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    微小RNA-16 對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究

    2022-11-04 01:19:48賴震宇趙展慶余秉昌蔡秋燕林奇棟
    中國循環(huán)雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶心肌細(xì)胞抑制劑

    賴震宇,趙展慶,余秉昌,蔡秋燕,林奇棟

    急性心肌梗死(AMI)是一種以冠狀動脈閉塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧和死亡為特征的疾病[1]。微小RNA(miR)是治療心血管疾病的新靶點(diǎn)[2-3]。已經(jīng)在缺血、缺氧的心臟和心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了miR 的異常表達(dá)[4]。miR-16 可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡來加重心肌缺血損傷[5]。在AMI中,抑制miR-16 可保護(hù)大鼠心臟免受缺血性損傷[6],表明miR-16 可能是挽救缺血性心肌的治療靶點(diǎn)。然而,miR-16 在AMI 中的作用機(jī)制尚不明確。miRNA 和信使RNA(mRNA)之間的相互作用在AMI 后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,已經(jīng)在AMI患者中發(fā)現(xiàn)了競爭性內(nèi)源性RNA 網(wǎng)絡(luò)[7]。維甲酸受體相關(guān)孤核受體A(RORA)是維持心臟功能的關(guān)鍵保護(hù)劑,上調(diào)RORA 可抑制心肌細(xì)胞的缺氧損傷[8]。此外,RORA 可抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)通路激活[9]。另有研究顯示,miR-16 是一種潛在的NF-κB 相關(guān)miRNA,在心肌梗死大鼠中NF-κB 的激活可上調(diào)miR-16 表達(dá)[10-11]。然而,在AMI中,RORA 是否介導(dǎo)miR-16與NF-κB 的激活還是未知。使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(TargetScan、starBase、PicTar)搜索了miR-16 下游靶標(biāo),預(yù)測顯示RORA 與miR-16 具有特定的結(jié)合位點(diǎn),是miR-16 的潛在靶基因。我們推測miR-16的過表達(dá)可能是AMI 中RORA 低表達(dá)的原因,抑制miR-16 可能通過上調(diào)RORA 來預(yù)防AMI。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SPF 級雄性SD 大鼠80只,體質(zhì)量(200±20)g,購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁殖有限公司,合格證號為SCXK(魯)20190003。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng):溫度(21±1)℃,濕度55%~60%,可自由獲取食物和水。

    1.2 主要試劑與儀器

    重組腺相關(guān)病毒血清型9(rAAV9)載體攜帶miR-16 抑制劑(rAAV9-anti-miR-16)基因和用于RORA沉默的短發(fā)夾RNA(shRNA)(rAAV9-sh-RORA)及相應(yīng)的陰性對照(rAAV9-anti-NC、rAAV9-sh-NC)、miR-16 模擬物(miR-16 mimic)及其陰性對照(miR-NC)購自上海GenePharm 公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液、核蛋白提取試劑盒購自北京Solarbio 公司;大鼠N 末端B 型利鈉肽原(NT-proBNP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;兔源一抗B 細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、NF-κB p65、RORA、TNF-α 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、組蛋白H3(Histone H3)購自英國Abcam 公司;兔源一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、裂解的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)購自美國Cell Signaling Technology 公司。動物心電圖系統(tǒng)(Nasiff Associates 公司,美國);Vevo 2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)(VisualSonics 公司,加拿大);iMark680 多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司,美國);BX51 電動顯微鏡(Olympus公司,日本);ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國)。

    1.3 AMI 大鼠模型的建立

    將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組,n=12)和造模組(n=68)。造模組大鼠采用左前降支(LAD)永久結(jié)扎法[12]建立AMI 模型。通過腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)來麻醉大鼠。在第四肋間打開胸腔,露出心臟。用6-0 尼龍縫線在距左耳尖2~3 mm 處結(jié)扎LAD。三導(dǎo)聯(lián)心電圖用于監(jiān)測心肌缺血開始時的心率以及典型的心電圖變化。結(jié)扎30 min 后觀察到心電圖ST 段明顯抬高和心肌紫紺,AMI 模型即成功建立[12]。為了降低大鼠的死亡率,在結(jié)扎后即可在心臟表面滴注(1~2 滴)和腹腔注射(0.1~0.2 ml)利多卡因以預(yù)防室性心律失常,并腹腔注射呋塞米(0.1~0.2 ml)以減輕心臟負(fù)荷[13]。然后,逐層縫合。sham 組大鼠不結(jié)扎冠狀動脈,其余操作同上。

    1.4 分組與干預(yù)

