海洋微擬球藻對共培養(yǎng)三角褐指藻的分子生理學響應(yīng)機制

孫詩陽，張忠義，劉 航 ，郭 栗 *，楊官品，3，4*

(1.中國海洋大學 水產(chǎn)學院，山東 青島266003; 2.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266003；3.中國海洋大學 海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；4.中國海洋大學 進化與海洋生物多樣性研究所，山東 青島 266003)

引 言

在自然界中，甘蔗植株冠層中不同特征的葉片組合可提高其對光的吸收，進而促進生長[1]，地衣則是由綠藻、藍藻和細菌共生形成的繁殖體[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用田間作物的遺傳多樣性可降低作物病害的嚴重性，可能的機制是空間分割、病原體適應(yīng)性進化延緩和生理逆境緩沖等[3-4]。將不同生態(tài)習性的水產(chǎn)動物混養(yǎng)同樣可更高效地利用資源，減少病害發(fā)生、促進養(yǎng)殖動物生長[5-6]。事實上，互利共生、偏利共生和寄生是環(huán)境中不同生物間廣泛存在的互作關(guān)系[7]。微藻的一些種類被廣泛用作貝類、輪蟲等水產(chǎn)動物的餌料。育苗廠在培養(yǎng)這些餌料藻的過程中，由于細胞密度較低、培養(yǎng)系統(tǒng)不穩(wěn)定，餌料藻經(jīng)常難以滿足需要。雖然某些微藻，如Scenedesmusacuminatus，可經(jīng)過高密度發(fā)酵獲得較高生物量[8]。但更新培養(yǎng)設(shè)備成本高，育苗場難以承擔。近些年來，人們發(fā)現(xiàn)通過改變培養(yǎng)方式，將異種微藻混養(yǎng)或?qū)⑽⒃迮c其它微生物共培養(yǎng)可在一定程度上解決這一難題。微藻與包括細菌、真菌在內(nèi)的微生物共培養(yǎng)可提高微藻生物量和高附加值產(chǎn)物的積累[9-12]。共培養(yǎng)時，微生物可合成維生素、激素等，而微藻可利用這些物質(zhì)促進生長，同時為細菌真菌提供光合產(chǎn)物[13-14]。由于空氣-培養(yǎng)基交換的限制，微生物釋放的二氧化碳正是微藻大規(guī)模培養(yǎng)時可能缺乏的物質(zhì)。微生物也能將有機磷轉(zhuǎn)變成無機磷，便于微藻利用[15]。不同微藻種共培養(yǎng)的研究也有出現(xiàn)[16]，但還未涉及具體的互作機制研究。

海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)均是餌料藻。已有研究表明三角褐指藻可與其它微藻互作[17-19]，其全基因組序列已知[20-24]，可大規(guī)模培養(yǎng)[25]。海洋微擬球藻是潛在的能源微藻，其油脂和EPA含量豐富[26-27]，全基因組序列也已知[28-30]。鑒于三角褐指藻和海洋微擬球藻培養(yǎng)條件一致，均為海水藻種，二者或許可共培養(yǎng)，提高生物質(zhì)積累。但兩種微藻細胞在共培養(yǎng)后又無法進行徹底分離。因此，本研究采用交互轉(zhuǎn)錄組測序方法分析其相互作用的生理機制。

多物種混合轉(zhuǎn)錄組測序(msRNA-seq)[31]包括交互轉(zhuǎn)錄組測序[32](dual RNA-seq)，是一種前期不需要通過物理手段分開物種細胞，而是先將混合樣本中所測到的序列拼接到一起，在后期比對過程中分別以各自的參考基因組為標準進行數(shù)據(jù)分離，進而監(jiān)測雙方分子水平互作的方法。本研究中，我們用這種方法追蹤了處于指數(shù)生長期的海洋微擬球藻與處于指數(shù)末期的三角褐指藻等細胞數(shù)共培養(yǎng)24 h后的轉(zhuǎn)錄組變化，以追蹤兩物種相互作用的生理學機制。本研究所建立的方法也適用于自然界或?qū)嶒炇抑形⒃?微生物互作的研究。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)條件

本實驗所用藻株三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)均來源于中國海洋大學應(yīng)用微藻實驗室保存的藻種。用f/2-Si 培養(yǎng)基在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)容器為100 mL擰口玻璃瓶。培養(yǎng)條件為：25 ℃，光照周期 12 h光照:12 h黑暗，光照強度 70 μmol m-2s-1。

