海洋紅酵母不同添加形式對凡納濱對蝦生長、消化酶活性及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

靳博文，李海東,2，田相利*，王 波，劉龍鎮(zhèn)，何 玉，李騰飛

(1.中國海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

引 言

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，具有抗逆性強、耐鹽范圍廣、環(huán)境適應(yīng)能力強等諸多優(yōu)點，是我國最主要的對蝦養(yǎng)殖品種。但隨著凡納濱對蝦的集約化高密度養(yǎng)殖及抗生素等藥品的不科學(xué)使用，致使養(yǎng)殖環(huán)境惡化、耐藥性增強、抗生素殘留等一系列問題接踵而至，制約了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近年來益生菌因其無毒、無污染、安全可靠等優(yōu)點被廣泛關(guān)注。益生菌指活菌、無活性的微生物細(xì)胞(完整或破碎)或細(xì)胞粗提物(含有復(fù)雜的化學(xué)成分)，作用效果因菌株或添加形式的差異而有所不同[1]。研究表明，益生菌作為飼料添加劑，可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的成活率、生長性能、抗病力和改善腸道菌群結(jié)構(gòu)等[2-3]。而益生菌的不同添加形式作為飼料添加劑用于對蝦養(yǎng)殖的研究較少，已有報道的有植物乳桿菌的不同添加形式對凡納濱對蝦的生長、消化酶和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響[4]。

海洋紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)是一種抗逆性強、營養(yǎng)價值高的真菌，其不僅富含水產(chǎn)動物所需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和各種消化酶，而且能產(chǎn)生以蝦青素為主的類胡蘿卜素從而具有促進抗體產(chǎn)生、增強宿主免疫功能和提高抗病力的功能。因此，對于水產(chǎn)動物來說，海洋紅酵母具有很高的營養(yǎng)價值。有研究顯示，海洋紅酵母作為水產(chǎn)幼苗的開口餌料及作為水產(chǎn)動物益生菌，具有促進水產(chǎn)動物生長、免疫力提高等功能[5]。然而，從已有的研究與應(yīng)用看，既有以死亡菌體形式添加的，也有以活菌形式進行使用的，尚缺乏對海洋紅酵母不同形式添加效果差異的比較研究。本研究比較了活菌、熱滅活菌體和超聲波破壁菌體的海洋紅酵母對凡納濱對蝦生長、消化酶活性、非特異性免疫指標(biāo)及免疫信號通路相關(guān)基因表達量的影響，以期為海洋紅酵母在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的使用形式和相關(guān)作用機制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 不同添加形式的海洋紅酵母

本實驗使用的海洋紅酵母(編號：RG)來自于中國海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實驗室篩選、保存的菌種。實驗所用的海洋紅酵母分為三種形式：活菌菌體、破壁菌體以及熱滅活菌體。實驗菌體準(zhǔn)備如下：海洋紅酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)48 h后，10 000 rpm/min 離心10 min收集菌體，再用生理鹽水制成濃度為1×1010cfu/mL的菌懸液備用。將1×1010cfu/mL的海洋紅酵母菌懸液進行超聲波破碎(20 min)。熱滅活菌(105 ℃滅活)由根源生物集團有限公司處理后提供，用生理鹽水制成濃度為1×1010cfu/mL的菌懸液備用。

1.1.2 實驗飼料制備

對照組飼料由凡納濱對蝦商品飼料表面直接包裹一層褐藻酸鈉(3.15 g/500 g)和魚油(4.25 mL/500g)制成。實驗組飼料按照1×1010cfu/kg比例將活菌菌懸液、熱滅活菌粉菌懸液和破碎菌體菌懸液噴灑在凡納濱對蝦商品化飼料表面，揉搓陰干，再在其表面包裹一層褐藻酸鈉和魚油，實驗飼料分別標(biāo)記為HY、HS和PH。

