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（＜0.01），提示機體造模后細胞凋亡程度增加；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細胞凋亡率均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒能夠有效減輕AMI大鼠心肌細胞凋亡。

3.10 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。表明荊防顆粒可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路來減輕機體氧化應(yīng)激和細胞凋亡水平，減輕心肌缺血損傷。

圖6 荊防顆粒對AMI大鼠心肌細胞凋亡的影響(, n = 5)

圖7 荊防顆粒對AMI大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

AMI是臨床常見的一種急性缺血性心臟病，其發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅著人類的生命健康[11]。目前AMI的主要治療手段是血管成形術(shù)和溶栓治療后對缺血區(qū)域進行再灌注，然而血運重建法對心肌細胞可造成進一步的損傷，嚴重者可誘發(fā)心力衰竭，這需要尋找新的預防和治療AMI的藥物。異丙腎上腺素是一種合成的兒茶酚胺[12]，其誘發(fā)的AMI模型與臨床患者發(fā)病相似，且具有簡單方便、動物死亡率低、模型穩(wěn)定等優(yōu)點，因此異丙腎上腺素誘導的AMI可作為用于心臟保護藥物的開發(fā)和研究的標準化模型[13]。

AMI可歸類為中醫(yī)“胸痹”范疇，治療以“溫經(jīng)散寒，理氣活血”為主。荊防敗毒散[14]首載于明代張時徹《攝生眾妙方》，方中荊、防與二活開表透外；前、柴二胡樞利出入氣機；枳殼、桔梗提壺揭蓋，升降上下之氣機；茯苓、甘草補脾利水以安五臟，諸藥合用可以促進氣機流轉(zhuǎn)，開上導下，升清降濁，推動臟腑的新陳代謝，可有效緩解人體氣血瘀滯狀態(tài)，對心臟發(fā)揮保護作用。現(xiàn)代藥理學研究也證實了荊防敗毒散具有很好的活血化瘀、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，已廣泛應(yīng)用于治療外感內(nèi)傷各科疾病[15]。

在心臟疾病中，心電圖是臨床最常用的檢測手段，當AMI發(fā)生時，會出現(xiàn)心電圖ST段的特異性改變，故ST段的變化幅度可基本反映心肌梗死的嚴重程度。超聲心動也是檢測心臟功能的重要手段，超聲心動中的EF和FS常作為心臟功能檢測的重要指標，當心肌發(fā)生缺血損傷時，EF和FS會低于正常值。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心電圖ST段顯著抬高（＞0.2 mV），EF和FS顯著降低；荊防顆粒可顯著降低心電圖ST段的抬高，并明顯升高了EF、FS值，表明荊防顆粒具有正向肌力作用，可減少異丙腎上腺素對心肌的損傷。

當心肌發(fā)生缺血梗死時，心肌細胞膜遭到破壞而使心肌酶釋放到血液中，其中CK-MB、LDH和AST活性可以反映缺血損傷的程度。此外，血脂異常是心肌梗死發(fā)病最常見的危險因素，脂質(zhì)代謝異常導致脂質(zhì)在動脈內(nèi)膜的沉積，進而促進心肌梗死的發(fā)生[16-17]。能量供應(yīng)不足是心肌細胞損傷的重要因素，心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度升高可使心肌收縮力和需氧量增加，心肌的過度收縮可導致ATP降解，最終導致心肌細胞損傷[18]。心肌細胞膜上的鈉鉀泵和鈣鎂泵在維持細胞內(nèi)Ca2+濃度方面具有重要作用[19]，其活性降低可引起細胞內(nèi)的Ca2+超載，進而引起心肌細胞的凋亡，異丙腎上腺素可通過激活腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（adenylate cyclase-adenosine cyclophosphate-protein kinase A，AC-cAMP-PKA）信號轉(zhuǎn)導通路而介導鈣通道的磷酸化，進而使Ca2+內(nèi)流增加導致鈣超載。本研究發(fā)現(xiàn)荊防顆?？梢越档脱逯行募酥久福–K-MB、LDH、AST）活性和TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，并且增加Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性來發(fā)揮心臟保護作用。