    取60 只造模成功大鼠隨機(jī)分為AMI 組、rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組(rAAV9-anti-NC 組)、rAAV9-miR-16 抑制劑組(rAAV9-anti-miR-16 組)、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA的陰性對照組(rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組)、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA沉默組(rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組),每組12 只。rAAV9-anti-NC 組和rAAV9-anti-miR-16 組大鼠分別通過單次尾靜脈注 射200 μl 的rAAV9-anti-NC 和rAAV9-anti-miR-16(含1×1011個載體基因拷貝)[14];rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠以相同的方法將rAAV9-anti-miR-16和rAAV9-sh-NC 共同注射到大鼠體內(nèi),rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠以相同的方法和劑量注射rAAV9-anti-miR-16 和rAAV9-sh-RORA,sham組和AMI 組尾靜脈注射等體積的生理鹽水。單次尾靜脈注射,注射2 周后,進(jìn)行取材和相關(guān)指標(biāo)的檢測。

    1.5 取材及指標(biāo)檢測

    1.5.1 超聲心動圖檢測大鼠心功能

    將所有大鼠麻醉并仰臥位固定以進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動圖檢測,評估左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。所有測量值均取自5 個連續(xù)心動周期的平均值。

    1.5.2 ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB和LDH 活性

    心功能檢測完成后,大鼠經(jīng)腹主動脈取血,靜置后以2 000×g 離心10 min,取血清。ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性。

    1.5.3 TTC 染色檢測心肌梗死面積

    每組隨機(jī)選取6 只大鼠,采集血樣后,迅速收集心臟組織。然后,將心臟組織冠狀面切成五片,用0.2% TTC 溶液快速染色。用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像并使用Image J 軟件進(jìn)行分析。心肌梗死面積百分比計算為白色面積(梗死區(qū)域)/總面積×100%。

    1.5.4 HE 染色檢測心肌組織病理學(xué)變化

    每組剩余6 只大鼠,取結(jié)扎線下方的左心室組織。將左心室組織冠狀切分為兩部分,一部分于-80℃保存;另一部分用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片厚5 μm,進(jìn)行常規(guī)HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

    1.5.5 TUNEL 染色檢測心肌組織中細(xì)胞凋亡

    取心肌組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化后,添加TUNEL 染色溶液并在37℃下避光孵育60 min,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min。封片,在熒光顯微鏡下觀察切片,并使用Image J 軟件計數(shù)TUNEL 陽性(TUNEL+,綠色熒光)細(xì)胞,計算細(xì)胞凋亡率(TUNEL+細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%)。每張切片隨機(jī)選取3 個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    1.5.6 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)檢測心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 表達(dá)水平

    使用Trizol 試劑從心臟組織中分離總RNA 樣品。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后,在ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 系統(tǒng)中擴(kuò)增cDNA。熱循環(huán)條件如下:95℃10 min,94℃ 15 s,60℃ 30 s 和72℃ 60 s,40 個循環(huán)。2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達(dá)量,U6 和GAPDH 用于標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.5.7 免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測心肌組織中蛋白表達(dá)

    用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取心肌組織總蛋白,并用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白質(zhì)(用于檢測NF-κB p65 水平)。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度后,將蛋白質(zhì)(30 μg)變性并通過10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h。洗滌3 次后,將膜與一抗Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bax,均以1: 500 稀釋;NF-κB p65、RORA、TNF-α、Histone H3,均以1: 1 000 稀釋;GAPDH,1: 2 000 稀釋在4℃下孵育過夜。然后將山羊抗兔IgG 二抗(HRP,1: 2 000)與膜在室溫下孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)檢測免疫反應(yīng),并用Image J 軟件計算條帶灰度值。GAPDH、Histone H3 為內(nèi)參蛋白。

    1.5.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

    miR-16 和RORA 的結(jié)合位點(diǎn)由StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測。構(gòu)建重組熒光素酶報告載體psiCHECK-2,分別攜帶野生型(WT)或突變型(MUT)RORA 的3'-非翻譯區(qū)(3'UTR),命名為WT-RORA、MUT-RORA。使 用Lipofectamine 3 000 試劑將24 孔板中的HEK-293 細(xì)胞與熒光素酶報告載體(WT-RORA、MUT-RORA)和miR-16 mimic 或miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后,用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Dual-Glo?)測量psiCHECK-2 載體的熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性用作內(nèi)部對照,計算螢火蟲螢光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比率。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(表2)

    表2 各組大鼠的心功能指標(biāo)比較(n=12,)