1.2 生長曲線繪制及共培養(yǎng)處理

每隔1 d，在培養(yǎng)箱不同的三層中各取一個培養(yǎng)瓶作為三個平行樣本測定細胞密度。用顯微鏡和細胞計數(shù)板對不同培養(yǎng)瓶內(nèi)的三角褐指藻和海洋微擬球藻分別進行計數(shù)[33]。用Origin作圖軟件作圖。共培養(yǎng)時，取指數(shù)末期的三角褐指藻藻液，去除培養(yǎng)基成分，重懸離心后以等細胞數(shù)與對數(shù)生長期的海洋微擬球藻混合。

1.3 交互RNA-seq建庫測序與數(shù)據(jù)處理

取三角褐指藻與海洋微擬球藻共培養(yǎng)初始時刻(0 h)和共培養(yǎng)24 h后的共培養(yǎng)物(平行樣本用r1，r2表示)，收集細胞，用TRIzol試劑盒(Invitrogen, USA)提取總RNA[34]。離心收集藻細胞并用3% NaCl溶液清洗，液氮中研磨，重懸于1 mL TRIzol中，搖勻，在室溫下放置5 min后離心取上清液，并與200 μL氯仿混合，混勻，放置5 min后離心取上清液。重復這一步驟直至上清液完全澄清。將上清液與500 μL異丙醇混合，-20 ℃靜置1 h，室溫靜置10 min，加入1 mL 70% 乙醇沉淀、清洗RNA。將RNA室溫干燥后懸于30 μL DEPC處理水中。用瓊脂糖凝膠電泳、Nannodrop2000 分光光度計、Qubit2.0 熒光光度計、Agilent2100進行RNA濃度、完整性和純度的檢測。

用3 μg總RNA和試劑盒(Illumina NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit)構(gòu)建測序文庫。用 Oligo(dT)磁珠富集mRNA帶，在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子打斷mRNA。用寡核苷酸為引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一條鏈，用 RNase H 降解 RNA模板，用DNA polymerase I合成 cDNA 第二條鏈。雙鏈 cDNA 經(jīng)末端修復、加A尾后連接測序接頭。用AMPure XP beads篩選 200 bp左右的cDNA，PCR 擴增，用 AMPure XP beads 純化 PCR 產(chǎn)物，獲得文庫。文庫構(gòu)建完成后先使用 Qubit2.0 Fluorometer 進行初步定量，稀釋文庫至 1.5 ng/μL，用 Agilent2100 bioanalyzer檢測插入片段大小。用qRT-PCR確定文庫有效濃度。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量需求混合進行 Illumina 測序,產(chǎn)生150 bp兩端短讀序。

測序片段被高通量測序儀測得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng) CASAVA 堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads)，文件為 fastq格式，其中主要包含測序片段的序列信息以及對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對原始數(shù)據(jù)進行過濾來去除帶接頭(adapter)的、含有不明堿基的以及低質(zhì)量的讀序。

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上下載三角褐指藻與海洋微擬球藻參考基因組序列，整合成參考基因組[35]，過濾掉比對到多個位置的讀序，然后分開兩種微藻的讀序，獨立分析海洋微擬球藻和三角褐指藻的基因表達。使用 HISAT2 v2.0.5[36]構(gòu)建參考基因組的索引和比對。用Feature Counts計算映射到每個基因的讀序，根據(jù)基因長度計算每個基因的 FPKM(每百萬堿基對測序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預期數(shù)量)，并計算映射到該基因的讀序。每個測序文庫，通過一個比例歸一化因子通過 edgeR 程序包調(diào)整讀取計數(shù)。差異表達分析使用edgeR R 軟件包(3.18.1)進行。使用 Benjamini & Hochberg方法調(diào)整P值。將校正后的P值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達閾值。使用DESeq2R統(tǒng)計軟件(1.16.1)基于負二項式分布的模型來進行兩個比較組合間的差異表達分析(每個組兩個生物學重復)。同樣使用 Benjamini和Hochberg 的方法來調(diào)整所得 P 值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率，并將調(diào)整的P值小于0.05的基因視為差異表達基因。通過 clusterProfiler R軟件基于超幾何分布原理實現(xiàn)差異表達基因的 GO(Gene Ontology，http://geneontology.org/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/)富集分析。