氧化應(yīng)激在AMI發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，大劑量重復使用異丙腎上腺素會誘導自由基介導的脂質(zhì)過氧化，從而通過缺氧、鈣超載和心肌細胞膜丟失來增強心肌細胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。心肌細胞在病理過程中會產(chǎn)生大量的ROS，對細胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷，并最終導致能量代謝發(fā)生變化，繼而引起細胞壞死和凋亡[22]。MDA是ROS的一種穩(wěn)定代謝物，是作為多不飽和脂肪酸過氧化而產(chǎn)生的一種氧化應(yīng)激標志物，急性缺血損傷引起的低氧水平和氧化應(yīng)激可導致MDA在心肌中積累[23]。SOD、MDA、GSH和CAT等自由基清除酶是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，SOD通常存在于質(zhì)膜中，其活性降低是氧化應(yīng)激的顯著標志。GSH通過減少過氧化氫和脂質(zhì)過氧化來保護細胞膜免受氧化損傷。CAT是一種四聚體血紅蛋白，可作為去除過氧化氫的催化劑。本研究結(jié)果顯示，荊防顆粒顯著增加心肌組織中SOD、CAT活性及GSH水平，降低ROS和MDA水平，說明荊防顆粒可以提高體內(nèi)抗氧化酶活性，對抗自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護缺血心肌細胞[24-25]。

細胞凋亡是異丙腎上腺素誘導AMI的主要病理機制，可導致缺血區(qū)和缺血邊界的心肌細胞死亡，進而發(fā)展為AMI，并最終引發(fā)心力衰竭[26]。細胞凋亡是由多基因控制，通過信號傳導通路介導的復雜過程。多項研究表明，Nrf2/HO-1是維持心肌細胞氧化還原穩(wěn)定的重要信號通路。Nrf2是一種與氧化還原相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對氧化損傷有保護作用。在生理狀態(tài)下，Nrf2與其抑制劑Keap1作為異二聚體結(jié)合在細胞質(zhì)中，在缺血缺氧條件下，Nrf2與Keap1分離后進入細胞核，與細胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidant response element，ARE）結(jié)合，進而上調(diào)HO-1及相關(guān)抗氧化基因的表達，從而抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，荊防顆?？娠@著降低AMI大鼠心肌細胞凋亡，上調(diào)心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平，表明荊防顆?？梢约せ頝rf2/HO-1通路，從而抑制細胞凋亡，減輕心肌缺血損傷。

綜上所述，荊防顆粒能夠通過減少心肌梗死面積、降低心肌酶活性、增加自由基清除酶活性、抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮對急性缺血心肌損傷的預防性保護作用，其作用機制可能為通過激活Nrf2/HO-1信號通路來調(diào)控氧化應(yīng)激和細胞凋亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Davidson S M, Ferdinandy P, Andreadou I,. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/ reperfusion injury: JACC review topic of the week [J]., 2019, 73(1): 89-99.

[2] Emile S H, Khan S M, Barsoum S H. Predictors of bowel necrosis in patients with acute mesenteric ischemia: Systematic review and Meta-analysis [J]., 2021, 73(1): 47-57.

[3] Kartschmit N, Birnbach B, Hartwig S,. Knowledge of symptoms of acute myocardial infarction, reaction to the symptoms, and ability to perform cardiopulmonary resuscitation: Results from a cross-sectional survey in four regions in Germany [J]., 2022, 9: 897263.

[4] Yoon C W, Oh H, Lee J,. Comparisons of prehospital delay and related factors between acute ischemic stroke and acute myocardial infarction [J]., 2022, 11(9): e023214.

[5] Sun L L, Jia H M, Yu M,.and, two eminent herbs in Xin-Ke-Shu, ameliorate myocardial ischemia partially by modulating the accumulation of free fatty acids in rats [J]., 2021, 89: 153620.