    注:LVEDD:左心室舒張末期內(nèi)徑;LVESD:左心室收縮末期內(nèi)徑;LVEF:左心室射血分?jǐn)?shù);LVFS:左心室短軸縮短分?jǐn)?shù);rAAV9:重組腺相關(guān)病毒血清型9;RORA:維甲酸受體相關(guān)孤核受體A;miR:微小RNA。sham 組:假手術(shù)組;AMI 組:急性心肌梗死組;rAAV9-anti-NC 組:rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組;rAAV9-anti-miR-16 組:rAAV9-miR-16 抑制劑組;rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組:rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA 的陰性對照組;rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組:rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發(fā)夾RNA 組。與sham 組相比*P<0.05,與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比△P<0.05,與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比▲P<0.05

    與sham 組相比,AMI 組大鼠LVEDD、LVESD 均顯著增大,LVEF、LVFS 均顯著下降(P均<0.05);與AMI組、rAAV9-anti-NC組相比,rAAV9-antimiR-16組大鼠LVEDD、LVESD均顯著減小,LVEF、LVFS均顯著升高(P均<0.05);與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠LVEDD、LVESD 顯著增大,LVEF、LVFS 均顯著下降(P均<0.05)。

    2.2 各組大鼠血清NT-proBNP水 平、CK-MB和LDH活性比較(圖1)

    圖1 各組大鼠血清NT-proBNP 水平(1A)、CK-MB(1B)和LDH 活性(1C)比較(n=12)

    與sham 組相比,AMI 組大鼠血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性均顯著升高(P均<0.05);與AMI 組、rAAV9-anti-NC組相比,rAAV9-antimiR-16 組上述指標(biāo)水平均顯著降低(P均<0.05);與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組上述指標(biāo)水平均顯著升高(P均<0.05)。

    2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較(圖2)

    與sham 組相比,AMI 組大鼠心肌梗死面積百分比顯著升高(P<0.05);與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16 組心肌梗死面積百分比均顯著降低(P均<0.05);與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組心肌梗死面積百分比均顯著升高(P均<0.05)。

    2.4 各組大鼠心肌組織損傷比較(圖3)

    圖3 HE 染色檢測各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變(n=6,比例尺:50μm)

    HE 染色結(jié)果顯示,sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,心肌纖維排列整齊,無明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤;與sham 組相比,AMI 組和rAAV9-anti-NC 組大鼠可見心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹、數(shù)量減少,心肌纖維出現(xiàn)斷裂,炎性細(xì)胞浸潤明顯;與AMI 組和rAAV9-anti-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠可見輕度心肌細(xì)胞水腫,少量心肌纖維斷裂,炎性細(xì)胞浸潤減少;與rAAV9-anti-miR-16 組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,炎性細(xì)胞浸潤增加,心肌損傷加重。

    2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較(圖4)

    圖4 TUNEL 染色檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡(n=6)

    TUNEL 染色結(jié)果顯示,與sham 組相比,AMI組大鼠心肌組織中綠色熒光標(biāo)記的TUNEL+細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與AMI組、rAAV9-anti-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

    2.6 各組大鼠心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平比較(圖5)

    圖5 各組大鼠心肌組織miR-16(5A)、RORA mRNA(5B)、TNF-α mRNA(5C)、IL-6 mRNA(5D)水平比較(n=6)

    與sham 組相比,AMI 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高,RORA mRNA水平顯著降低(P均<0.05);與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組 相 比,rAAV9-anti-miR-16 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著降低,RORA mRNA 水平顯著升高(P均<0.05);與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高,RORA mRNA 水平顯著降低(P均<0.05)。

    2.7 各組大鼠心肌組織Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白水平比較(圖6)

    與sham 組相比,AMI 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平均顯著升高,Bcl-2 蛋白水平顯著降低(P均<0.05);與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著降低,Bcl-2 蛋白水平均顯著升高(P均<0.05);與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著升高,Bcl-2 蛋白水平均顯著降低(P均<0.05)。

    2.8 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較(圖7)

    圖7 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平(n=6)

    與sham 組相比,AMI 組RORA 蛋白水平顯著降低,TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高(P均<0.05);與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16 組RORA 蛋白水平顯著升高,TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低(P均<0.05);與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比,rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組RORA蛋白水平顯著降低,TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高(P均<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2)采集套管氣的技術(shù)路線。對于正在生產(chǎn)的抽油井,回油干線的壓力稱為回壓。一般情況下,回壓取決于原油集輸系統(tǒng)的流動阻力。一旦建設(shè)完成原油集輸系統(tǒng),回壓波動將是一個穩(wěn)定值Ph。

