miR-892a通過細胞外因子/β-連環(huán)蛋白信號通路調(diào)控對前列腺癌細胞增殖及凋亡的影響

伍宏亮，李文永，汪 盛，陳志軍，關(guān) 翰

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽蚌埠 233004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是一種發(fā)生于前列腺的上皮惡性腫瘤，是老年男性最常見的癌癥[1]。目前，臨床上多采用根治性前列腺切除術(shù)和放療治療前列腺癌, 約70%的患者得到治愈[2]。然而，前列腺癌晚期大多數(shù)患者發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌從而導(dǎo)致治療效果欠佳，易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，其5年生存率不足30%[3]。微小RNA （miRNA）是一類內(nèi)源性長度為20～22個核苷酸的非編碼小RNA，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達中發(fā)揮著重要作用。miR-892a作為一種重要的抑癌基因，已被證實參與了肝癌、喉癌、口腔癌的發(fā)展進程[4]。本研究旨在探討miR-892a在前列腺癌細胞系中的表達情況及其過表達對細胞生物學(xué)功能的影響和相關(guān)機制，為診治前列腺癌尋找新的生物學(xué)指標提供了理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 人正常前列腺上皮細胞系（RWPE-1）及人前列腺癌細胞系（DU145、PC3）來自中國科學(xué)院細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（FBS）、二甲亞砜（DMSO）均購自美國ThemoFisher公司。CCK-8試劑盒購自上海研生實業(yè)有限公司。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、放射免疫沉淀試驗（RIPA ）裂解液、喹啉甲酸（BCA）試劑盒和總RNA抽提試劑（TRIzol）試劑盒購自上海信裕生物科技公司。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀購自美國Bio-Rad公司、Olympus熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。miR NC及miR-892a mimic由上海生工合成本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 將對數(shù)期生長的DU145細胞接種于6孔板（5×105個/孔），培養(yǎng)24 h后, 嚴格按照Lip2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。實驗分為3組：空白對照組（BC）即BC組，轉(zhuǎn)染空載病毒陰性對照組（NC）即miR-NC組；轉(zhuǎn)染miR-892a過表達慢病毒序列為miR-892a mimic組。每組6個復(fù)孔。慢病毒載體由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建（提供慢病毒序列）。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率 將過表達miR-892a細胞接種至96孔板（1×105個/孔），參照CCK-8試劑盒說明書，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑檢測各組細胞活性，采用酶標儀（美國Bio-Rad；型號：1680）檢測450 mm波長吸光度值（OD）值表示細胞存活率。細胞存活率=[實驗孔吸光度-空白孔吸光度]/[對照孔吸光度-空白孔吸光度] ×100%。

1.4 qRT-PCR檢測 miR-892a、細胞外因子（Wnt）、β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA（信使核糖核酸）表達 收集對數(shù)期生長的DU145細胞，加入TRIzol提取總RNA。采用紫外分光光度計檢測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 °C保存?zhèn)溆?。以cDNA為模版進行qRT-PCR法擴增。反應(yīng)體系：cDNA 2.5 μL，2×SYBR mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加水至20 μL。反應(yīng)條件：95 °C 20 s，60 °C 30 s，68 °C延伸30 s，40個循環(huán)。U6作為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法計算 miR-892a、Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA 相對表達量。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組的DU145細胞，制成1×106/mL懸浮細胞。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書分別加入5 μL的Annexin V-FITC，充分混勻，再加入5 μLPI，室溫下遮光孵育20 min，置于流式細胞儀（美國BD，型號：FACS Calibur）中，并采用Cellauest軟件檢測分析各組細胞的凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.00統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（x）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-892a在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的mRNA表達，人前列腺癌細胞DU145、PC3中miR-892a的表達水平顯著低于人正常前列腺上皮細胞RWPE-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-892a在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的mRNA表達

