法西多曲對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

陳 輝，鄭 敏

(1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院)

近年來，急性心肌梗死的發(fā)病率與死亡率明顯上升，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，迅速恢復(fù)血供，即再灌注治療是挽救急性心肌梗死的根本措施。大量研究表明[1-2]，再灌注不一定會使缺血損傷的組織細(xì)胞得到恢復(fù)，在一定條件下反而造成或加重心肌細(xì)胞的損傷,即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心血管內(nèi)科疾病中常遇見心肌缺血再灌注損傷的問題，腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與心血管循環(huán)的生理病理過程，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)激活RAS，導(dǎo)致血容量增多和鈉水潴留，血管收縮[3-4]。抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)能有效預(yù)防心肌梗死造成的心肌缺血再灌注損傷[5]。目前臨床尚無特效的治療心肌缺血再灌注損傷的手段，因此，越來越多的專家學(xué)者開始致力于心肌缺血再灌注損傷治療方法的研究。法西多曲(Fasidotril)是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和肽鏈內(nèi)切酶(NEP)雙重抑制劑，通過對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制作用及減緩中性肽酶抑制劑對尿鈉肽的降解作用，從而起到擴(kuò)血管、排納利尿、抑制細(xì)胞增生、抑制交感神經(jīng)等作用。法西多曲作為一種新型抗高血壓及心力衰竭的藥物，在心血管疾病治療方面具有潛在的價(jià)值。本研究旨在探討法西多曲對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級雄性SD大鼠(40只)，體重(280±20)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心[許可證號SYXK(鄂)2015-0018]提供。AngⅡ試劑盒、ACE抗體及AT1抗體均購自北京奧森鼎信生物技術(shù)有限公司(貨號分別為：A9847、sc-23908、sc-1173)，DAB顯色劑購自武漢谷歌生物科技有限公司(貨號：G1210)；生物信號采集與分析系統(tǒng)(型號：BL-420F)；法西多曲購自重慶萊美藥業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠模型制作與分組

將40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)至(300±20)g，隨機(jī)分為4組，分別為正常組(NC)、模型組(IR)、法西多曲低劑量(2.5mg/kg)組(FAS-L)和法西多曲高劑量(25mg/kg)組(FAS-H)，每組10只。采用10 % 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)觀察并記錄大鼠心電圖。30min后再剪線灌注2h，以心電圖ST下降一半(見圖1～2)即可判斷大鼠心肌缺血再灌注損傷模型成功建立。NC組僅穿線不結(jié)扎，F(xiàn)AS組在結(jié)扎前15 min舌下靜脈注射法西多曲。

圖1 心肌缺血前心電圖

圖2 心肌缺血后心電圖

1.2.2 左心室血流動力學(xué)監(jiān)測

大鼠心肌再灌注2h后，將換能器連接上BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)，PE50導(dǎo)管插進(jìn)大鼠的右頸總動脈，導(dǎo)管進(jìn)入左心室時(shí)電腦顯示器會出現(xiàn)較多的壓力差，等待波形圖穩(wěn)定15min后，記錄各組LVSP、LVEDP和HR的值。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

頸總動脈取血離心收集上清液，缺血部位的心肌組織放入適量的PBS緩沖液中(pH7.4)，手動勻漿，離心10min(3000轉(zhuǎn)/min)，收集上清液，接著按照ELISA試劑盒的操作步驟對AngⅡ進(jìn)行含量檢測。

1.2.4 免疫組化法

取3μm石蠟組織切片脫蠟水化，用3% H2O2溶液室溫阻斷10min，滴加兔抗大鼠多克隆抗體溶液，4℃孵育過夜；滴加聚合物增強(qiáng)劑50μL，室溫靜置20min；加酶標(biāo)羊抗兔聚合物50μL，室溫孵育30min，PBS沖洗。用0.02% DAB顯色10min；PBS沖洗，5min×3次；蘇木素復(fù)染5min，自來水洗1min，梯度酒精分化并脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。每組選取5例，每例在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 法西多曲對IR大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)對各組大鼠心功能分析結(jié)果顯示，與NC組相比，IR組HR減慢(P<0.01)，F(xiàn)AS組HR顯著提高(P<0.05)；IR組LVSP、+dp/dpmax顯著降低；FAS組LVSP和+dp/dpmax較IR組顯著提高(P<0.01)。與NC組比，IR組LVEDP明顯增加(P<0.01)，-dp/dtmax顯著降低(P<0.01)，F(xiàn)AS組LVEDP低于IR組，但高于NC組，LVEDP降低效應(yīng)隨劑量增加有增強(qiáng)趨勢(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 法西多曲對大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

2.2 法西多曲對大鼠血液和心肌組織中AngⅡ的影響

采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析對大鼠血液和心肌組織中AngⅡ濃度進(jìn)行分析，總體數(shù)據(jù)組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。法西多曲能減少心肌缺血再灌注損傷大鼠血液和心肌組織中AngⅡ的表達(dá)(P均<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 不同組別大鼠血液中AngⅡ濃度的比較