1.2 實驗對蝦及飼養(yǎng)管理

健康的凡納濱對蝦購自青島寶榮水產(chǎn)有限公司，養(yǎng)殖用水鹽度為17‰左右，在水族箱中馴化暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間每天將養(yǎng)殖用水每天提升2‰的鹽度直到30左右，穩(wěn)定兩天用于養(yǎng)殖實驗。暫養(yǎng)結(jié)束后，對蝦進行饑餓處理24 h，然后挑選健康、個體大小均勻的對蝦200尾初(初始體重3.57±0.01 g)，均勻分配于20個50 L的玻璃缸中，每個玻璃缸中放置10尾。20個玻璃缸隨機分為4個實驗組，每個組5個重復(fù)。實驗期間，每天投喂2次，分別為上午8:00和下午5:00各投喂一次，每天的投喂量為對蝦體重的4%～5%，每次投喂前用虹吸法吸出殘餌和糞便。每天換一次水，換水量為原水位的1/3到2/3左右，水溫23 ℃左右，鹽度28～30，pH 7.8～8.0，溶氧量5 mg/L以上，每日檢查并記錄對蝦的攝食及死亡情況。

1.3 樣品采集及處理

實驗結(jié)束后，饑餓24 h，稱重并記錄蝦的末體重。分別采取對蝦的血淋巴和肝胰腺。用1 mL無菌注射器在對蝦的腹部頭胸甲處，針頭向前抽取對蝦體內(nèi)的血淋巴，將收集的血淋巴置于2 mL的離心管中，4 ℃靜置過夜后，5 000 rpm離心10 min收集血清，存于-80 ℃?zhèn)溆?。用無菌剪解剖對蝦，取出肝胰腺，用無菌剪刀剪成小塊，存放于含有RNA保護液的2 mL離心管中，4 ℃放置12 h后，存于-80 ℃保存。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長指標(biāo)

為對比整個實驗期間的各處理組生長性能，分別在開始實驗和結(jié)束實驗時對各水族箱中的對蝦進行體重和數(shù)量的統(tǒng)計，并將各處理組在實驗期間的投餌量、殘餌量，計算各生長指標(biāo)。

成活率=(實驗后對蝦數(shù)量/實驗前放養(yǎng)數(shù)量)×100%

增重率(WGR)=(W末-W初)×100%/W初

特定生長率(SGR)=[(lnW末-lnW初)/t]×100%

式中，W末為末體重；W初為初體重。

1.4.2 消化酶活性測定

選取肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶作為評價指標(biāo)。活性測定均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4.3 非特異性免疫酶活性測定

免疫酶選取5個指標(biāo)作為評價標(biāo)準(zhǔn)：超氧化物歧化酶(SOD)、總一氧化氮合酶(TNOS)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)以及溶菌酶(LSZ)活性測定均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，具體測定方法參照產(chǎn)品說明書。

1.4.4 基因表達

對蝦肝胰腺使用RNA提取試劑盒獲取總RNA，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，用Nanodrop2000進行總RNA濃度的定量。利用熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測凡納濱對蝦免疫相關(guān)基因(Toll，Imd和Relish)的相對表達量。利用q-PCR檢測，使用的引物如下：

18S-F:GCCTGAGAAACGGCTACCACATC, 18S-R:GTAGTAGCGACGGGCGGTGTGT

Rel3-F:CCTGTGAAGACATTAGGAGGAGTA, Rel5-R:CCAGTTGTGGCATTCTTTAGG

Toll-F1:TGGACTTCTGCTCGGACAAC, Toll-R1:GTACATGTCCTTGGTCGGCA

Imd-F2:TCACATTGGCCCCGTTATCC, Imd-R2:ATCTCGCGACTGCACTTCAA

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS21軟件進行，各處理之間的差異采用單因子方差(one-way ANOVA)分析和Duncan’s多重比較分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

熒光實時定量PCR(qRT-PCR)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用2-△△CT法(相對定量法)對各目標(biāo)組基因相對表達量進行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 對生長的影響

如表1所示各實驗組對蝦的末體重、特定生長率、增重率均顯著高于對照組(P<0.05)。飼料中添加三種形式的海洋紅酵母均可促進凡納濱對蝦的生長，但添加熱滅活和破壁酵母處理對蝦的生長更佳(P<0.05)。各處理組對蝦成活率均在90%以上，與對照組之間差異不顯著(P<0.05)。