2.2 過表達miR-892a對前列腺癌細胞增殖的影響 慢病毒轉(zhuǎn)染之后miR-892a mimic組的miR-892a表達水平顯著高于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miR-892a mimic組24、48、72 h的前列腺癌細胞增殖活力均顯著低于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 過表達miR-892a對前列腺癌細胞增殖的影響（x）

圖2 過表達miR-892a后前列腺癌細胞生長曲線

2.3 過表達miR-892a對前列腺癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率，miR-892a mimic 組的前列腺癌細胞凋亡率顯著高于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

圖3 流式細胞儀檢測過前列腺癌細胞的凋亡情況

表2 過表達miR-892a對前列腺癌細胞凋亡的影響（x）

2.4 過表達miR-892a對前列腺癌細胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5表達的影響 miR-892a mimic 組的Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA 表達水平顯著低于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖4。

圖4 過表達miR-892a后前列腺癌細胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA表達水平

表3 過表達miR-892a對前列腺癌細胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5表達的影響（x）

3 討論

miRNA的組織特異性和時序性決定了組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著多種作用[5]。既往報道證實在去勢抵抗性前列腺癌細胞中miR-616的表達顯著上升，過表達的miR-616能增強前列腺癌細胞的增殖能力，抑制細胞凋亡[6]。前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miRNA-892a在正常前列腺組織和前列腺癌患者的腫瘤組織中的表達存在明顯的差異，miR-892a在前列腺癌細胞中低表達，預(yù)示著miR-892a的表達水平可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究分析了 miR-892a 在前列腺癌細胞中的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與人正常前列腺上皮細胞RWPE-1比較，人前列腺癌細胞DU145、PC3中miR-892a的表達水平明顯較低，提示miR-892a的表達缺失與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)。進一步通過CCK-48法檢測研究前列腺癌細胞的增殖能力，結(jié)果表明，miR-892a mimic 組的前列腺癌細胞增殖活力明顯低于BC組及miR NC組。以上結(jié)果證實miR-892a能抑制前列腺癌細胞的增殖，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起到負向調(diào)控的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-892a mimic 組的前列腺癌細胞凋亡率顯著高于 BC 組及 miR-NC 組，提示miR-892a過表達可以促進前列腺癌細胞的凋亡。

Wnt蛋白是一種通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用的細胞生長信號因子，其異常表達或激活能引起腫瘤[7]。β-Catenin作為Wnt信號通路的重要調(diào)解蛋白，在Wnt信號激活的細胞中由胞漿進入胞核成為轉(zhuǎn)錄激活因子[8]。c-myc 是一種可以使細胞無限增殖、促進細胞分裂的基因[9]。于婷等[10]發(fā)現(xiàn)過表達的miR-181能抑制 Wnt/β-Catenin 信號通路從而抑制急性B淋巴細胞的增殖。同時，SOX5作為一種轉(zhuǎn)錄因子，已被證實可以結(jié)合DNA或其他蛋白調(diào)節(jié)基因的表達。研究表明，miR-132通過靶向調(diào)控SOX5在垂體腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[11]。本研究結(jié)果顯 示，miR-892a mimic 組 的Wnt、β-Catenin、c-myc及SOX5的mRNA 表 達 水 平 低 于BC組 合miR-NC，與韓兵等[12]研究結(jié)果相似，證實miR-892a過表達可以通過下調(diào)Wnt/β-Catenin信號通路及下游蛋白，使其活性受到抑制從而抑制前列腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。但本研究只初步驗證了miR-892a對前列腺癌細胞增殖、凋亡的影響，涉及的具體通路作用機制尚不明確，后續(xù)研究將繼續(xù)展開分子實驗進一步深入探究。

綜上所述，miR-892a在前列腺癌細胞中呈低表達狀態(tài)，過表達miR-892a能抑制抑制前列腺細胞的增殖、促進前列腺癌細胞的凋亡，其可能通過調(diào)控Wnt /β-Catenin信號通路而發(fā)揮作用，提示miR-892a在診治前列腺癌中具備成為生物學(xué)指標的潛力。