2.3 心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌中AT1、ACE表達(dá)情況

在各組免疫組化染色細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中AT1、ACE在心肌細(xì)胞中都有表達(dá)，陽性細(xì)胞胞漿呈棕褐色或棕黃色者。與NC組相比，IR組中AT1免疫陽性表達(dá)顯著增加；心肌組織中出現(xiàn)大量ACE免疫強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞,表明心肌缺血再灌注引起RAS明顯激活;與IR組相比，F(xiàn)AS組心肌AT1免疫陽性表達(dá)明顯減弱與假手術(shù)組無明顯差異,ACE免疫陽性細(xì)胞數(shù)及陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱但仍有輕度表達(dá),隨藥物劑量增大心肌AT1、ACE的免疫陽性表達(dá)均進(jìn)一步減弱。詳見圖3～4。

圖3 各組大鼠心肌組織中AT1表達(dá)變化(×400)

圖4 各組大鼠心肌組織中ACE表達(dá)變化(×400)

3 討 論

急性心肌梗死作為常見的心血管疾病，起病急、病情進(jìn)展速度快,患者表現(xiàn)為胸骨后持續(xù)疼痛、心力衰竭以及心律失常等，具有較高的死亡率和致殘率，預(yù)后差。中老年人群為急性心肌梗死的高發(fā)群體，急性心肌梗死已經(jīng)成為威脅中老年人群生命安全的主要疾病。心肌再灌注損傷包括心肌功能損害和心肌組織代謝混亂，還包括心肌構(gòu)造的損壞。心肌重構(gòu)的重要介導(dǎo)因素是RAS的激活，AngⅡ作為效應(yīng)因子，其增高可導(dǎo)致心血管功能紊亂、心肌肥厚、壞死、凋亡和誘導(dǎo)心肌重構(gòu)[6]，腎素-血管緊張素的激活加劇了心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷。持續(xù)RAAS的激活心肌可增加缺血梗死范圍，又進(jìn)一步激活RASS，使病情循環(huán)加重，并且AngⅡ影響血流動力學(xué)[7]。本文通過將法西多曲低、高劑量組和心肌缺血再灌注損傷模型組進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)法西多曲能明顯減少心肌缺血再灌注損傷大鼠血液中AngⅡ的表達(dá)。

左心室舒張功能損傷比心肌缺血再灌注損傷發(fā)生早，甚至發(fā)生更嚴(yán)重的病理變化[8-9]，血流動力學(xué)是評價(jià)心臟收縮性功能的重要指標(biāo)[10]。LVSP是左心室收縮期壓力的最大值，LVEDP是左心室舒張末期的壓力，+dp/dtmax是心肌變力性干預(yù)十分敏感的指標(biāo)，-dp/dtmax增加表示左室舒張功能的改善[11]，若動脈壓降低或不變，-dp/dtmax降低則表示心室舒張功能異常。當(dāng)左心室功能下降時(shí)，LVSP降低，LVEDP上升[12-13]。張苗苗等[14]通過大鼠缺血后適應(yīng)處理減少心肌缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)大鼠缺血再灌注模型組LVSP，+dp/dtmax和-dp/dtmax均較假手術(shù)組低，而LVEDP較假手術(shù)組高。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。與NC組相比，IR組LVSP，+dp/dpmax顯著降低；FAS組LVSP和+dp/dpmax較IR組顯著提高(P<0.01)。與NC組比，IR組LVEDP明顯增加(P<0.01)，-dp/dtmax顯著降低(P<0.01)，F(xiàn)AS組LVEDP低于IR組，但高于NC組，LVEDP降低效應(yīng)隨劑量增加有增強(qiáng)趨勢(P<0.01)，可以看出心肌缺血再灌注能夠影響血流動力學(xué)。

心肌缺血再灌注時(shí)，循環(huán)及心肌局部AngⅡ、ACE和AT1水平顯著增加，AT1為 AngⅡ的受體之一，而ACE可催化產(chǎn)生AngⅡ[15-16]。AT1在IR期間表達(dá)上調(diào)，影響腎素血管緊張素系統(tǒng)，有助于抑制心肌間質(zhì)重塑，影響心功能[17-18]。有實(shí)驗(yàn)證明西地那非能夠減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心臟功能降低，提高心肌缺血再灌注模型的存活率，抑制AT1的上調(diào)，減少AngⅡ的表達(dá)[19]。依那普利在心臟驟停和復(fù)蘇時(shí)通過調(diào)控血液和心肌中的ACE/AngⅡ/AT1R的表達(dá)而改善缺血再灌注損傷[20]。在本實(shí)驗(yàn)表明法西多曲可減少血液中和心肌組織中AngⅡ表達(dá)，其中FAS-H組中AngⅡ影響較FAS-L組明顯。免疫組化染色結(jié)果顯示，陽性表達(dá)的棕褐色細(xì)胞在IR組表達(dá)顯著增加，藥物治療組細(xì)胞表達(dá)降低。與FAS-L組比較，F(xiàn)AS-H組AT1、ACE陽性表達(dá)明顯減少。心肌缺血再灌注時(shí)AngⅡ的表達(dá)增加，而在FAS組中AngⅡ明顯下降，說明法西多曲對RAS也有抑制作用。

法西多曲是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和中性內(nèi)肽酶(NEP)的抑制劑，通過RAS系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)中起重要作用，可擴(kuò)張血管，抑制NEP，改善內(nèi)皮功能等[21]。法西多曲可用于長期治療大鼠心肌梗死[22]。本研究表明法西多曲對心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，為新一代防治肌缺血再灌注損傷的藥物開發(fā)提供了方向。