表1 凡納濱對蝦的生長、特定生長率、成活率和增重率

2.2 對肝胰腺消化酶活性的影響

2.2.1 淀粉酶

如圖1所示，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母均可以顯著提高對蝦肝胰腺中淀粉酶活性(P<0.05)，實驗組對蝦的肝胰腺中淀粉酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，但各實驗組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦淀粉酶活性的影響

2.2.2 胰蛋白酶

如圖2所示,飼料中添加不同形式的海洋紅酵母均可以顯著提高對蝦肝胰腺中胰蛋白酶活性(P<0.05)，其中PH組對蝦的肝胰腺中胰蛋白酶活性最高，顯著高于其他實驗組(P<0.05)；HY組和HS組對蝦的肝胰腺中胰蛋白酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦胰蛋白酶活性的影響

2.2.3 脂肪酶

由圖3可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母均可以顯著提高對蝦肝胰腺中脂肪酶活性(P<0.05)，其中對蝦肝胰腺中脂肪酶活性在PH組達到最大值，顯著高于對照組和HY組(P<0.05)；HY和HS組之間的對蝦肝胰腺中脂肪酶活性沒有顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于對照(P<0.05)。

圖3 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦脂肪酶活性的影響

2.3 對非特異性免疫酶的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶

由圖4可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母可以顯著提高凡納濱對蝦的血清超氧化物歧化酶(SOD)活性。其中，PH與HY組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于HS組(P<0.05)。

圖4 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶的影響

2.3.2 溶菌酶

由圖5可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦的血清溶菌酶(LSZ)活性影響不同。其中，PH組和HY組活性顯著高于對照組(P<0.05)，HS組略高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦溶菌酶的影響

2.3.3 酸性磷酸酶

由圖6可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦的血清酸性磷酸酶(ACP)活性影響不同。其中，HY組和PH組活性顯著高于對照組(P<0.05)，PH組顯著高于HY組(P<0.05)。

圖6 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦酸性磷酸酶的影響

2.3.4 堿性磷酸酶

由圖7可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦的血清堿性磷酸酶(AKP)活性影響不同。其中，HY組和PH組活性顯著高于對照組(P<0.05)，但HS組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖7 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦堿性磷酸酶的影響

2.3.5 總一氧化氮合酶

由圖8可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦的血清堿總一氧化氮合酶(TNOS)活性影響不同。其中，PH組活性顯著高于其他實驗組和對照組(P<0.05)，但HY和HS組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖8 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦總一氧化氮合酶的影響

2.4 免疫基因在肝胰腺中的表達

2.4.1 Imd基因

由圖9可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺中Imd基因相對表達量影響有所不同。對蝦肝胰腺中Imd基因相對表達量在HY組達到最大值顯著高于對照組和PH組(P<0.05)，但與HS組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

圖9 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺Imd免疫基因相對表達量的影響

2.4.2 Toll基因

飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺中Toll基因表達量的影響如圖10所示，HY組和HS組肝胰腺中Toll基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，PH組與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。

圖10 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺Toll免疫基因相對表達量的影響

2.4.3 對蝦肝胰腺Relish基因的表達

由圖11可知，飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺中Relish基因相對表達量影響有所不同，對蝦肝胰腺中基因相對表達量在HY組達到最大值，顯著高于對照組(P<0.05)；HS與PH組與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

圖11 飼料中添加不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦肝胰腺Relish免疫基因相對表達量的影響