[6] Wei N, Chi M, Deng L,. Antioxidation role of different lateral stellate ganglion block in isoproterenol-induced acute myocardial ischemia in rats [J]., 2017, 42(5): 588-599.

[7] Emran T, Chowdhury N I, Sarker M,.-carnitine protects cardiac damage by reducing oxidative stress and inflammatory response via inhibition of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1beta against isoproterenol-induced myocardial infarction [J]., 2021, 143: 112139.

[8] 孫銘鴻, 張艷, 肖陽, 等. 冠心病不同類型與中醫(yī)病機辨證的關(guān)系 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2017, 15(4): 507-508.

[9] 謝連娣, 劉洋, 周琨, 等. 心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)病機淺識 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(9): 3139-3141.

[10] Zhang T P, Dang M Y, Zhang W Z,. Gold nanoparticles synthesized fromroot by green route method alleviates the isoprenaline hydrochloride induced myocardial infarction in rats [J]., 2020, 202: 111705.

[11] Xing N, Wang Y, Wang W J,. Cardioprotective effect exerted by Timosaponin BⅡ through the regulation of endoplasmic stress-induced apoptosis [J]., 2020, 78: 153288.

[12] Yang Q, Huang D D, Li D G,. Tetramethylpyrazine exerts a protective effect against injury from acute myocardial ischemia by regulating the PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway [J]., 2019, 24: 17.

[13] Greaves K, Dixon S R, Coker I O,. Influence of isoprostane F2alpha-III on reflow after myocardial infarction [J]., 2004, 25(10): 847-853.

[14] 趙琰, 胡杰, 張貴民, 等.荊防敗毒散的源流與應(yīng)用 [J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2020, 13(11): 1996-2002.

[15] 曹天佑, 屈會化, 董利洋, 等. 荊防顆粒對馬兜鈴酸I致小鼠急性腎損傷的預防和保護作用研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(18): 5742-5749.

[16] Lee J, Ko A R, Beom J W,. RAAS inhibitors in AMI patients with hypertension and preserved left ventricular systolic function [J]., 2022, 24: 108.

[17] Xie Y H, Lu L, Chen B L. Asymmetrical alternating current electrochemically-mediated washing method for susta RAAS inhibitors in AMI patients with hypertension and preserved left ventricular systolic function inable remediation of Cr(VI)-contaminated soil [J]., 2022, 437: 129088.

[18] Su X M, Lv L F, Li Y,. lncRNA MIRF promotes cardiac apoptosis through the miR-26a-Bak1 axis [J]., 2020, 20: 841-850.

[19] Jin T T, Lin J, Gong Y C,. iPLA2β contributes to ER stress-induced apoptosis during myocardial ischemia/ reperfusion injury [J]., 2021, 10(6): 1446.

[20] Guo J C, Yang Z Z, Lu Y Z,. An antioxidant system through conjugating superoxide dismutase onto metal-organic framework for cardiac repair [J]., 2021, 10: 56-67.

[21] Park J H, Nho K J, Lee J Y,. Anti-ischemic effects of PIK3IP1are mediated through its interactions with the ET A-PI3Kγ-AKT axis [J]., 2022, 11(14): 2162.

[22] Zou J, Fei Q, Xiao H,. VEGF-A promotes angiogenesis after acute myocardial infarction through increasing ROS production and enhancing ER stress-mediated autophagy [J]., 2019, 234(10): 17690-17703.

[23] Song Y F, Wang B C, Zhu X L,. Human umbilical cord blood-derived MSCs exosome attenuate myocardial injury by inhibiting ferroptosis in acute myocardial infarction mice [J]., 2021, 37(1): 51-64.

[24] 馮芹, 張貴民. 荊防敗毒散治療急性呼吸道感染的臨床應(yīng)用以及作用機制的探討 [J]. 中藥與臨床, 2020, 11(3): 28-32.

[25] 彭文杰, 顏學桔, 劉光憲. 劉光憲應(yīng)用荊防敗毒散化裁治療外感發(fā)熱經(jīng)驗 [J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2016, 32(7): 18-19.