2 結(jié)果

2.1 生長情況

海洋微擬球藻在加入三角褐指藻后的8 d中與單獨培養(yǎng)相比其生長出現(xiàn)了停滯，三角褐指藻細胞數(shù)目與初始狀態(tài)相比也無顯著變化(圖1)，表明這是一種對雙方均有消極影響的相互作用(Negative bidirectional interaction)[37]。

圖1 三角褐指藻正常生長曲線(A)和共培養(yǎng)體系中(B)中三角褐指藻(紅色)、未混合時海洋微擬球藻(藍色)、混合三角褐指藻后(綠色)的生長曲線

2.2 海洋微擬球藻基因表達及通路富集

海洋微擬球藻處理組與對照組的平行樣本間重復性良好，皮爾森指數(shù)分別為0.992和0.996。表達的基因有8 235個，其中7 426個基因表達倍數(shù)無顯著差異，809個有顯著差異，351個為下調(diào)表達，458個為上調(diào)表達(圖2)。

圖2 對照組(N. oceanica，0 h r1，r2)和處理組組(N. oceanica, 24 h r1, r2)差異基因聚類(A)和火山分布圖(B)

共有7條KEGG通路被富集(表1)。一條通路中呈上調(diào)或下調(diào)表達的基因占優(yōu)勢，我們就認為該通路整體上調(diào)或下調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)通路有DNA復制和同源重組，上調(diào)通路有氨基和核苷酸糖代謝通路、Focal adhesion和PI3K-Akt、cAMP和ErbB信號通路。DNA復制(KEGG03030)和同源重組(KEGG03440)通路的下調(diào)可能是海洋微擬球藻在與三角褐指藻共培養(yǎng)后生長停滯的主要原因。氨基和核苷酸糖代謝通路則與細胞壁的維護和修復有關(guān)，它的上調(diào)說明三角褐指藻可能分泌了對海洋微擬球藻細胞壁造成消極影響的物質(zhì)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中19個基因總體上呈上調(diào)趨勢，這也暗示海洋微擬球藻存在運輸三角褐指藻可能分泌物的可能。Focal adhesion、cAMP和ErbB信號通路都可作用于PI3K-Akt信號通路。PI3K-Akt信號通路則作用于一系列底物，影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞的生長周期和凋亡。這條通路上的兩個重要的調(diào)節(jié)因子為phosphatidylinositol-3 kinases(PI3K)和protein kinase B(Akt)，分屬磷脂激酶家族和絲氨酸/蘇氨酸特異蛋白激酶，其中PI3K基因在部分微藻種中存在。PI3K-Akt信號通路是最有可能直接作用于DNA復制和同源重組的通路。

表1 微擬球藻實驗組和對照組的KEGG富集情況

3 討論

本文將海洋微擬球藻和三角褐指藻以1：1細胞數(shù)比例混合后，用交互 RNA-seq方法追蹤了二者共培養(yǎng)24 h后的轉(zhuǎn)錄本變化。但由于混合的三角褐指藻處于同步化的指數(shù)末期(圖1，第16天)。在新環(huán)境中需要重新啟動生長過程，同時響應(yīng)與海洋微擬球藻的共培養(yǎng)。我們無法剖分這兩部分基因，選出真正參與相互作用過程的基因，解析三角褐指藻的響應(yīng)機制。而在24 h內(nèi)，海洋微擬球藻一直處于原環(huán)境下的指數(shù)生長期，其細胞密度也未發(fā)生顯著改變。因此，其轉(zhuǎn)錄組的變化可反映其響應(yīng)共培養(yǎng)的變化。鑒于本研究目的在于建立混合物種轉(zhuǎn)錄組測序方法，驗證微藻混合培養(yǎng)互作的存在。因此，我們沒有列舉出三角褐指藻的分析結(jié)果，而是集中分析海洋微擬球藻響應(yīng)三角褐指藻共培養(yǎng)的機制。