3 討論

3.1 海洋紅酵母不同使用形式對凡納濱對蝦生長和消化酶活性的影響

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，益生菌作為飼料添加劑，可顯著提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的成活率、生長性能、抗病力和改善腸道菌群結(jié)構(gòu)等[2-3]。作為提高水產(chǎn)動物免疫力、生長等的益生菌除了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌外，還有噬菌體、微藻類以及酵母等。而海洋紅酵母菌體富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、蝦青素、β-胡蘿卜素、多糖以及其他未知的營養(yǎng)因子，可以提高水產(chǎn)動物的存活率、免疫力、抗病力，改善產(chǎn)品品質(zhì)，從根本上減少對抗生素的依賴，是生態(tài)養(yǎng)殖優(yōu)良的添加劑。研究表明，海洋紅酵母作為飼料添加劑對凡納濱對蝦[6]、卵形鯧鯵(Trachinotusovatus)[7]和刺參(Apostichopusjaponicas)[8]均有良好的促生長作用。Romo-Figueroa等[9]和Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)海洋紅酵母可以產(chǎn)生較高的β-葡聚糖，可與肝胰腺中的β-GBP-HDL結(jié)合，可能通過合成血淋巴蛋白質(zhì)增強對蝦免疫酶活力，通過促進糖類和脂肪代謝促進對蝦的生長。還有研究指出，蝦青素對水產(chǎn)動物的生長具有顯著促進作用，是對蝦早期發(fā)育所必需的生長因子[11]。本研究結(jié)果表明，活菌體、破壁菌體和滅活菌粉三種不同形式的海洋紅酵母作為飼料添加物均能顯著提高凡納濱對蝦的末體重和特定生長率，與王計剛等[12]、呂玉華等[13]的研究結(jié)果相似，不過三者相比，相對于活菌，飼料中添加熱滅活和破壁菌體對對蝦的促長作用更佳。

有研究表明，益生菌對凡納濱對蝦的促生長機理可能與益生菌能提高對蝦的消化酶活性有關(guān)[14]。消化酶活性的高低是衡量養(yǎng)殖生物消化水平高低的重要指標(biāo)之一。Waché等[15]認(rèn)為酵母菌能刺激水產(chǎn)養(yǎng)殖動物消化系統(tǒng)的成熟。熊家等[16]報道了飼料中添加3%酵母水解物可以顯著提高對蝦肝胰腺的淀粉酶活性、淀粉酶活性以及胰蛋白酶活性。楊世平等[17]在飼料中添加沼澤生海洋紅酵母，發(fā)現(xiàn)添加干酵母粉可以顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺中蛋白酶和脂肪酶活力，減少其腸道弧菌數(shù)，可作為對蝦養(yǎng)殖的益生菌。本研究結(jié)果表明，添加不同形式的海洋紅酵母后均能提高對蝦肝胰腺消化酶活性，尤其是肝胰腺胰蛋白酶和淀粉酶活性，這與丁賢等[18]對凡納濱對蝦的研究結(jié)果相似。從三種不同的添加形式相比，破壁菌體對胰蛋白酶和脂肪酶活性的促進作用比活菌和熱滅活菌體效果更為顯著。丁賢等[18]在飼料中添加芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長的研究結(jié)果中消化酶活性與生長的相關(guān)性相對要強，在本研究中消化酶活性與生長之間存在一定的相關(guān)性，是否具有明顯的正向關(guān)系有待進一步驗證。

3.2 海洋紅酵母不同使用形式對凡納濱對蝦免疫防御因子的影響

已有研究表明，凡納濱對蝦的免疫系統(tǒng)并不完善，主要靠非特異性免疫對外部刺激進行防御[19]。其中，超氧化物歧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和總一氧化氮合酶等指標(biāo)均能體現(xiàn)對蝦非特異性免疫能力[20]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種可以清除體內(nèi)多余自由基提高免疫水平的抗氧化物酶，本研究中三個實驗組的超氧化物歧化酶活性均明顯高于對照組，與Yong等[6]研究結(jié)果一致。溶菌酶(LSZ)，可以溶解病原菌細(xì)胞壁，使其病原菌破裂死亡，從而起到機體防御的功能。本研究中飼料中添加海洋紅酵母活菌體和破壁菌體均能顯著提高對蝦溶菌酶活性，這一實驗結(jié)果與包鵬云等[8]研究結(jié)果相似。酸性磷酸酶(ACP)是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，巨噬細(xì)胞吞噬異物顆粒形成吞噬體，然后用包括ACP在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒。堿性磷酸酶(AKP)是催化磷酸單脂水解的酶類，與ACP反應(yīng)機理相似，參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，同時在動物解毒體系中發(fā)揮也起著重要作用。本研究中添加海洋紅酵母活菌體和破壁菌體組ACP與AKP活性相較對照組都有顯著提高?？傄谎趸厦?TNOS)可以催化產(chǎn)生NO,進而抑制代謝酶以及與氧自由基結(jié)合生成強氧化劑來消滅異物。張春曉等[21]在飼料中添加海洋紅酵母，但刺參的NOS只是在一定程度上有所提高，效果并不顯著，與本研究結(jié)果相似。在本研究中，使用海洋紅酵母活菌和破壁菌體組，凡納濱對蝦血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶等的活性顯著高于對照組，均不同程度地提高了免疫防御因子的活性，效果優(yōu)于熱滅活菌體。