[26] Chen Q X, Su L A, Liu C F,. PRKAR1A and SDCBP serve as potential predictors of heart failure following acute myocardial infarction [J]., 2022, 13: 13.

Protective effect of Jingfang Granules on acute myocardial infarction induced by isoproterenol in rats

DONG Li-yang1, CHENG Guo-liang1, YAO Jing-chun2, CAO Tian-you3, LI Xiao-peng1, QU Hui-hua4, KONG Hui1, ZHAO Yan1, ZHANG Gui-min2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. State Key Laboratory of Generic Technology of Traditional Chinese Medicine Pharmaceuticals, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China 3. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 4. Institute of Chinese Medicine Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore the protective effect of Jingfang Granules (荊防顆粒) on isoproterenol (ISO)-induced acute myocardial infarction in rats.SD rats were randomly divided into control group, model group, propranolol (10 mg/kg) group and Jingfang Granules high-, low-dose (32, 16 g/kg) groups, with 8 rats in each group. Rats in each administration group were ig corresponding drugs once a day for 14 d, 2 h after administration on 13th day, except for control group, rats in other groups were sc ISO (85 mg/kg) at multiple points, and control group was sc same volume physiological saline for two consecutive days. Electrocardiogram was used to observe the changes of ST segment. Left ventricular ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) were examined by echocardiography. Hearts were collected and heart weight index (HWI) was calculated. Pathological changes of myocardium were observed by hematoxylin eosin (HE) staining; Infarct size was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) method; Activities of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase isoenzyme (CK-MB), aspartate aminotransferase (AST) and levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum were detected by automatic biochemical analyzer; Activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), Na+, K+-ATP, Ca2+, Mg2+-ATP and levels of malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase (GSH), reactive oxygen species (ROS) in myocardium of rats were measured by kit; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of myocardial cells in rats; Nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) protein expressions in myocardium were detected by Western blotting.Compared with control group, ST segment in lead II of Electrocardiogram in model group was elevated upward (< 0.01), indicating that the model of acute myocardial infarction was successfully constructed; EF and FS were significantly decreased (< 0.01); Activities of LDH, AST, CK-MB and levels of TC, TG, LDL-C in serum were significantly increased (< 0.01); Activities of SOD, CAT, Na+, K+-ATPase, Ca2+, Mg2+-ATPase and level of GSH in myocardium were significantly decreased (< 0.01), while the levels of MDA and ROS were increased (< 0.01); Myocardial tissue showed significant pathological changes, myocardial infarction area was increased (< 0.01), apoptosis of myocardial cells were significantly increased (< 0.01); Nrf2 and HO-1 protein expressions in myocardium were significantly decreased (< 0.01). Compared with model group, EF and FS in Jingfang Granules group were significantly increased (< 0.05, 0.01); Activities of LDH, AST, CK-MB and levels of TC, TG, LDL-C in serum were decreased (< 0.05, 0.01); Activities of SOD, CAT, Na+, K+-ATP, Ca2+, Mg2+-ATP and level of GSH in myocardium were significantly increased (< 0.05, 0.01), while the levels of MDA and ROS were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Pathological changes of myocardial tissue were significantly improved, myocardial infarction area and apoptosis of myocardial cells were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Nrf2 and HO-1 protein expressions in myocardium were significantly increased (< 0.05, 0.01).Jingfang Granules can protect the heart by inhibiting apoptosis of myocardial cells and oxidative stress injury.

JingFang Granules; isoproterenol; acute myocardial infarction; oxidative stress; cell apoptosis; nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2/heme oxygenase-1 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6785 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.016

2022-08-28

荊防顆粒二次開發(fā)（2180071720113）

董利洋，男，碩士研究生，研究方向為經(jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。E-mail: dly1613@163.com

孔 慧（1976—），女，碩士生導師，副教授，研究方向為經(jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。Tel: (010)64286705 E-mail: doris7629@126.com

趙 琰（1973—），女，博士生導師，教授，研究方向為經(jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]