混入三角褐指藻對海洋微擬球藻的生長起到了抑制作用，使其細胞數(shù)總體上保持不變。這與三角褐指藻與牡蠣海氏藻(Hasleaostrearia)按相同細胞總體積共培養(yǎng)時生長情況的變化相似[38]。KEGG的富集結(jié)果顯示，DNA復制和同源重組通路顯著下調(diào)，而氨基和核苷酸糖代謝、Focal adhesion和PI3K-Akt、cAMP、ErbB信號通路顯著上調(diào)。其中，DNA復制和同源重組通路所富集基因的一致下調(diào)阻礙了微擬球藻細胞的分裂進程，進而致使其與自然生長相比細胞數(shù)無法增加。而通過其它通路的上調(diào)，我們推測，三角褐指藻可能分泌了一類小分子化感物質(zhì)。這種物質(zhì)可破壞微擬球藻的細胞壁。又由Focal adhesion、cAMP、ErBb、PI3K-Akt信號通路所富集的共有基因可知這種化感物質(zhì)可被微擬球藻細胞膜上的一種受體蛋白(epidermal growth factor receptor)識別并結(jié)合，該蛋白主要結(jié)合的是多肽類物質(zhì)，而曾有研究從三角褐指藻的培養(yǎng)基中鑒定出一些可以對Heterosigmaakashiwo產(chǎn)生消極影響的成分，其中一種C30H38N6O6就屬于谷氨酰胺[18]。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族基因在以往處于高鹽、添加鎘離子逆境下的一些微藻種中的高倍數(shù)表達[39-42]也輔助暗示了本實驗中向胞外運輸化感物質(zhì)的存在。Focal adhesion通路中的基因編碼FG-GAP repeat，負責調(diào)節(jié)細胞的黏附性[43]。cAMP信號通路中的P-type ATPases基因[44]表示該通路主要是對環(huán)境中加入了三角褐指藻后營養(yǎng)物質(zhì)濃度變化的響應(yīng)，而PI3K-Akt信號通路中富集的Myb-like DNA-binding domain基因隸屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，可與DNA結(jié)合[45]，表示該信號通路有可能直接作用于DNA復制及同源重組過程。海洋微擬球藻也可能以同樣方式影響三角褐指藻生長(圖3)。真實的細胞外互作機制需要后續(xù)研究分析。

圖3 海洋微擬球藻響應(yīng)三角褐指藻共培養(yǎng)的可能生理機制

多物種混合轉(zhuǎn)錄組測序(msRNA-seq)已被用于自然生態(tài)系統(tǒng)或人為構(gòu)建共培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻間或微藻-微生物間互作機制的研究[31,46]。它破除了物理分離物種細胞的限制，通過測序數(shù)據(jù)分離實現(xiàn)各自基因的表達分析。在研究中，我們用交互轉(zhuǎn)錄組測序(dual RNA-seq)，msRNA-seq最約減形式，來解釋海洋微擬球藻響應(yīng)三角褐指藻共培養(yǎng)的生理機制。數(shù)據(jù)處理中，我們過濾掉了能同時匹配到兩物種或在一個物種中可以匹配兩個及兩個以上位置的讀序。這可能影響物種內(nèi)同源基因或兩個物種間同源基因的表達量。但這部分過濾掉的序列小于4%。我們相信這樣的過濾不會影響分析和結(jié)論獲取。結(jié)合Dual RNA-seq以往的應(yīng)用情況可知，它不僅可以用于寄生中兩個親緣關(guān)系相差甚遠的物種組合，也適用于兩種真菌或細菌這樣親緣關(guān)系相近的競爭及互利共生關(guān)系組合[31]，在本文兩種藻類之間的成功應(yīng)用也驗證了這一點。這些實驗設(shè)計的總體思路均是圍繞著一個互作過程展開，值得注意的是對照樣本和細胞狀態(tài)的選擇，在以后的應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇互作初始時間點或單獨培養(yǎng)的二者細胞作為對照，細胞狀態(tài)也應(yīng)保持一致，盡量同步在一樣的生長時期中。

參考基因組是將兩物種混合樣本中測序數(shù)據(jù)分開的必需依據(jù)。本研究中，兩個微藻種均具有高質(zhì)量的參考基因組序列。但因技術(shù)、成本、特殊生物特性的限制，很多物種還無法進行全基因組測序。全長轉(zhuǎn)錄組測序[47-49](full-length transcriptome sequencing)和單細胞基因組測序[50](single cell genome sequencing)可解決無參考基因組問題。隨著測序技術(shù)的不斷進步，不論是自然生態(tài)系統(tǒng)或人為共培養(yǎng)系統(tǒng)中的物種都可以擁有自己的參考基因組或全長轉(zhuǎn)錄組。這將有助于更多微藻種間相互作用生理機制的探索。生化方法和儀器設(shè)備的使用可判斷互作過程中雙方所分泌的化學物質(zhì)，而代謝組學方法的進步可極大地提高化感物質(zhì)的甄別[51]。