研究表明，紅酵母可以刺激免疫應(yīng)答，激活動物體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。β-葡聚糖可能是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要的化合物，但某些其他細(xì)胞壁成分或可溶性因子也可起到免疫刺激的作用[22]。王洪斌等[23]利用海洋紅酵母多糖提取物注射日本鱘(Charybdisjaponica)，48h內(nèi)其體內(nèi)免疫活性因子超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、溶菌酶均有不同程度提高，可見其對日本鱘有較強的免疫刺激作用。而劉雨等[24]認(rèn)為，海洋紅酵母可以產(chǎn)生蝦青素，蝦青素具有很好的抗氧化作用以及提高凡納濱對蝦的免疫力。本研究結(jié)果顯示，在凡納濱對蝦飼料中添加海洋紅酵母破壁菌體，ACP、AKP、SOD等各項免疫指標(biāo)均顯著高于對照組，根據(jù)包云鵬等[8]研究顯示，口服β-葡聚糖或核苷酸可以增強幼參體腔細(xì)胞的吞噬活力或呼吸爆發(fā)，以及提高溶菌酶和酚氧化酶活力，推測本研究中酵母菌細(xì)胞組分(如葡聚糖或核苷酸)可能有助于免疫刺激作用，更深入的原因有待研究。

3.3 海洋紅酵母不同使用形式對肝胰腺免疫基因相對表達量的影響

研究顯示，對蝦主要細(xì)胞免疫和體液免疫識別和破壞病原體，病原體的侵入觸發(fā)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括NF-κB信號通路、Toll和IMD通路，從而激活了參與宿主防御的基因，一般認(rèn)為，抗菌肽作為體液免疫的效應(yīng)物，在殺死和控制病原微生物方面起著重要作用，也可調(diào)節(jié)其他免疫反應(yīng)[25]。許多研究表明，Toll信號通路和Imd信號通路可以調(diào)節(jié)多種抗菌肽類物質(zhì)產(chǎn)生[25-26]。在對蝦的Imd信號通路中，Imd基因和Relish基因是兩個獨立過程[27]。研究表明，Relish基因是眾多同源抗菌肽類物質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同形式的海洋紅酵母對對蝦肝胰腺Toll、Imd、Relish基因相對表達量具有顯著不同的影響。海洋紅酵母活菌可以顯著提高肝胰腺Toll、Imd、Relish基因相對表達量，但對比起來，添加破碎菌體和熱滅活菌體對這幾個相關(guān)基因相對表達量影響并不顯著。考慮到養(yǎng)殖動物機體免疫過程的復(fù)雜性，其具體的機制有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

飼料中添加不同形式的海洋紅酵母對凡納濱對蝦的生長、消化酶活性、免疫防疫因子及免疫基因表達的影響存在一定的差異。其中，添加熱滅活和破壁菌體對對蝦的促長作用更佳，破壁菌體對提高胰蛋白酶和脂肪酶活性更為有效，但熱滅活菌體對血清中相關(guān)免疫酶活性影響不大，而活菌則顯著提高了對蝦肝胰腺免疫信號通路Toll、Imd和Relish基因相對表達量。鑒于此，不同形式海洋紅酵母對凡納濱對蝦生理生態(tài)學(xué)影響差異的作用機理以及可能的差異化應(yīng)用方式值得深入進一步研究。