    注:6A:蛋白電泳圖;6B:各組Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)量比較。A:假手術(shù)組(sham 組);B:急性心肌梗死組(AMI組);C:rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組(rAAV9-anti-NC 組);D:rAAV9-miR-16 抑制劑組(rAAV9-anti-miR-16 組);E:rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA的陰性對照組(rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組);F:rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發(fā)夾RNA 組(rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組)。Caspase-3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;cleaved-Caspase-3:裂解的Caspase-3;Bcl-2:B 細(xì)胞淋巴瘤/因子2;Bax:Bcl-2 相關(guān)X 蛋白;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;miR-16:微小RNA-16;rAAV9:重組腺相關(guān)病毒血清型9;RORA:維甲酸受體相關(guān)孤核受體A。與sham 組相比*P<0.05;與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比 △P<0.05;與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比▲P<0.05

    2.9 miR-16 靶向調(diào)控RORA 表達(dá)(圖8)

    圖8 靶基因預(yù)測和細(xì)胞熒光素酶活性結(jié)果

    通過StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測編碼RORA 的3'UTR mRNA 含有miR-16 的結(jié)合位點(diǎn)。

    雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC 相比,轉(zhuǎn)染miR-16 抑制劑后,含有WT-RORA 質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),含MUT-RORA 質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性未受顯著影響(P>0.05)。

    3 討論

    TNF-α 是一種促炎細(xì)胞因子,其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的下游靶標(biāo)是NF-κB。心臟組織中TNF-α/NF-κB 激活被認(rèn)為是心肌梗死的標(biāo)志[15]。有研究發(fā)現(xiàn),病情嚴(yán)重且預(yù)后不良的AMI 患者NF-κB p65表達(dá)水平顯著增加,與AMI 發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[16]。RORA 為心肌梗死的關(guān)鍵基因[8]。RORA 的缺乏會加劇高脂飲食引起的心肌肥大、纖維化和功能障礙[17]。重要的是,RORA 是一種炎癥調(diào)節(jié)劑,RORA 的缺失會導(dǎo)致IL-6 表達(dá)增強(qiáng)和NF-κB 核轉(zhuǎn)位[18]。相反,RORA 的過表達(dá)可以通過阻斷NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位和調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)表達(dá)限制NF-κB p65在賴氨酸310 處的乙酰化來緩解體內(nèi)和體外脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥和器官損傷[19]。這些研究表明,RORA 在維持心肌細(xì)胞存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    本研究結(jié)果顯示,缺血性心臟中RORA 表達(dá)降低,而miR-16 和NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位均增加。在敲低miR-16后,RORA 上調(diào),TNF-α 表達(dá)、NFκB p65 核轉(zhuǎn)位和心肌細(xì)胞凋亡均受到抑制。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-16 包含RORA 的結(jié)合序列。由此猜想miR-16 和RORA 可能存在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后的雙熒光素酶實驗顯示,miR-16 的過表達(dá)可降低WT-RORA 細(xì)胞的熒光素酶活性,證實miR-16 可靶向調(diào)控RORA。為了進(jìn)一步驗證miR-16 和RORA 的調(diào)控關(guān)系,本研究在敲低miR-16 的基礎(chǔ)上,采用小分子干擾技術(shù)下調(diào)RORA 表達(dá),結(jié)果顯示下調(diào)RORA 可部分阻斷miR-16 敲低對AMI 大鼠心肌損傷的保護(hù)作用,證實了miR-16 可靶向負(fù)調(diào)控RORA。提示,miR-16 對心肌細(xì)胞的有害作用可能是由RORA 的下調(diào)賦予的。

    miRNA 的生物學(xué)功能之一是一個miRNA 可以調(diào)節(jié)多個基因表達(dá)。除RORA外,許多凋亡相關(guān)基因已被證實是miR-16 的靶基因。例如,Cao 等[20]表明miR-16 可靶向調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酶非受體4型(PTPN4)影響缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬;在阿爾茨海默病模型中,miR-16 的高表達(dá)可直接靶向和抑制Bcl-2 誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[21]。在本研究中,我們確定了RORA 作為miR-16 的直接靶基因,未研究其他潛在靶點(diǎn),但不能排除所有已驗證的靶基因和miR-16 的其他潛在靶點(diǎn)可能參與其對心肌細(xì)胞的影響,這是本研究的局限性之一,在未來的研究中將結(jié)合體外細(xì)胞實驗對其作用機(jī)制進(jìn)行深入分析。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

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